,2,*,2,*

(1.福建農(nóng)林大學食品科學學院,福建福州 350028;2.福建農(nóng)林大學菌物研究中心,福建福州 350028)

胃腸道是人消化及免疫的重要器官,富集著豐富的微生物群落[1]。這些胃腸道益生菌群在食物消化和營養(yǎng)吸收、改善腸道微生態(tài)平衡,免疫調(diào)節(jié)促進機體健康等方面都具有重要的作用[2]。胃腸道益生菌主要分為3大類:雙歧桿菌類、乳酸桿菌類和革蘭氏陽性球菌。其中保加利亞乳桿菌、青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌被認為是3種重要的益生菌[3-4]。保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)屬于乳酸桿菌屬,在牛奶發(fā)酵中具有重要的應(yīng)用,是乳酸菌中產(chǎn)酸量最高的菌種[5],研究發(fā)現(xiàn)保加利亞人長壽的秘訣在于其長期飲用發(fā)酵乳[6];青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)多見于嬰幼兒的腸道內(nèi),對嬰兒的發(fā)育具有重要作用,不僅能夠調(diào)整腸道菌群,防止便秘,還能降低結(jié)腸癌的發(fā)病率等[7-8];嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)具有改善腸道功能，提高機體免疫能力，緩解乳糖不耐癥等多種生理功效[9-10]。這3種益生菌可定植到人體腸道內(nèi),進一步抑制有害腸道微生物的生長[11-12]。

許多食用菌中的提取物對改善和調(diào)節(jié)腸道微生物均具有一定的作用。富硒猴頭菇凍干粉可顯著增多小鼠腸道中雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量,具有調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群的作用[13];香菇的酶解物可改善小鼠腸道菌群環(huán)境和調(diào)節(jié)腸道功能[14];靈芝多糖可以通過改善調(diào)節(jié)小鼠腸道的微生物群落結(jié)構(gòu)以及維持腸屏障來降低小鼠的肥胖率及其炎癥[15];金針菇、香菇、黑木耳、平菇、雙孢菇、杏鮑菇6種食用菌子實體水提物對糞便懸液中腸道菌群的菌群種類和菌群結(jié)構(gòu)具有一定的影響[16]。猴頭菇(Hericiumerinaceus(Bull.)Pers.)作為一種大型食藥用菌,屬于擔子菌亞門、擔子菌綱、多孔菌目、齒菌科、猴頭屬[17]。中醫(yī)學認為,猴頭菇性平、味甘、利五臟、助消化;具有健胃、補虛、抗癌、益腎精之功效[18]。大量研究結(jié)果顯示,猴頭菇提取物營養(yǎng)豐富,化學成分眾多,其中多糖被認為是猴頭菇具有多種藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[19-21]。猴頭菇多糖有抗氧化和清除DPPH自由基的功能,較于其他杏鮑菇,平菇等真菌多糖具有更顯著的效果[22]。猴頭菇子實體對于胃、十二指腸潰瘍等具有療效,而猴頭菇子實體小分子提取物能顯著地抑制幽門螺桿菌的生長[23]。

但關(guān)于猴頭菇多糖對于上述3種胃腸道益生菌的直接生長影響研究較少。因此,本研究擬在培養(yǎng)基中添加不同含量的猴頭菇多糖,檢測這3種胃腸道益生菌的生長情況,同時通過模擬人體胃腸道環(huán)境,探究猴頭菇多糖對3種益生菌在胃液和腸液中耐受力的影響,為猴頭菇功能食品的研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

猴頭菇多糖 純度為64%,福建省尤溪縣天茸生物技術(shù)有限公司;胰蛋白酶250 NFU/mg、胃蛋白酶≥250 U/mg、L-鹽酸半胱氨酸 北京索萊寶科技有限公司;保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌 北京川秀科技有限公司,經(jīng)實驗室自行分離獲得純菌株;青春雙歧桿菌菌株 上海滬崢生物科技有限公司,編號為:ATCC 15703;TPY培養(yǎng)基(青春雙歧桿菌) 青島海博生物科技有限公司。

