姚洋，尤雙，劉芝瑾，張翔宇，侯曉旭，郭濤，倪偉，胡圣偉

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003)

家兔具有繁殖周期短、易進(jìn)行超數(shù)排卵、與人類生理結(jié)構(gòu)相似等特點(diǎn)。目前，轉(zhuǎn)基因家兔已經(jīng)廣泛用于人類疾病模型的研究[1]，包括脂類代謝和動(dòng)脈硬化，以及眼科和整形外科等幾個(gè)領(lǐng)域[2]。轉(zhuǎn)基因家兔也被用于生產(chǎn)稀有藥用蛋白[3]，相關(guān)藥物已經(jīng)在美國(guó)和歐盟批準(zhǔn)上市。但是，目前轉(zhuǎn)基因家兔的外源基因都為隨機(jī)整合，導(dǎo)致外源基因表達(dá)存在不穩(wěn)定和表達(dá)量低等問題，這在一定程度上限制了轉(zhuǎn)基因家兔在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，研究家兔外源基因定點(diǎn)整合技術(shù)及友好位點(diǎn)，對(duì)定點(diǎn)整合轉(zhuǎn)基因兔的制備具有重要意義。

使用工程化核酸酶的靶向基因組編輯已經(jīng)成為多數(shù)生物學(xué)研究使用的主流方法[4]。目前已用于基因功能的研究，提供用于生物和醫(yī)學(xué)研究的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型并改善畜牧業(yè)中動(dòng)物的特定性狀。定期間隔短回文重復(fù)序列(CRISPRs)和Cas蛋白是跨細(xì)菌和古細(xì)菌的廣泛系統(tǒng)，其導(dǎo)致對(duì)外來核酸的干擾[5]。該系統(tǒng)由20nt的指導(dǎo)序列(sgRNA)和Cas9核酸酶組成，利用非同源末端連接(NHEJ)來誘導(dǎo)靶標(biāo)突變。將sgRNA和Cas9 mRNA同時(shí)注射受精卵[6]，已成為基因靶向動(dòng)物模型的重要工具。

傳統(tǒng)上，通過將基因序列或轉(zhuǎn)基因以隨機(jī)方式整合到基因組中來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中轉(zhuǎn)基因可以插入基因組中的任何位置[7]。轉(zhuǎn)基因的隨機(jī)整合經(jīng)常導(dǎo)致不穩(wěn)定的表型，基因沉默和不可預(yù)測(cè)的基因表達(dá)，并且在一些情況下，該過程是誘變的。對(duì)于位點(diǎn)特異性基因插入，過去使用同源重組(HR)和體細(xì)胞核移植(SCNT)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[8]。

由于HR效率低，費(fèi)力且耗時(shí)，這種方法效率低，所以急需一種高效的方法解決這種問題，基因定點(diǎn)整合技術(shù)利用同源重組和基因編輯為解決這種問題提供了優(yōu)良的方法。2014年，賴良學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)成功獲得了世界上首個(gè)Rosa26定點(diǎn)基因敲入豬的模型。2015年，Zambrowicz等人結(jié)合同源重組和基因編輯技術(shù)，得到了基因敲入兔[9]。

友好位點(diǎn)是表達(dá)比較活躍的靶位點(diǎn)，其具有高整合效率，穩(wěn)定表達(dá)和高插入基因表達(dá)的優(yōu)勢(shì)。Hipp11(H11)位點(diǎn)由HIPPENMEYER[10]最早發(fā)現(xiàn)，隨后在基因敲入小鼠[11]和人類干細(xì)胞[12]中進(jìn)行了驗(yàn)證。在小鼠基因組中，H11位點(diǎn)處于Eif4enif1和Drg1基因中間。然而在兔子中H11位點(diǎn)開發(fā)卻沒有報(bào)道。本研究通過比對(duì)小鼠H11位點(diǎn)，在家兔基因組中開發(fā)出兔的相應(yīng)H11位點(diǎn)。并且利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)基因定點(diǎn)整合方法將GFP基因整合到家兔H11位點(diǎn)上。

