新疆寄生性雜草菟絲子主要種類鑒定

房小燕，姚兆群，陳美秀，曹小蕾，趙思峰

(新疆綠洲農業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點實驗室/石河子大學農學院，新疆 石河子 832003)

菟絲子是旋花科(Convolvulaceae)菟絲子屬(Cuscuta)植物的總稱，是一年生寄生纏繞草本植物，其無根、無葉或葉片退化為小的鱗片，沒有葉綠素，通過吸器從寄主莖上吸收生長所需的水分和養(yǎng)分。除了在高緯度高海拔地區(qū)難以存活外，菟絲子在美洲、非洲、地中海地區(qū)、東南亞、太平洋諸島等熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛分布，菟絲子屬有200多個種，其中Cuscutacampestris、Cuscutareflexa、Cuscutamonogyna等幾個種給農作物、果樹、花卉等造成的損失較為嚴重[1-2]。據《中國植物志》[3]報道，我國南北方均有菟絲子分布，在我國分布的有8種，另有3種僅有記載，沒有標本。新疆是報道菟絲子種類最多的一個區(qū)域，已報道的種類達到8種以上[4-5]，這些報道的鑒定依據完全依賴于其纏繞的寄主和莖、花、碩果、種子等形態(tài)學特征，因寄主及生長環(huán)境的不同，菟絲子形態(tài)學特征變化較大，僅依靠形態(tài)學特征并不能得出準確的鑒定結果[6]。目前，菟絲子的鑒定方法有常規(guī)的形態(tài)學特征鑒定、化學分類標記法、色譜法、細胞學鑒定等[7]。隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，現代分子生物學手段應用于植物系統(tǒng)分類與品種鑒定的研究也越來越多，已有許多研究者[8-11]基于ITS、rps2、rbcL、trnL-F序列分析來鑒定區(qū)分菟絲子種類。菟絲子近幾年在新疆的傳播速度非?？?，造成的危害也日益嚴重，給甜菜、制干辣椒、甜葉菊、綠化林木、花卉均已造成嚴重影響。因菟絲子屬所有種類都是我國進境檢疫對象[12]，新疆已報道的菟絲子種類在全國最多，對農產品調運帶來較大麻煩，盡快明確新疆地區(qū)菟絲子的種類和分布有助于為檢疫部門提供參考依據。本研究從南北疆的農田、綠化林帶、荒漠等區(qū)域采集不同寄主上的菟絲子的莖、花和種子，對其采用形態(tài)特征及ITS、rbcL、trnL-F序列分析將其鑒定到種，明確新疆菟絲子的種類，從而為檢疫部門確定檢疫對象和科學防除方案提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

從2017年7—10月份分別從巴音郭楞蒙古自治州、昌吉回族自治州、塔城地區(qū)、阿勒泰地區(qū)、石河子市周邊農作物、田間雜草、綠化林木、果樹、花卉等25種不同寄主上采集菟絲子的莖、花和種子，裝入樣品袋中帶回實驗室進行鑒定，樣品具體信息見表2。

1.2 鑒定方法

1.2.1 形態(tài)學鑒定

將采集來60份菟絲子樣品直接目測并置于體式顯微鏡下，觀察莖的顏色和粗細，花的花序類型、花萼、花冠、雌蕊、雄蕊，種子的形狀、種皮顏色、質感、種臍形狀、暈輪形狀等形態(tài)學特征進行鑒定[11,13-17]。

1.2.2 分子生物學鑒定

(1)菟絲子樣品DNA的提取。從60份菟絲子種子樣品中各取20粒，用75%乙醇處理30 s，10%次氯酸鈉處理5 min，蒸餾水沖洗3次。采用改進的CTAB法提取樣品植物的DNA[18]。

(2)ITS、rbcL、trnL-F序列的PCR擴增。PCR反應體系：2×PCR TaqMix (北京全式金生物)12.5 μL、10 μmol/L 上下游引物各1 μL(表1)、基因組DNA 0.5 μL、ddH2O 10 μL至終體積為25 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s (引物ITS5和ITS4；引物C和F)/55 ℃退火30 s (引物rbcL-f和rbcL-r)，72 ℃延伸40 s，30次循環(huán)；最后72 ℃延伸 10 min。反應完成后，在1.2%～1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應產物。