UV-2600紫外分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司;明澈TM-D2超凈純水系統(tǒng) 德國Thermo Scientific;SPX-250生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(保加利亞乳桿菌):蒸餾水1000 mL,牛肉膏10.0 g,蛋白胨5.0 g,NaCl 5.0 g,葡萄糖5.0 g,醋酸鈉3.0 g,L-鹽酸半胱氨酸0.5 g,酵母粉3.0 g,調(diào)節(jié)pH至6.8左右。

TYC培養(yǎng)基(嗜熱鏈球菌):蒸餾水1000 mL,蔗糖5.0 g,胰蛋白胨15.0 g,亞硫酸鈉0.1 g,乙酸鈉2.0 g,酵母浸粉5.0 g,L-鹽酸半胱氨酸0.2 g,NaCl 1.0 g,NaHCO32.0 g,Na2HPO42.0 g,調(diào)節(jié)pH至7.3左右。

1.2.2 菌種活化 從保存的保加利亞乳桿菌、青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌菌種制劑中分別取一環(huán)接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基、TPY培養(yǎng)基和TYC培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后,取0.1 mL接種于相應(yīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,傳代兩次后得到相應(yīng)活化的菌種。其中青春雙歧桿菌為厭氧型微生物,故將其置于裝有厭氧產(chǎn)氣袋的不透氣樂扣箱培養(yǎng)。

1.2.3 菌種稀釋度的確定 取3%已活化的液體菌種接種到裝有20 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的18 cm×180 cm試管,待達到菌種培養(yǎng)穩(wěn)定期時(約10～18 h),取1 mL菌液稀釋,稀釋梯度為10-1～10-8,分別取0.1 mL的菌液于相應(yīng)平板中涂布。經(jīng)培養(yǎng)后計數(shù),記錄菌落數(shù)在30～300 cfu的平板和相應(yīng)的稀釋倍數(shù),為正式平板計數(shù)確定合適的三個稀釋度。

1.2.4 體外胃腸模擬液的制備 按2015版《中國藥典》配制體外胃模擬液:以磷酸緩沖鹽溶液(PBS,0.1 mol/L,pH=7.4)替換配制試驗培養(yǎng)基中的水,用37%的鹽酸溶液調(diào)節(jié)實驗培養(yǎng)基pH至3.0。于高壓滅菌鍋(121 ℃,15 min)中滅菌,用無菌水將一定量經(jīng)紫外滅過菌的胃蛋白酶溶解,添加到冷卻至室溫的培養(yǎng)基中,配制成含0.5%胃蛋白酶的試驗培養(yǎng)基,體外模擬胃環(huán)境。

按2015版《中國藥典》配制體外腸模擬液:以PBS緩沖液替換配制試驗培養(yǎng)基中的水,用37%的鹽酸溶液調(diào)節(jié)實驗培養(yǎng)基pH至7.0。于高壓滅菌鍋(121 ℃,15 min)中滅菌,用無菌水將一定量經(jīng)紫外滅過菌的胰蛋白酶溶解,添加到冷卻至室溫的培養(yǎng)基中,配制成含1%胰蛋白酶的試驗培養(yǎng)基,體外模擬腸環(huán)境。

1.2.5 三種益生菌生長曲線的檢測 取0.1 mL活化的液體菌種,接種于39個裝有20 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基大試管中,編號分別為0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h,每個編號設(shè)置3個試管,于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后測定每個培養(yǎng)時間點的菌液在600 nm處的吸光值,取三個試管吸光值的平均值繪制生長曲線。測得的保加利亞乳桿菌、青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌生長至穩(wěn)定期的時間分別為T1、T2、T3。

1.2.6 猴頭菇多糖對三種益生菌體外生長的影響試驗 分別取0.6 mL的保加利亞乳桿菌、青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌菌液接種至20 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CK)與分別添加0.3%、0.5%、0.7%猴頭菇多糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。再將保加利亞乳桿菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌的上述培養(yǎng)基分別于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)T1、T2、T3時間后,各取1 mL菌液根據(jù)預(yù)實驗測定結(jié)果進行相應(yīng)的稀釋,每個稀釋液各取0.1 mL,涂布于選擇性培養(yǎng)基平板中,于37 ℃培養(yǎng)48 h后計算菌落數(shù)。每組試驗重復(fù)三次。

