余雙奇,孔維健,潘 肅

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 骨科，吉林 長(zhǎng)春130041)

脊髓損傷(SCI)可以導(dǎo)致?lián)p傷水平以下嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能障礙[1,2]。目前關(guān)于脊髓損傷尚無(wú)有效的治療方法。芬戈莫德，也被稱(chēng)為FTY720，是一種被批準(zhǔn)用于治療多發(fā)性硬化癥的免疫調(diào)節(jié)藥物[3]。芬戈莫德在體外對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的影響和對(duì)脊髓損傷的修復(fù)效果已有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)其進(jìn)行了研究[4-6]。本研究將FTY720與PLGA以1%的質(zhì)量比進(jìn)行混合，通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備PLGA/FTY720靜電紡絲膜，利用體外實(shí)驗(yàn)探究了靜電紡絲膜對(duì)NSC增殖分化的影響。并通過(guò)構(gòu)建大鼠脊髓損傷模型探究了在動(dòng)物試驗(yàn)中對(duì)脊髓損傷的治療效果。結(jié)果表明，PLGA/FTY720靜電紡絲膜能夠促進(jìn)NSC的增殖分化，PLGA/FTY720紡絲膜聯(lián)合NSC能夠促進(jìn)脊髓損傷的恢復(fù)，具有良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 PLGA/FTY720靜電紡絲膜的制備

PLGA (Mw=40,000 g/mol)購(gòu)自長(zhǎng)春中諾生物材料有限公司。靜電紡絲膜的制備方法如相關(guān)文獻(xiàn)所述[7]。將PLGA (100 mg)和FTY720 (1 mg,Gilenya,Novartis)溶于六氟異丙醇中，質(zhì)量比為1%。然后，將混合物放入裝有0.4 mm針頭的10 ml注射器中。納米纖維采用電壓調(diào)節(jié)直流電源(DW-P203-1ACFD，天津)，施加電壓20 kv，進(jìn)給速率為1.0 ml/h。收集器和針頭之間的距離為10 cm。從接收屏上收集制得的PLGA/FTY720靜電紡絲膜。純PLGA靜電紡絲膜以相同的方法制得。

1.2 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)吉林大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用機(jī)構(gòu)委員會(huì)批準(zhǔn)，并符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與使用指南》。從胚胎期13.5天SD大鼠的大腦皮層中分離出NSC。這些細(xì)胞在T25培養(yǎng)瓶(corning，美國(guó))中以50000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度進(jìn)行分離和純化，并在37℃含有5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基中含有NB(Gibco,美國(guó))、2% B27(Gibco,美國(guó))、20 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子(Invitrogen，美國(guó))、20 ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Sigma，美國(guó))和100 ng/mL青霉素-鏈霉素雙抗(Gibco，美國(guó))。培養(yǎng)的原代NSC每4天進(jìn)行傳代，培養(yǎng)基每2天更換一次。傳代次數(shù)在第2-5代的NSC被用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 細(xì)胞增殖與分化檢測(cè)

NSC以30 000/cm3的密度分別放置在純PLGA和PLGA/FTY720靜電紡絲膜上進(jìn)行培養(yǎng)，以觀察不同靜電紡絲膜對(duì)NSC增殖的影響。在培養(yǎng)第1,3,7天利用MTT法對(duì)NSC增殖的情況進(jìn)行評(píng)估。每孔中加入50 μl MTT溶液，37℃下孵育4 h。離心后吸去上清液，向每孔中加入100 μl DMSO溶液，振蕩10 min后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇540 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔光吸收值。利用RT-PCR技術(shù)對(duì)NSC在不同靜電紡絲膜上的分化情況進(jìn)行檢測(cè)。NSC在不同的靜電紡絲膜上培養(yǎng)7天后，利用TRIzol試劑盒和PrimeScriptTM試劑盒對(duì)細(xì)胞中的RNA進(jìn)行分離和純化， Tuj-1、GFAP和Oligo分別代表神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因用于結(jié)果校正。各基因引物序列為T(mén)uj-1:GATCGGAGCCAAGTTCTG， GFAP:GCAGACCTTCTC-CAACCTG， Oligo:CGACGCCAAAGAGGAACA-G， GADPH:TCGCCAGCCGAGCCA。