表1 PCR引物詳細信息Tab.1 PCR primer information

(3)ITS、rbcL、trnL-F序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建。將不同引物的PCR反應產物委托北京六合華大基因公司進行測序。利用NCBI中BLAST和Clustal W軟件進行同源性比較。選取不同地區(qū)不同寄主的菟絲子樣品25份，將測定獲得的ITS、rbcL、trnL-F序列在GenBank中用BLASTn程序分別下載同源序列。使用MEGA 6軟件，對序列進行比對(alignment)，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉(bootstrap)對系統(tǒng)發(fā)育樹進行檢驗，1000次重復。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學鑒定結果

通過形態(tài)學初步觀察，采集到的60份菟絲子樣品依據莖的顏色、粗細，花的顏色和大小，以及種子的顏色和大小等各類特征，將其大致先分為2類：序號1—23的菟絲子樣品的莖藤顏色大體為淡黃色至橘黃色，莖細絲狀，直徑為0.2～0.6 mm(圖1 A)；序號24—60的菟絲子，莖藤顏色大體為微紅色并有紫色瘤狀突起，莖較粗，直徑為1.2～2.8 mm(圖1B)。

A—田野菟絲子；B—單柱菟絲子。圖1 菟絲子莖形態(tài)特征Fig.1 stem morphologic characteristic of Cuscuta

序號1—23的菟絲子蒴果扁球形，不開裂。種子卵圓形，紅褐色至黃褐色，較小，長1.1～1.9 mm，寬0.8～1.1 mm，背面圓拱(圖2A)。種臍較短，橢圓形(圖3A)；序號24—60的菟絲子蒴果卵圓形或球形，周裂。種子橢圓形，灰白色至棕褐色，較大，長2.6～3.4 mm，寬2.0～2.7 mm。背面平或微凹(圖2B)。種臍較長，線形(圖3B)。

序號1—23的菟絲子的花白色，花長2～4 mm，具腺體，有花梗，聚集成頭狀的團傘花序?；ㄝ喟鼗ü谕?，花萼5片，裂片卵形或近圓形，或寬大于長?；ü诹哑瑢捜菭?，銳尖。雄蕊短于裂片，花藥橢圓形，花絲比花藥長或與之等長。鱗片卵形，邊緣流蘇狀。子房球形。通?；ㄖ?，纖細，約等長于子房，柱頭頭狀(圖4 A)；序號24—60的菟絲子的花玫紅色或幾白色，花長3～4.5 mm，花無?；蚓叨坦＃ㄐ蛩缮⑺霠罨蛩霠顖A錐花序?；ㄝ喟鼗ü谕玻ㄝ?片，裂片近半圓形，重迭，有紫色龍骨狀突起。

A—田野菟絲子；B—單柱菟絲子。圖2 菟絲子種子形態(tài)特征Fig.2 Seeds morphologic characteristic of Cuscuta

花冠裂片卵圓形，頂端鈍，裂片裂至圓筒的一半。鱗片齒狀，基部相連，并貼生在花冠上，頂端平截?；ㄋ師o柄，著生在花冠的喉部。子房球形?；ㄖ?，短，近與柱頭直徑等長，柱頭頭狀，中央有淺裂縫(圖4B)。

A—田野菟絲子；B—單柱菟絲子。圖3 菟絲子種子種臍形態(tài)特征Fig.3 Umbilici morphologic characteristic of Cuscuta

根據以上幾個形態(tài)特征將序號1—23菟絲子樣品鑒定為田野菟絲子，序號24—60樣品鑒定為單柱菟絲子。

2.2 分子鑒定結果

經ITS、rbcL、trnl-F 3個序列擴增后測序結果顯示于下表2中，采集到的菟絲子樣品序號1—23經過比對發(fā)現其ITS、rbcL、trnl-F序列均與GenBank數據庫內已登錄的田野菟絲子的相應序列同源性高達99%，序號24—60與經過比對發(fā)現其ITS、rbcL、trnl-F序列均與GenBank數據庫內已登錄的單柱菟絲子的相應序列同源性高達99%，測序后將測序結果提交到GenBank，獲得ITS序列登錄號為MH 392340—392399，trnL-F序列登錄號為MH 392400—392459，rbcL序列已提交，還未獲得登錄號。