表1 不同稀釋度的三種菌在猴頭菇多糖平板上的菌落數(shù)情況Table 1 Colony number of three kinds of bacteria with different dilutions on Hericium erinaceus polysaccharide plate

注:-表示數(shù)量較多,無法計算。

1.2.7 添加猴頭菇多糖對三種益生菌在模擬胃液、腸液培養(yǎng)基中的耐受性試驗 分別于模擬胃液試驗培養(yǎng)基和模擬腸液試驗培養(yǎng)基中加入7%猴頭菇多糖提取物代替葡萄糖,再分別以不含猴頭菇多糖胃液和腸液試驗培養(yǎng)基為對照組(CK),分別接種0.6 mL三種益生菌活化菌液,混勻后立即取1 mL稀釋,于平板中涂布,經(jīng)37 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù),為0 h的菌數(shù)。將試驗培養(yǎng)基放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 h后取出試驗培養(yǎng)基,取1 mL稀釋,于平板中涂布,經(jīng)37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h后計數(shù)，其為3 h平板菌落數(shù),每組試驗重復(fù)三次。然后分別計算存活率,存活率為3 h后的菌落總數(shù)與0 h的菌落總數(shù)的比值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0,用Originpro 8.0、Excel 2010進行做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種益生菌生長曲線

保加利亞乳桿菌、青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的生長曲線如圖1所示,三種乳酸菌在0～4 h都處在調(diào)整期。4 h以后,三種乳酸菌都漸漸步入指數(shù)期。保加利亞乳桿菌在18 h左右進入穩(wěn)定期,青春雙歧桿菌在14 h左右進入穩(wěn)定期,而嗜熱鏈球菌在10 h左右進入穩(wěn)定期。因此,在研究猴頭菇多糖對乳酸菌體外生長影響試驗與模擬腸胃試驗中,三種乳酸菌的菌種最佳培養(yǎng)時間分別為:18 h(保加利亞乳桿菌)、14 h(青春雙歧桿菌)、10 h(嗜熱鏈球菌)。

圖1 三種乳酸菌生長曲線Fig.1 Growth curves of three kinds of lactic acid bacteria

2.2 猴頭菇多糖對三種益生菌體外生長的影響實驗結(jié)果

在不同多糖添加量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h后,取樣進行平板計算,實驗結(jié)果見表1和圖2。保加利亞乳桿菌、青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌分別以10-6、10-5和10-5為有效稀釋度,在培養(yǎng)基中添加0.3%的猴頭菇多糖,三種益生菌的生長量均明顯增加。當培養(yǎng)基中猴頭菇多糖含量由0.3%增加至0.7%時,保加利亞乳桿菌和青春雙歧桿菌的生長量均增長明顯,達到顯著性差異(P<0.05)。而嗜熱鏈球菌的生長量隨著猴頭菇多糖含量逐漸增加時增速放緩,0.5%與0.7%的猴頭菇多糖添加量組中,嗜熱鏈球菌的生長量沒有顯著性差異(P>0.05)。與山藥多糖(12.5%濃度,雙歧桿菌數(shù)量增加最顯著)[24]和白術(shù)多糖(2.0%濃度,雙歧桿菌數(shù)量增加最顯著)[25]相比,只需更低的猴頭菇多糖量即可促進雙歧桿菌的數(shù)量增加,顯示出猴頭菇多糖對三種益生菌的促進增長作用更強。

圖2 猴頭菇多糖含量對三種益生菌生長的影響Fig.2 Effects of polysaccharide fromHericium erinaceus on the growth of three probiotics注:對于同一種益生菌，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表2 不同稀釋度的三種菌在猴頭菇多糖的模擬胃液平板上菌落數(shù)情況Table 2 Colony number of three kinds of bacteria with different dilutions on simulated gastric fluid plate with Hericium erinaceus polysaccharides

注:-表示數(shù)量較多,無法計算;同一菌種不同處理的菌落總數(shù)比較,用a、b、c和d表示顯著性差異(P<0.05)。

表3 不同稀釋度三種乳酸菌在猴頭菇多糖的模擬腸液平板上菌落數(shù)情況Table 3 Colony number of three kinds of bacteria with different dilutions on simulated intestinal juice plate with Hericium erinaceus polysaccharides