1.4 大鼠脊髓損傷模型構(gòu)建

成年雌性SD大鼠(200-250 g)購(gòu)于吉林大學(xué)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為PLGA組(n=5)、PLGA/FTY720組(n=5)、PLGA-FTY720/NSC組(n=5)和對(duì)照組(n=5)。所有動(dòng)物均氣管插管，手術(shù)過(guò)程中均維持吸入異戊烷麻醉。去除背部毛發(fā)后腹部向下固定在手術(shù)臺(tái)上，確定大鼠T9體表位置，皮膚消毒后沿背部中線(xiàn)切開(kāi)，鈍性分離肌肉完全暴露椎管結(jié)構(gòu)。咬骨鉗咬除棘突和椎板，暴露脊髓。利用眼科剪橫斷脊髓，充分止血后將大小為5 mm×3 mm的不同的靜電紡絲膜覆蓋在損傷部位表面，對(duì)照組只進(jìn)行脊髓橫斷而不植入靜電紡絲膜。依次縫合肌層及皮膚，術(shù)后連續(xù)3天給予抗生素預(yù)防感染。

1.5 脊髓功能恢復(fù)評(píng)估

利用BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)定量表評(píng)價(jià)大鼠后肢功能恢復(fù)情況。實(shí)驗(yàn)中的大鼠在損傷后第1,2,3,4周分別進(jìn)行BBB評(píng)分。采用肌電圖法檢測(cè)大鼠的運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位，評(píng)價(jià)肌肉反應(yīng)。大鼠麻醉后將刺激電極置于坐骨神經(jīng)上激發(fā)運(yùn)動(dòng)電位，將記錄電極置入腓腸肌，記錄誘發(fā)運(yùn)動(dòng)電位的響應(yīng)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有定量數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析(ANOVA)和t檢驗(yàn)對(duì)兩個(gè)以上變量進(jìn)行比較。P<0.05被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

本研究采用MTT法測(cè)定了NSC在不同靜電紡絲膜上第1、3、7天的增殖情況。如圖1所示，在第1天時(shí)，NSC在純PLGA靜電紡絲膜和PLGA/FTY720靜電紡絲膜上在增殖情況無(wú)明顯差異。第3天時(shí)在PLGA/FTY720靜電紡絲膜上生長(zhǎng)的NSC與PLGA組相比具有更高的OD值，第7天時(shí)兩組間OD值具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，PLGA/FTY720組OD值明顯高于PLGA組。利用RT-PCR來(lái)評(píng)估NSC在不同靜電紡絲膜上的分化情況，RT-PCR結(jié)果如表1所示。PLGA和PLGA/FTY720兩組間Tuj mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異。PLGA/FTY720組Oligo mRNA表達(dá)水平明顯高于PLGA組，而GFAP mRNA表達(dá)水平則明顯低于PLGA組(P< 0.05)。

表1 神經(jīng)干細(xì)胞分化RT-PCR(*，P<0.05,n=3)

為了評(píng)價(jià)靜電紡絲膜聯(lián)合FTY720和NSC在體內(nèi)治療脊髓損傷的效果，本研究建立了T9大鼠模型。利用BBB評(píng)分連續(xù)4周評(píng)估脊髓損傷后功能恢復(fù)的情況，評(píng)分結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，損傷后所有組的大鼠BBB評(píng)分均降至0分，并隨著術(shù)后恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，各組BBB評(píng)分均在損傷后第4周達(dá)到最大。損傷對(duì)照組與PLGA組相比較BBB評(píng)分無(wú)明顯差異，兩組的BBB評(píng)分均低于PLGA/FTY720組和PLGA-FTY720/NSC組。PLGA-FTY720/NSC組的BBB評(píng)分在四組中最高。PLGA/FTY720組BBB評(píng)分低于PLGA-FTY720/NSC組，但高于PLGA組和損傷對(duì)照組。

肌電圖的測(cè)量結(jié)果如圖3所示。潛伏期(latency)和波幅(amplitude)兩項(xiàng)指標(biāo)用來(lái)評(píng)估脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。結(jié)果顯示，損傷對(duì)照組和PLGA組的潛伏期兩組之間無(wú)明顯差異，但與PLGA/FTY720組和PLGA-FTY720/NSC組相比有明顯延長(zhǎng)。PLGA-FTY720/NSC組的運(yùn)動(dòng)電位潛伏期略短于PLGA/FTY720組，但兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在四組中PLGA-FTY720/NSC組波幅數(shù)值最大，明顯高于另外三組。PLGA/FTY720組的波幅高于PLGA組和損傷對(duì)照組，但與PLGA-FTY720/NSC組相比仍有一定差距。PLGA組與損傷對(duì)照組波幅數(shù)值最小，且兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞增殖(*，P<0.05,n=3)