用MEGA 6軟件對所選取的25個菟絲子樣品的ITS，rbcL和trnL-F序列分別與從GenBank數據庫中下載的同源序列進行比對并構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5、圖6、圖7)。結果顯示，ITS序列、rbcL序列、trnL-F序列測定產物2、4、5、6、8、9、10、13、15、16、17、18、19、21、23分別與已登錄的相對應的序列C.campestris(KT 430863)、C.campestris(EU 330268)、C.campestris(KU 761502)序列相似率達99%；11、20、28、30、33、42、47、50、52、59與已登錄的相對應的序列C.monogyna(AY 554405)、C.monogyna(KJ 436686)、C.monogyna(KX 168400)序列相似率達99%；ITS，rbcL和trnL-F序列分析結果表明，序號1—23為C.campestris，24—60為C.monogyna，所以本研究采集到的菟絲子樣品經分子鑒定主要分為田野菟絲子和單柱菟絲子2種，與形態(tài)鑒定結果一致。

圖5 基于ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on alignment of ITS sequences data of Cuscuta samples

圖6 基于rbcL序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on alignment of rbcL sequences data of Cuscuta samples

圖7 基于trnL-F序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree based on alignment of trnL-F sequences data of Cuscuta samples

序號編號寄主采集地點采集日期分子鑒定ITSrbcLtrnL種名1K1鈴鐺刺庫爾勒22團3連2017-8-14田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris2K2加工番茄庫爾勒22團3連2017-8-14田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris3K3甜菜庫爾勒22團15連2017-8-14田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris4K4辣椒庫爾勒21團8連2017-8-15田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris5K5甜葉菊庫爾勒21團良繁連2017-8-15田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris6K6甜菜庫爾勒25團2連2017-8-16田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris7K7加工番茄庫爾勒25團農技推廣站2017-8-16田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris8K8拉拉藤庫爾勒市市區(qū)2017-8-16田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris9K9矮牽牛喀納斯景區(qū)2017-8-16田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris10H1粉苞苣哈密市伊吾縣2017-8-17田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris11J1苦豆子第六師軍戶農場2017-8-17單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna12T1蒼耳塔城163團4連2017-8-24田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris13T2蔥塔城163團4連2017-8-24田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris

表2續(xù)

序號編號寄主采集地點采集日期分子鑒定ITSrbcLtrnL種名14T3甜菜塔城163團4連2017-8-24田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris15T4田旋花塔城163團4連2017-8-24田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris16T5荊芥塔城163團4連2017-8-24田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris17T6小蓬草塔城163團4連2017-8-24田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris18T7苜蓿塔城168團4連2017-8-25田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris19T8蒼耳塔城市阿西爾鄉(xiāng)2017-8-25田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris20T9榆樹塔城阿西爾鄉(xiāng)2017-8-25單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna21A1小茴香阿勒泰188團9連2017-8-26田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris22E1榆樹額敏縣霍吉爾特鄉(xiāng)2017-8-26單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna23E2蒼耳額敏縣霍吉爾特鄉(xiāng)2017-8-26田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris24SHZ1苦豆子石河子市火車站2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna25SHZ2榆樹石河子市火車站2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna26SHZ3白蒿石河子市火車站2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna27SHZ4蕓香石河子市火車站2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna28SHZ5天仙子石河子市火車站2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna29SHZ6苦豆子石河子市農墾科學院內2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna30SHZ7鈴鐺刺石河子市農墾科學院內2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna31SHZ8榆樹石河子市農墾科學院內2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna32SHZ9蒼耳石河子市農墾科學院內2017-10-15田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.monogyna33SHZ10蘆葦石河子農墾科學院內2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna34SHZ11榆樹石河子市農墾科學院內2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna35SHZ12鈴鐺刺石河子市軍墾第一連2017-10-15田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris36SHZ13蘋果樹石河子市軍墾第一連2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna37SHZ14苦豆子石河子市軍墾第一連2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna38SHZ15小蓬草石河子市軍墾第一連2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna39SHZ16榆樹石河子市143團2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna40SW1榆樹沙灣西樹窩子村2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna41SW2苦豆子沙灣縣西樹窩子村2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna42SW3白蒿沙灣縣西樹窩子村2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna43H1榆樹呼圖壁縣大豐鎮(zhèn)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna44H2苦豆子呼圖壁縣大豐鎮(zhèn)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna45H3榆樹呼圖壁縣五工臺鎮(zhèn)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna46H4苦豆子呼圖壁縣五工臺鎮(zhèn)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna47H5小蘋果樹呼圖壁縣五工臺鎮(zhèn)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna48H6榆樹呼圖壁縣縣城2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna49M1榆樹瑪納斯縣平原林場2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子(99%)單柱菟絲子C.monogyna50M2楊樹瑪納斯縣平原林場2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna51M3苦豆子瑪納斯縣平原林場2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna52M4梧桐樹瑪納斯縣平原林場2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子(99%)單柱菟絲子C.monogyna53M5榆樹瑪納斯縣蘭州灣鄉(xiāng)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna54M6苦豆子瑪納斯縣蘭州灣鄉(xiāng)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子(99%)單柱菟絲子C.monogyna55M7天仙子瑪納斯縣蘭州灣鄉(xiāng)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna56M8苦豆子瑪納斯廣東地鄉(xiāng)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna57M9榆樹瑪納斯縣廣東地鄉(xiāng)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna58M10白蒿瑪納斯縣廣東地鄉(xiāng)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna59M11枸杞瑪納斯縣廣東地鄉(xiāng)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna60M12榆樹瑪納斯縣包家店鎮(zhèn)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna

