黃保國 唐 榮 陳 高,4 李新輝

( 1. 西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650233；2. 云南省極小種群野生植物綜合保護(hù)重點實驗室，云南 昆明 650233；3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4. 中國科學(xué)院東亞植物多樣性與生物地理重點實驗室，云南 昆明 650204)

草酸鈣晶體廣泛存在于植物組織中，研究發(fā)現(xiàn)至少有215科植物中含有草酸鈣晶體[1]，且在植物的根、莖、葉、花、種子等都有分布[2-3]。草酸鈣晶體在植物中具有多種不同的功能，如鈣調(diào)控、解毒、離子平衡、植物的剛性支撐等[4-6]。此外，多數(shù)植物中草酸鈣晶體的存在都具有保護(hù)植物不受動物取食的功能[4]。植物組織中的草酸鈣晶體可以讓植物變的難以下咽或?qū)θ∈痴弋a(chǎn)生傷害進(jìn)而避免被大量取食，以達(dá)到保護(hù)自身的作用[2,4]。草酸鈣晶體的類型、大小、位置和數(shù)量在對防止動物取食的效果上都會有影響[7]。Ward研究發(fā)現(xiàn)脊椎動物和無脊椎草食動物都避免取食巨型彈簧草（Pancratium sickenbergeri）草酸鈣晶體含量最高的部位[8]。

天南星科植物組織中普遍存在草酸鈣晶體[3]。該科植物中的草酸鈣晶體存在于植物的各個部位，且具有非常豐富的變化[9]，Coté[10]研究了天南星科21種植物花序各部位中草酸鈣晶體的多樣性，發(fā)現(xiàn)不同部位的草酸鈣晶體含量與天南星科（Araceae）植物類群傳粉策略存在一定的因果關(guān)系。對天南星科植物中草酸鈣晶體的研究主要集中在植物的營養(yǎng)器官上，而對于繁殖器官中草酸鈣晶體的研究較少[10]。Prychid等[11]研究10種魔芋屬（Amorphophallus）植物發(fā)現(xiàn)其葉片上具有不同類型的草酸鈣晶體，Bernardino-Nicanor等[12]也發(fā)現(xiàn)草酸鈣晶體的防御功能在植物體重要部位得到加強(qiáng)的現(xiàn)象。白魔芋（Amorphophallus albus）是天南星科魔芋屬多年生草本植物[13]，是劉佩瑛等[14]于1984年發(fā)表的新種。白魔芋特有分布在金沙江干熱河谷下游區(qū)域，如云南永善，四川金陽、屏山等[15]，該物種是當(dāng)?shù)靥赜械慕?jīng)濟(jì)作物，相較于花魔芋來說，白魔芋塊莖中葡甘聚糖含量更高，品質(zhì)更好[16]。在前期對白魔芋開花過程的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，白魔芋花期花序中聚集有大量的隱翅蟲，隱翅蟲在花序中交配、取食，并產(chǎn)卵，完成對白魔芋的傳粉。花期結(jié)束后，白魔芋花序不同部分（不育區(qū)、雄蕊、附屬物）均遭到不同程度的取食，但雌蕊區(qū)卻未受到影響。為探尋導(dǎo)致白魔芋傳粉昆蟲產(chǎn)生取食偏好的原因，本研究通過分析花序各部位草酸鈣的含量差異，探討其與白魔芋花序不同部分被取食差異的潛在關(guān)系。

1 材料與方法

2018年7月，隨機(jī)選取四川省金陽縣洛解村（103°13′52.75″E，27°38′20.73″N，海拔 1 404 m）種植的白魔芋50株，統(tǒng)計其花序中隱翅蟲的數(shù)量并用游標(biāo)卡尺測量花序各部分（附屬器、雄蕊、不育區(qū)和雌蕊，圖1）被隱翅蟲取食的比例。取食比例=被取食的長度/總長度。

選擇12株2018年7月從四川省金陽縣采集的帶花序白魔芋植株，將整個花序的雌蕊區(qū)、退化雄蕊區(qū)、雄蕊區(qū)及附屬物區(qū)采用手術(shù)刀片切割成1 cm的小塊。然后用10% NaOH溶液浸泡48 h，再置于飽和的NaClO溶液中脫色48 h。脫色完成后在清水中進(jìn)行漂洗，隨后采用25%、50%、75%、100%梯度的乙醇進(jìn)行脫水，最后采用純二甲苯透明后用中性樹膠封片，自然風(fēng)干后在光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS-BX51）10倍目鏡下搭配佳能數(shù)碼相機(jī)（CANON-EOS550D）下進(jìn)行觀察和拍照。每個植株不同部分的樣品觀察至少3個視野（每個視野面積1 250 μm2），花序不同區(qū)域一共觀察累計不少于36次，統(tǒng)計樣品內(nèi)的草酸鈣針晶胞的平均數(shù)量。