圖2 BBB評(píng)分(*，P<0.05,n=3)

圖3 肌電圖測(cè)量結(jié)果(*，P<0.05,n=3)

3 討論

脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)一直是治療脊髓損傷的關(guān)鍵問(wèn)題[1,2]。損傷產(chǎn)生的不連續(xù)脊髓斷端大大降低了神經(jīng)修復(fù)的速度和效果。生物材料為結(jié)構(gòu)性損傷中神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，對(duì)損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)和恢復(fù)具有積極的影響[7,8]。然而，由于脊髓損傷后局部炎癥微環(huán)境等不良因素對(duì)NSC向神經(jīng)元分化有抑制作用，因此僅應(yīng)用生物材料并不能達(dá)到較好的治療效果[9,10]。此外，內(nèi)源性NSC數(shù)量有限，不足以分化為足夠數(shù)量的神經(jīng)元。因此，將藥物與生物材料和NSC聯(lián)合應(yīng)用于脊髓損傷的治療具有良好的研究前景和治療效果。FTY720對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的保護(hù)作用[11]。FTY720一般通過(guò)靜脈給藥或口服給藥來(lái)發(fā)揮作用，但有研究表明，全身應(yīng)用FTY720會(huì)引起粒細(xì)胞缺乏癥等不良反應(yīng)[12，13]。

本研究應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)制備了載有FTY720的靜電紡絲膜。為了探究 PLGA/FTY720靜電紡絲膜對(duì)NSC增殖分化的影響，我們將NSC在不同的靜電紡絲膜上進(jìn)行了培養(yǎng)和檢測(cè)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在混有FTY720的PLGA靜電紡絲膜表面培養(yǎng)的NSC具有更高的OD值，這說(shuō)明1%FTY720對(duì)NSC的增殖有明顯促進(jìn)作用。RT-PCR結(jié)果顯示，PLGA/FTY720能明顯抑制NSC向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化，促進(jìn)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的形成。在脊髓損傷的功能重建過(guò)程中，神經(jīng)元可以進(jìn)一步分化為功能神經(jīng)元，在信號(hào)傳遞中發(fā)揮作用，少突膠質(zhì)細(xì)胞可以促進(jìn)髓鞘和軸突的再生，在功能恢復(fù)中發(fā)揮積極作用[14,15]。雖然RT-PCR結(jié)果未顯示PLGA/FTY720對(duì)NSC向神經(jīng)元分化有明顯影響，但PLGA/FTY720可促進(jìn)NSC向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，分化形成的少突膠質(zhì)細(xì)胞可以促進(jìn)軸突再生。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化具有明顯的抑制作用，而星形膠質(zhì)細(xì)胞則可導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕形成，影響脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)與重建[16]。通過(guò)RT-PCR所得到的細(xì)胞分化結(jié)果與有利于脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)的分化結(jié)果相一致，說(shuō)明FTY720對(duì)脊髓損傷的恢復(fù)具有明顯的促進(jìn)作用。

為了更好地評(píng)價(jià)PLGA/FTY720和PLGA-FTY720/NSC靜電紡絲膜的治療效果，本研究構(gòu)建建立了T9大鼠脊髓全切模型。通過(guò)在損傷部位植入不同種類(lèi)的靜電紡絲膜來(lái)探究FTY720和NSC對(duì)脊髓損傷修復(fù)的效果。BBB評(píng)分結(jié)果顯示，PLGA-FTY720/NSCs能明顯促進(jìn)后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。PLGA/FTY720和PLGA單獨(dú)制成的靜電紡絲膜的也能在一定程度上恢復(fù)后肢運(yùn)動(dòng)功能，但效果不如載有NSC的PLGA/FTY720靜電紡絲膜明顯。這一結(jié)果說(shuō)明NSC在脊髓損傷功能恢復(fù)中具有重要作用，NSC能夠明顯促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)。神經(jīng)沖動(dòng)在傳遞過(guò)程中，神經(jīng)元的潛伏期和振幅是評(píng)價(jià)神經(jīng)功能的重要指標(biāo)[17]。肌電圖的結(jié)果顯示，在四組中PLGA-FTY720/NSC組具有最短的潛伏時(shí)間和最大的振幅，這說(shuō)明PLGA-FTY720/NSC組對(duì)脊髓損傷修復(fù)的促進(jìn)作用最為明顯，這一結(jié)果也與BBB評(píng)分所得到的結(jié)果相一致。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，F(xiàn)TY720和NSC均能夠促進(jìn)脊髓損傷功能恢復(fù)，兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)效果更加顯著。