通過對(duì)CRISPR / Cas9系統(tǒng)在兔中的定點(diǎn)整合進(jìn)行鑒定，可以很好的解決隨機(jī)整合帶來的外源基因表達(dá)的不均一等問題，使插入的外源基因能夠高效率的表達(dá)；同時(shí)，使外源基因定點(diǎn)整合的效率極大的提高，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因兔的成本大大降低，這為未來制備轉(zhuǎn)基因兔搭建了一個(gè)安全、高效的平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Trizol試劑、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液均購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾科技公司；DL10000DNA marker、DL2000DNA marker、DL1000DNA marker(寶生物工程公司)；限制性內(nèi)切酶BglⅡ、AseI、NheI、AflⅡ和BbsⅠ，Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver．5．0購(gòu)于北京Takara公司；胰蛋白酶、氯化鈉、酵母提取物、瓊脂粉，瓊脂糖均購(gòu)自索萊寶公司。

Lonza4D-Nucleofector電轉(zhuǎn)儀(Lonza，公司，德國(guó))、冰箱(海爾，中國(guó))，低溫離心機(jī)、倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)(Nikon，德國(guó))、移液器(Eppendorf 公司，德國(guó))，超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國(guó))，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，瓊脂糖凝膠核酸電泳儀(北京六一生物科技有限公司，中國(guó))；超低溫冰箱(三洋公司，日本)，生化培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，中國(guó))，恒溫水浴鍋(上海精密儀器儀表有限公司，中國(guó))，生物安全柜(BAKER公司，美國(guó))，立式壓力蒸汽高壓滅菌器(上海博訊公司，中國(guó))，凝膠成像系統(tǒng)(伯樂公司，美國(guó))。

1.2 序列比對(duì)

以EIF4ENIF1或Drg1基因?yàn)闃?biāo)識(shí)，在NCBI 網(wǎng)站查找小鼠、人和豬的 H11 位點(diǎn)及其周邊序列，并預(yù)測(cè)兔的 H11 位點(diǎn)的位置和周邊序列，與豬的序列利用 DNAMAN進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3 CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建

利用CRISPR/Cas9在線設(shè)計(jì)工具(http://tools.genomeenging.org)根據(jù)預(yù)測(cè)的H11位點(diǎn)和周邊序列，以DNA正義鏈(反義鏈)的序列GGN18NGG(GGN17NGG)為靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩條sgRNA，引物見表1。取100 μmol/L的sgRNA上游和下游引物各10ul，放置于95 ℃水浴5 min后，關(guān)閉水浴鍋，在水浴中冷卻至室溫，退火，獲得帶有粘性末端的雙鏈CRISPR/Cas9。

同時(shí)利用BbsⅠ線性化 PX330載體。線性化的 PX330載體經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，膠回收后，線性化的PX330載體和退火的sgRNA用T4連接酶連接過夜，經(jīng)轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆送睿博興科公司測(cè)序。

表1 sgRNA序列設(shè)計(jì)Tab.1 SgRNA sequence design

1.4 同源打靶載體的構(gòu)建

pIRES2-ZsGreen1-Puro(本文縮寫為pIRZP)載體已由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。試驗(yàn)依據(jù)兔H11位點(diǎn)兩側(cè)的左右同源臂序列(圖1)分別設(shè)計(jì)合成左右同源臂的引物，在H11位點(diǎn)左右同源臂引物的5′端分別添加AseI(ATTAAT)和AflⅡ(TTAAG)酶切位點(diǎn)。利用H11-3′Arm-F和H11-3′Arm-R引物通過PCR擴(kuò)增、酶切、連接，將右同源臂克隆至pIRZP載體中，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，得到pIRZP-H11-3′Arm載體。PCR反應(yīng)體系如下：上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2 × Es Taq Master Mix25 μL，家兔基因組2 μL模板，ddH2O 21 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，50 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃，5 min；4 ℃保存。

用上述PCR的方法利用H11-5′Arm-R和H11-5′Arm-F引物將H11位點(diǎn)左同源臂克隆至pIRZP-H11-3′Arm載體上，送睿博興科公司公司測(cè)序，引物見表2。

1.5 嘌呤霉素篩選兔胚胎成纖維細(xì)胞濃度確定

我們將接種于12孔板的兔胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，換用不同濃度的嘌呤霉素細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)[13]。每孔做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，隔 1 d 觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