采用手術(shù)刀片分別將4株白魔芋花序中4個部分切割下來，每株的不同部分分別稱取1 g鮮質(zhì)量組織，用研缽搗碎之后用60%甲醇溶液5 mL過夜提取12 h。將各部位提取物過濾，濃縮后定容到2.5 mL；然后用移液槍吸取5 μL滴于隱翅蟲頭部，記錄隱翅蟲的活躍情況；同時用甲醇溶劑作為對照記錄隱翅蟲的行為。用秒表記錄隱翅蟲的死亡時間，如果超過1 min，隱翅蟲繼續(xù)爬行，則認(rèn)為提取液不能殺死隱翅蟲（5 μL溶液1 min后通常已經(jīng)揮發(fā)完）。所用隱翅蟲為2018年7月從四川金陽縣帶回昆明植物園進(jìn)行飼養(yǎng)的成熟個體（數(shù)量大約5 000頭，為金陽縣白魔芋最主要的傳粉昆蟲）。樣品加對照共計5個處理，每個處理用20只隱翅蟲，重復(fù)3次。

上述研究中所有數(shù)據(jù)采用SAS 9.4進(jìn)行單因素方差分析并進(jìn)行LSD多重比較，同時采用Origin 8.0對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白魔芋花序各部位草酸鈣晶體的含量及分布

白魔芋花序各部位草酸鈣晶體的含量見表1。由表1可知，雌蕊子房中所含草酸鈣晶體的數(shù)量最多，平均每個視野約為188.4個，LSD多重比較的結(jié)果表明其含量顯著高于其他3個部位中草酸鈣晶體的含量，見圖1；其次含量高的部位是雄蕊區(qū)，平均含37.6個草酸鈣晶體。而佛焰苞苞片和附屬器中的草酸鈣晶體的平均含量分別為25.3個和29.7個，多重比較分析表明雄蕊區(qū)、佛焰苞苞片與附屬器三者之間的草酸鈣晶體含量并無顯著差異；花序各部位中草酸鈣含量最低是不育區(qū)，平均僅11.8個，與雌雄蕊區(qū)均存在顯著性差異。草酸鈣晶體的形狀主要有2種，存在一定的大小差異，長針晶80～120 μm，短簇晶胞針晶長度 30～50 μm（圖1）。

表1 白魔芋花序各部分草酸鈣晶體的含量Table 1 The content of calcium oxalate crystals in different sections of A. albus inflorescence 個/視野

圖1 草酸鈣在白魔芋花序不同部位的分布情況Fig. 1 Distribution of calcium oxalate crystals in different sections of A. albus inflorescence

圖1 白魔芋花序中草酸鈣晶體的分布情況Fig. 2 Distribution of calcium oxalate crystals in A. albus inflorescence

2.2 白魔芋花序中隱翅蟲的數(shù)量及取食比例

本研究統(tǒng)計白魔芋花序中隱翅蟲的數(shù)量顯示，花序中隱翅蟲的平均數(shù)量為293只（n=50），其中最多可達(dá)1 300余只，隱翅蟲數(shù)量在白魔芋花序中的分布情況見圖3。由圖3可知，花序中隱翅蟲的數(shù)量通常為100～700只，數(shù)量在100只以下或700只以上的植株相對較少。花序中不同部位被隱翅蟲取食的比例見圖4。由圖4可知，隱翅蟲主要取食部位是不育區(qū)，取食比例達(dá)到100%；其次是附屬器（70%±30%，n=37），雄蕊區(qū)取食較少（23%±22%，n=37）而雌蕊區(qū)完全未被取食。多重分析結(jié)果表明4個部位被取食的比例均存在顯著性的差異（P＜0.05）。

圖3 白魔芋花序中隱翅蟲數(shù)量的分布情況Fig. 3 Distribution of the amount of rove beetles in the inflorescence of A. albus

圖4 白魔芋花序被隱翅蟲取食的不同比例Fig. 4 Different proportion of the inflorescences of A. albus consumed by rove beetles

2.3 花序各部位甲醇提取物毒殺隱翅蟲的效果

采用白魔芋花序4個部分60%濃度的甲醇提取物觸殺白魔芋有效傳粉者隱翅蟲的結(jié)果見表2。由表2可知，附屬器、雄蕊區(qū)、不育區(qū)及對照4個處理1分鐘內(nèi)均不能殺死隱翅蟲，而雌蕊區(qū)的甲醇提取物對隱翅蟲具有明顯的毒殺效果，隱翅蟲平均在14.5 s的時間范圍內(nèi)死亡。

表2 花序各部位甲醇提取物毒殺隱翅蟲的效果比較Table 2 Comparison of kill ability of methanol extracts from different sections of A. albus inflorescence to rove beetles