注:-表示數(shù)量較多,無法計算;同一菌種不同處理的菌落總數(shù)比較,用a、b、c和d表示顯著性差異(P<0.05)。

2.3 添加猴頭菇多糖對三種益生菌在模擬胃液中的耐受性影響

分別用含7%猴頭菇多糖、pH為3.0的模擬胃液培養(yǎng)基對三種菌培養(yǎng)3 h后,取樣進行平板計算(表2),結(jié)果顯示:三種菌的有效稀釋度均為10-3,未添加猴頭菇多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h后,保加利亞乳桿菌存活率為64.32%;添加7%猴頭菇多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h后,保加利亞乳桿菌的存活率為71.83%,存活率提升了7.51%。而青春雙歧桿菌的存活率由原來的67.52%提升到69.43%,提升了1.91%;嗜熱鏈球菌的存活率由原來的67.82%提升到68.93%,提升了1.11%。因此,猴頭菇多糖能夠顯著(P<0.05)增強保加利亞乳桿菌對胃液的耐受性,而對青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的改善作用不是很顯著(P>0.05)。

2.4 添加猴頭菇多糖對三種益生菌在模擬腸液中的耐受性影響

分別用含7%猴頭菇多糖、pH為7的模擬腸液的培養(yǎng)基對三種菌進行培養(yǎng)3 h后,取樣進行平板計算(表3),結(jié)果顯示:三種菌的有效稀釋度均為10-3,未添加猴頭菇多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h后,再培養(yǎng)后保加利亞乳桿菌存活率為77.52%;添加猴頭菇多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h后,再培養(yǎng)后保加利亞乳桿菌的存活率為81.32%,存活率提升了3.80%。而青春雙歧桿菌的存活率由原來的72.61%提升到73.46%,提升了0.85%;嗜熱鏈球菌的存活率由原來的67.24%提升到78.62%,提升了11.38%。因此,猴頭菇多糖能夠顯著增強嗜熱鏈球菌(P<0.01)和保加利亞乳桿菌(P<0.05)對腸液的耐受性,而對青春雙歧桿菌的改善作用不是很明顯(P>0.05)。

3 討論

猴頭菇養(yǎng)胃功效作用的腸道微生物的種類仍未明確[7,12]。本研究通過在乳酸菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的猴頭菇多糖,發(fā)現(xiàn)猴頭菇多糖能夠促進保加利亞乳桿菌、青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌胃腸益生菌的生長。其中保加利亞乳桿菌與青春雙歧桿菌的生長量隨著猴頭菇多糖添加量的增多而增加。而嗜熱鏈球菌的生長量在猴頭菇多糖含量為0.5%時增速放緩。通過模擬人體胃腸道環(huán)境,發(fā)現(xiàn)猴頭菇多糖能夠顯著增強保加利亞乳桿菌對胃液和腸液的耐受性,顯著增強青春雙歧桿菌對腸液的耐受性,增強嗜熱鏈球菌對腸液的耐受性。

多糖是食用菌重要的生物活性物質(zhì)之一,可作為胃腸道益生菌的能源物質(zhì),還可促進這些益生菌對腸道細胞的粘附,從而保持胃腸道正常的黏膜免疫系統(tǒng)[18,20,26-27]。猴頭菇養(yǎng)胃功效的作用機制雖未明確,從本研究的結(jié)果可以推斷猴頭菇多糖的作用可能是一方面增強一些腸胃益生菌對胃液、腸液的耐受力,從而調(diào)節(jié)胃腸內(nèi)的益生菌的菌群結(jié)構(gòu);另一方面,猴頭菇多糖能促進胃腸內(nèi)原有益生菌的生長,促進胃腸內(nèi)部的益生菌數(shù)量,從而起到改善調(diào)節(jié)胃腸的作用。本研究為猴頭菇改善胃腸道的功能性食品的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。當然,本文對于猴頭菇多糖具體是如何調(diào)節(jié)腸胃內(nèi)微生物的生長的機理尚不清楚,需要進一步的深入研究。