至3 d 后，取細(xì)胞全部死亡的板孔所對(duì)應(yīng)的最小濃度作為最佳篩選濃度。

1.6 電轉(zhuǎn)染

待6孔板4個(gè)孔中的細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%后，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)。

按照 Lonza Nucleofector的操作說明，各取2×105～1×106個(gè)細(xì)胞，分別添加如表3的體系之后和 100 μL電轉(zhuǎn)液混合。選擇EH-100程序進(jìn)行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)結(jié)束，快速取出電轉(zhuǎn)杯并靜置10 min。把電轉(zhuǎn)的細(xì)胞轉(zhuǎn)入至溫育的含有15% FBS培養(yǎng)基的6孔板中，并于37 ℃，5.0%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5～6 h后換液。轉(zhuǎn)染24 h后，換最佳篩選濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選。間隔2～3 d，換一次嘌呤霉素培養(yǎng)液，直至長(zhǎng)出大而漂亮的克隆島。

表3 電轉(zhuǎn)體系Tab.3 Electric transfer system

1.7 打靶細(xì)胞的檢測(cè)

我們將敲除載體與同源打靶載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，利用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver． 5． 0(Takara)提取2種細(xì)胞的基因組DNA，之后通過PCR技術(shù)檢測(cè)打靶細(xì)胞的GFP基因和Puro基因，PCR反應(yīng)體系如下：上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，2 × Es Taq Master Mix10 μL，細(xì)胞基因組1 μL模板，ddH2O 8 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，57 ℃，30 s，72 ℃，40 s，共 35 個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃，5 min；4 ℃保存。與此同時(shí)用5’arm-cmv-F、5′arm-cmv-R和GFP-3′arm-F1、GFP-3’arm-R1引物對(duì)打靶細(xì)胞DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬與小鼠與人的 H11 位點(diǎn)周圍環(huán)境序列比對(duì)

將豬與小鼠和人的 H11 位點(diǎn)序列進(jìn)行比對(duì)，從比對(duì)結(jié)果中看出人、小鼠與豬中Eif4enif1基因和Drg1 基因距離相近且相鄰(圖2)。并且H11 位點(diǎn)都處于Eif4enif1和Drg1之中，所以我們預(yù)測(cè)家兔的H11位點(diǎn)也處于Eif4enif1和Drg1之間，隨后從Genebank 調(diào)出Eif4enif1 和Drg1之間的序列，運(yùn)用DNAMAN軟件對(duì)其進(jìn)行序列的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)人，小鼠和家兔之間的同源性約為 49.67%(圖3)，紅色方框標(biāo)記H11位點(diǎn)的區(qū)域。

A—小鼠；B—人；C—豬；D—兔圖2 H11位點(diǎn)在小鼠、人、豬和兔中的位置Fig.2 Mapping of H11 locus in mice,human,pig and rabbit

圖3 小鼠、人、和兔子的H11序列比對(duì)Fig.3 Alignment of H11 locus between mice,human and rabbit

2.2 CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建

PX330載體經(jīng)BbsⅠ酶切后，結(jié)果顯示與對(duì)照相比酶切完全，條帶單一(圖4)。構(gòu)建的CRISPR/Cas9敲除載體經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果如圖所示sgRNA成功連入PX330載體中(圖5)，H11-g RNA1和H11-g RNA2敲除載體構(gòu)建成功。為了檢測(cè)構(gòu)建的CRISPR/Cas9敲除載體是否有活性，將上述H11-g RNA1和H11-g RNA2載體轉(zhuǎn)染兔胚胎成纖維細(xì)胞。3 d后收集細(xì)胞并提取細(xì)胞基因組，經(jīng)T7E1酶切，結(jié)果如圖6顯示H11-g RNA1和H11-g RNA2敲除載體具有生物學(xué)活性且效率有2%～10%。

對(duì)照：PX330質(zhì)粒對(duì)照；1-8：BbsⅠ酶切產(chǎn)物；M：10000的marker圖4 PX330酶切Fig.4 Digestion of PX330