3 結(jié)論與討論

天南星科植物與其傳粉者之間通常存在著互惠互利的作用關(guān)系，天南星科通過提供熱量、食物或者產(chǎn)卵地吸引傳粉昆蟲訪花并達(dá)到為其傳粉的目的[17]。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)白魔芋在其盛花期時，花序中存在著大量的隱翅蟲，隱翅蟲在花序中主要行為是取食。統(tǒng)計隱翅蟲對白魔芋花序不同部位的取食結(jié)果表明，隱翅蟲主要取食的部位是不育區(qū)，取食比例通常達(dá)到100%，其次是附屬器，當(dāng)花序中隱翅蟲數(shù)量過多而不育區(qū)作為食物不足時，隱翅蟲會轉(zhuǎn)而取食附屬器（70%±30%，n=37）和一部分雄蕊區(qū)（23%±22%，n=37），但完全不會取食雌蕊區(qū)，這種情況在天南星科其他植物中也同樣存在[18]。

本研究通過比較白魔芋花序不同部位中草酸鈣晶體含量的差異發(fā)現(xiàn)，其雌蕊區(qū)草酸鈣含量最高（188.4），而雄蕊區(qū)中草酸鈣晶體的含量顯著少于雌蕊。但雄蕊區(qū)草酸鈣含量和附屬器及佛焰苞苞片中的含量并無顯著差異?？紤]到白魔芋花序中雌蕊數(shù)量較少，通常為20～60個，而雄蕊數(shù)量在200個以上，花粉數(shù)量更是多達(dá)幾十萬個[15]，推測是否是過多的花粉也是傳粉隱翅蟲的傳粉回報，因此沒有太強(qiáng)的防御物質(zhì)。畢竟傳粉昆蟲取食花粉并不會像取食胚珠那樣對植物的繁殖產(chǎn)生明顯影響。此外，投資是需要代價的，植物只需要在最需要保護(hù)的部位投資最多的防御物質(zhì)，就能保護(hù)植物正常的繁殖過程。就整個花序而言，各個部分均含有草酸鈣晶體，其中佛焰苞苞片可以保護(hù)花序展開前不受昆蟲的干擾、雄蕊中的草酸鈣晶體可以在其散粉前避免被取食掉所有花粉、附屬器是天南星科植物特有的結(jié)構(gòu)，也需要受到一定的保護(hù)作用（通常在傳粉過程中扮演著氣味散發(fā)和溫度升高的作用[19]）?；ㄐ蛑胁菟徕}晶體含量最少的部位是不育區(qū)（退化雄蕊），該部位通常是天南星科植物提供給傳粉昆蟲的食物報酬，因此保護(hù)需求最低。植物由于附著生長不能運動，而只能通過物理防御或化學(xué)防御以防止被昆蟲取食，在化學(xué)防御中草酸鈣晶體通常扮演著重要的作用。Coté[10]研究21種天南星科植物也發(fā)現(xiàn)在重要的胚珠和花粉部分都有高含量的草酸鈣晶體以保護(hù)該部位避免被昆蟲取食，而退化雄蕊在不同種之間草酸鈣晶體含量差異較大，其作用尚不明確。天南星科植物草酸鈣在花序不同部位的結(jié)構(gòu)組成變化及其不均勻分布的防御功能值得開展進(jìn)一步的研究。

此外，為了驗證花器官中甲醇提取物對隱刺蟲的毒殺作用，采用花序各部位的甲醇提取物直接接觸性毒殺白魔芋的傳粉昆蟲（隱翅蟲），結(jié)果發(fā)現(xiàn)草酸鈣晶體含量最高的雌蕊提取物能快速殺死隱翅蟲。表明草酸鈣晶體單獨或與其他防御成分一起對隱翅蟲具有較強(qiáng)的毒性。以前的研究發(fā)現(xiàn)草酸鈣晶體的形態(tài)特征可以起到防御作用。如Tragia ramosa表明覆蓋由伸長的刺細(xì)胞構(gòu)成的蟄毛，細(xì)胞內(nèi)含有大量草酸鈣針狀晶體，晶體側(cè)緣形成溝槽。一旦動物碰到蟄毛會導(dǎo)致細(xì)胞破裂，針狀晶體會刺破動物的真皮，而毒素沿著晶體表面的溝槽流到傷口會引起皮膚的刺痛感[6]。而Riuz等[20]對百合科植物葉片中草酸鈣含量與動物的攝食量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)較高的晶體含量與攝食減少之間存在明顯相關(guān)性。上述研究均揭示草酸鈣晶體的防御功能。

在植物的防御選擇中，草酸鈣晶體的防御過程是普遍的進(jìn)化策略。一方面，草酸鈣晶體可以通過本身的形態(tài)特征和數(shù)量來對取食的動物造成物理傷害；另一方面，在晶體周圍還存在毒性蛋白[21]或者其他毒素物質(zhì)[22]，對草食動物、嚙齒類動物、真菌和昆蟲也能起到防御作用[23]。本研究通過比較白魔芋花序不同部位草酸鈣晶體的含量揭示了植物可能夠通過草酸鈣晶體的含量差異來選擇性地保護(hù)其繁殖器官。