3 討論

菟絲子是世界性的雜草檢疫對象，多數種類對其寄主都會造成一定程度的損害，近年來引起許多研究者的關注。據報道[1,3]，全世界分布的菟絲子屬超過200種，我國大約有10種以上。目前報道記錄的新疆地區(qū)菟絲子的種類是最多的，并且分布最廣，危害最嚴重，其中陰知勤等[5]報道了新疆存在11種菟絲子，并描述了10種菟絲子的形態(tài)學特征、寄主及分布地區(qū)；馬德英等[4,19]報道了新疆伊犁地區(qū)有4種菟絲子，并對新疆農田的8種菟絲子的種子外部形態(tài)特征和種胚形態(tài)進行了研究；嚴麗等[20]調查發(fā)現阿勒泰地區(qū)有3種菟絲子。以上文獻報道調查的菟絲子種類都是基于菟絲子的莖、花和種子的形態(tài)特征進行區(qū)分，而研究發(fā)現同種菟絲子的莖的顏色、粗細，花的大小、顏色和種子形態(tài)特征確實存在明顯差異[10]，并且對于新疆菟絲子種類調查不夠全面、鑒定方法單一，存在極高的不準確率，所以菟絲子單一的形態(tài)學鑒定不能夠完全準確的判定菟絲子的種類，需要加以分子輔助鑒定來進一步明確。艾尼古麗等[11]通過形態(tài)學特征和分子輔助鑒定相結合鑒定新疆石河子地區(qū)僅有田野菟絲子和單柱菟絲子2種。

本研究采集了來自新疆不同地區(qū)的25種寄主上的60份菟絲子樣品，采用形態(tài)學特征和分子輔助鑒定相結合的方式，最終確定新疆地區(qū)的菟絲子主要是單柱菟絲子C.monogyna和田野菟絲子C.campestris2種，這與陰知勤等[5]報道的新疆存在11種菟絲子的結果有很大的差異，但本次研究所采集的菟絲子樣品數量有限，要更加準確地確定新疆地區(qū)菟絲子種類還需要進一步擴大采樣范圍，增加采樣數量。

4 結論

本研究在新疆南北疆各地菟絲子發(fā)生嚴重區(qū)域采集菟絲子樣品60份，采用形態(tài)學鑒定和分子輔助鑒定相結合的方法，對60份菟絲子樣品進行鑒定，明確新疆菟絲子主要是2種，即單柱菟絲子C.monogyna和田野菟絲子C.campestris。采集的60份菟絲子樣品的寄主植物有25種，包括20種草本植物和5種木本植物。調查采樣時發(fā)現單柱菟絲子多寄生木本植物，也可寄生草本植物；田野菟絲子僅發(fā)現在草本植物上有寄生。