圖5 敲除載體的測(cè)序結(jié)果Fig.5 Knocking out the sequencing results of the vector

M1：DL1000；1-3：對(duì)照，gRNA1，gRNA2；M2：DL500圖6 敲除載體T7E1酶切驗(yàn)證Fig.6 knockout vector T7E1 digestion validation

2.3 同源打靶載體的構(gòu)建

將構(gòu)建的pIRZP-H11-3’Arm載體用BglⅡ限制酶對(duì)其右同源臂的方向進(jìn)行酶切驗(yàn)證，經(jīng)電泳分析發(fā)現(xiàn)在3號(hào)約1658 bp處可以看見清晰的條帶，說明3號(hào)右同源臂的方向正確(圖7)。若右同源臂的方向不正確，則會(huì)得到2219 bp大小的片段。進(jìn)一步對(duì)3號(hào)質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示H11的右同源臂成功連接到pIRZP載體上。之后對(duì)構(gòu)建的pIRZP-H11載體用PCR驗(yàn)證其左同源臂的方向，若方向正確如圖8 A,以H11-5’-F，Puro-R進(jìn)行PCR就可以擴(kuò)增出1987 bp片段，而以H11-5’-F，Green-R PCR后可以擴(kuò)增出3323 bp的片段。若方向錯(cuò)誤則不會(huì)擴(kuò)增出條帶。測(cè)序結(jié)果顯示H11的左同源臂連接到pIRZP-H11-3’Arm載體上(圖8B)。成功構(gòu)建pIRZP-H11同源打靶載體如圖9 A，9B所示。進(jìn)一步酶切驗(yàn)證pIRZP-H11載體，因?yàn)閜IRZP-H11載體上有3個(gè)AflⅡ酶切位點(diǎn)，2個(gè)BglⅡ酶切位點(diǎn)，所以用AflⅡ酶切則會(huì)出現(xiàn)3532 bp，3132 bp，717 bp三條清晰的條帶，其中717 bp為右同源臂的的大小如圖9C第3道。而用NheⅠ和BglⅡ酶切 pIRZP-H11載體會(huì)出現(xiàn)5117 bp，1658 bp，606 bp3個(gè)條帶，其中606 bp為Puro基因的大小如圖9C第4道。用AseI酶切pIRZP-H11載體出現(xiàn)6621 bp和793 bp2個(gè)條帶，其中793 bp為左同源臂的大小。以上結(jié)果進(jìn)一步證明我們構(gòu)建的pIRZP-H11載體是正確的。

A—酶切驗(yàn)證方向(M：DL2000);B—3號(hào)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果圖7 pIRZP-H11 -3’Arm載體驗(yàn)證Fig.7 pIRZP-H11-3'Arm vector validation

A—PCR驗(yàn)證方向(M1:DL2000；M2：DL10000；1、2：Puro引物；3、4：Green引物；1、3為同一個(gè)樣品；2、4為同一個(gè)樣品)；B—8號(hào)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果圖8 pIRZP-H11載體驗(yàn)證Fig.8 pIRZP-H11 vector validation

C(M1：DL10000；1-4：對(duì)照，Ase I酶切，BglⅡ和NheⅠ酶切，AflⅡ酶切；M2：DL1000)圖9 pIRZP-H11載體圖和pIRZP-H11載體酶切Fig.9 pIRZP-H11vector and Digestion of pIRZP-H11 vector

2.4 嘌呤霉素最佳濃度篩選結(jié)果

經(jīng)過不同濃度嘌呤霉素的篩選，最終我們確定了在兔胚胎成纖維細(xì)胞中，嘌呤霉素的最佳篩選濃度為2 μg/mL。在該濃度下，兔胚胎成纖維細(xì)胞經(jīng)過3天的篩選就已全部死亡。

2.5 GFP表達(dá)及藥物篩選單克隆群

將敲除載體和打靶載體共轉(zhuǎn)染兔胚胎成纖維細(xì)胞24 h后，在40X倍鏡下觀察到共轉(zhuǎn)染后兔胚胎成纖維細(xì)胞形態(tài)良好，而熒光表達(dá)量和細(xì)胞數(shù)量均比較少。我們還發(fā)現(xiàn)H11-gRNA1+ pIRZP-H11共轉(zhuǎn)染兔胚胎成纖維其熒光表達(dá)量和細(xì)胞狀態(tài)高于H11-gRNA2+pIRZP-H11，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行后續(xù)嘌呤霉素抗性篩選研究。當(dāng)兔胚胎成纖維細(xì)胞共轉(zhuǎn)染H11-gRNA+ pIRZP-H11質(zhì)粒經(jīng)過嘌呤霉素篩選到25 d時(shí)，在顯微鏡下可以觀察到如(圖10)所示的大的具有綠色熒光以及Puro抗性的單克隆群。分別在共轉(zhuǎn)染H11-gRNA1+ pIRZP -H11和H11-gRNA2+ pIRZP-H11質(zhì)粒的兔胚胎成纖維細(xì)胞中找出9個(gè)和8個(gè)相對(duì)大的克隆群(圖11)。

A—H11-gRNA1+ pIRZP-H11；B—H11-gRNA2+ pIRZP-H11圖10 共轉(zhuǎn)染兔胚胎成纖維細(xì)胞24 h熒光圖(40×)Fig.10 Co-transfected rabbit embryonic fibroblasts for 24 hours(40×)

A—H11-gRNA1+ pIRZP-H11;B—H11-gRNA2+ pIRZP-H11圖11 兔胚胎成纖維細(xì)胞藥殺25 d 單克隆熒光圖(40×)Fig.11 Rabbit embryonic fibroblasts were killed by 25 days(40×)

2.6 打靶細(xì)胞的檢測(cè)

提取共轉(zhuǎn)染后兔胚胎成纖維細(xì)胞的基因組，通過PCR檢測(cè)后如圖12A，可以看到Puro基因和GFP基因清晰單一的條帶且大小與我們預(yù)期的相同，這說明共轉(zhuǎn)染的兔胚胎成纖維細(xì)胞基因組中已存在Puro和GFP基因，進(jìn)一步用5’arm-cmv-F，5’arm-cmv-R和GFP-3’arm-F1，GFP-3’arm-R1兩對(duì)引物對(duì)打靶細(xì)胞基因組定點(diǎn)整合做PCR鑒定，如圖出現(xiàn)預(yù)期大小的單一條帶(圖12B)以上結(jié)果證明這兩個(gè)基因已經(jīng)成功整合至兔胚胎成纖維細(xì)胞基因組中。

A—M：DL1000；1、2：共轉(zhuǎn)染H11-gRNA1+ pIRZP-H11質(zhì)粒細(xì)胞的Puro和ZsGreen1；3、4：共轉(zhuǎn)染H11-gRNA2+pIRZP-H11質(zhì)粒細(xì)胞的Puro和ZsGreen1；B—M：DL2000；1、3：共轉(zhuǎn)染H11-gRNA1+pIRZP-H11質(zhì)粒細(xì)胞左、右同源臂的junction；2、4：共轉(zhuǎn)染H11-gRNA2+pIRZP-H11質(zhì)粒細(xì)胞左、右同源臂的junction圖12 打靶細(xì)胞的PCR檢測(cè)和junction PCR檢測(cè)Fig.12 PCR detection of target cells and detection of the transfected cells

3 討論

1985年，Hammer等人研究出世界上首例轉(zhuǎn)基因兔[14]。此后，在全世界內(nèi)，具有不同研究目的的轉(zhuǎn)基因兔模型相繼被生產(chǎn)出來，例如淋巴細(xì)胞白血病腫瘤和乳頭狀瘤[15]，獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)[16]和藥用蛋白反應(yīng)器的研究。然而，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因兔模型是由外源基因通過原核顯微注射被隨機(jī)插入到兔基因組中產(chǎn)生的。在這過程中存在一些問題，因?yàn)橥庠椿虿迦氲酵没蚪M內(nèi)的隨機(jī)位點(diǎn)上，所以轉(zhuǎn)基因會(huì)受到位置效應(yīng)[15-16]，例如：轉(zhuǎn)基因可能會(huì)通過插入進(jìn)而誘變和破壞兔本身基因的功能，因此，科研人員為了篩選足夠多的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)系統(tǒng)并且獲得可重復(fù)的結(jié)果，他們一般運(yùn)用多條線進(jìn)行篩選[17]。

為了建立有效的基因敲入系統(tǒng)，本試驗(yàn)首先研究了3種基因組編輯方法：鋅指核酸酶(ZFNs)[18]，轉(zhuǎn)錄激活因子類似效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)[19]和RNA 指導(dǎo)的 CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)。研究顯示Cas9 與 ZFN 和TALEN 相比，有一些潛在優(yōu)勢(shì)，包括制作簡(jiǎn)單，低成本，高效性和促進(jìn)多重基因組編輯的能力。JIN[20]等人的數(shù)據(jù)顯示，與CRISPR / Cas9n或TALEN相比，CRISPR / Cas9在豬H11基因座上靶向和切割DNA的效率更高，具有高達(dá)50%～60%的靶向效率。本試驗(yàn)建立的基因敲入系統(tǒng)將GFP和Puro基因高效的整合進(jìn)入兔的H11基因座上，再一次證明了CRISPR / Cas9基因編輯技術(shù)的優(yōu)越性。

本試驗(yàn)首次證明了CRISPR / Cas9可以有效地用于產(chǎn)生兔模型。在本試驗(yàn)中，通過將CRISPR / Cas9、同源定向重組(HDR)和兔子H11位點(diǎn)結(jié)合構(gòu)建成一套系統(tǒng)，在兔中實(shí)現(xiàn)精確的，位點(diǎn)特異性的基因整合及表達(dá),這是一種新的策略。使用CRISPR / Cas9，可以實(shí)現(xiàn)高達(dá)較高的基因整合效率，報(bào)告基因GFP和Puro已存在于兔的基因組中。相比于隨即整合方法，本試驗(yàn)的方法有許多優(yōu)勢(shì)，如：去除了位置效應(yīng)，有比較穩(wěn)定的單拷貝插入以及高整合效率[21]。用傳統(tǒng)HR 的目標(biāo)轉(zhuǎn)基因通過藥物篩選的效率低于 6%，由于其許多元件和大片段，傳統(tǒng)HR 基因靶向載體的構(gòu)建，在技術(shù)上有挑戰(zhàn)性且耗時(shí)[38-39]。

H11 位點(diǎn)，位于Eif4enif1基因 與Drg1 基因中間，而這兩個(gè)基因在不同種屬的位置有所差異，在小鼠、人、豬中分別位于第11 號(hào)、22 號(hào)、14 號(hào)染色體，而在兔中位于第21號(hào)染色體，該位點(diǎn)不含有任何啟動(dòng)子[22]，在具有轉(zhuǎn)錄活性的H11位點(diǎn)插入外源基因，可以實(shí)現(xiàn)通過啟動(dòng)子例如CMV驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)[20]。在以后的克隆過程中，將該敲入系統(tǒng)用于兔胚胎成纖維細(xì)胞中，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得具體的任何所感興趣的基因插入的轉(zhuǎn)基因兔。此外，本試驗(yàn)的敲入系統(tǒng)有效的敲入 1.2 Kb 片段，有研究稱可插入 4.2 Kb，甚至高達(dá)9.4 Kb的大片段[20]，由此可見使用CRISPR / Cas9系統(tǒng)，片段的大小對(duì)基因插入的效率似乎沒有明顯的影響。CRISPR / Cas9介導(dǎo)的同源定向重組基因編輯可以成為精確和高效的獲得轉(zhuǎn)基因兔的有效手段，相信在未來，該敲入系統(tǒng)能夠在大型物種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)中發(fā)揮一定的作用。

4 結(jié)論

試驗(yàn)運(yùn)用CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)獲得敲除載體。針對(duì)H11位點(diǎn)，試驗(yàn)利用基因的HDR構(gòu)建了同源重組載體，在兔胚胎成纖維細(xì)胞系中建立了一個(gè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，該平臺(tái)運(yùn)用HDR機(jī)制進(jìn)行了基因的靶向敲入。通過該平臺(tái)獲得了較高重組效率的兔胚胎成纖維細(xì)胞，這為以后試驗(yàn)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。結(jié)合熒光和藥物篩選以及分子生物學(xué)手段，成功的在兔基因組中檢測(cè)我們期望的外源基因，說明外源基因已整合到基因組中，且HDR機(jī)制的定點(diǎn)整合是可行的，為后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。