武兆文，鄭 翔，張佳佳，王 濤，唐忠林，劉 煒，周國勤，尹紹武

（1.南京師范大學生命科學學院，海洋科學與工程學院，南京 210023；2.南京市水產(chǎn)科學研究所，南京 210036）

在魚類人工繁殖過程中，對魚體性別的準確判斷是魚體性別定向控制、選育和繁殖的基礎(chǔ)。解剖觀察、性腺切片等是魚類雌雄判別的常用方法，但需剖殺活體，造成樣本浪費，對于幼齡魚和珍稀魚種均不適用。具有明顯兩性特征的魚類，可通過鰭條和生殖孔特征等差異鑒定性別［1-2］，但對于外觀特征不明顯的魚類則難以鑒別。運用超聲波技術(shù)可對條紋鱸（Morone saxatilis）［3］和中華鱘（Acipenser sinensis）成魚［4］進行性別鑒定，具有較高的準確度，但在魚類早期性別鑒定時，常因不能提供足夠的有效信息［5］而影響其運用。近年對半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）［6］和黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）［7］等魚類的研究表明，運用分子生物學技術(shù)從雌（雄）魚基因組DNA中篩選出性別特異標記基因，建立遺傳性別鑒定的PCR技術(shù)，可從遺傳角度判定魚類性別。但在日常生產(chǎn)和野外工作中，由于條件限制，迫切需要更為簡便的方法區(qū)分雌雄差異。而利用大量樣本的形態(tài)和框架指標，篩選特殊指標進行性別判定是一種簡單實用的方法。

黃顙魚，別稱黃角丁、黃骨魚、昂刺、刺黃股等，屬于鯰形目（Siluriformes），鲿科（Siluridae），黃顙魚屬，在我國主要分布于長江、珠江等東部各太平洋水系。黃顙魚屬的種類較多，有瓦氏黃顙魚（P.vachelli）、岔尾黃顙魚（P.eupogon）及中間黃顙魚（P.intermedius）等。近年來，隨著黃顙魚養(yǎng)殖和繁育技術(shù)的進步，黃顙魚人工育種得到快速發(fā)展［8-9］。然而，在人工養(yǎng)殖過程中，黃顙魚存在著個體小、生長速度慢等缺點，在高密度的池塘養(yǎng)殖中，魚規(guī)格偏小，影響了整體養(yǎng)殖產(chǎn)量［10］。為此，科技工作者通過雜交育種來改善魚體質(zhì)量，提高產(chǎn)量，并取得了良好的成效，其技術(shù)也在生產(chǎn)上得到了推廣［11］。雜交育種是遺傳育種中最經(jīng)典的方法之一，不同種間生物的雜交，有可能獲得雜種優(yōu)勢并迅速、顯著地提高雜交后代的生活力、經(jīng)濟性狀等，繼而培育成新品種。迄今為止，我國已通過不同種類雜交培育出一些在生長性能上具有明顯優(yōu)勢的雜交品種，例如牙鲆（Paralichthys olivaceu）“鲆優(yōu) 1號”［12］、雜色鮑（Haliotis diversicolor）“東 優(yōu) 1號”［13］、湘 云 鯽（Cyprinus auratus triploid）和雜交鱧（Channa argus♂×C.maeulata♀）“杭鱧 1號”［14］等。在鲿科魚類中，常利用黃顙魚、瓦氏黃顙魚、長吻鮠（Leiocassis longirostris）以及烏蘇里擬鲿（Pseudobagrus ussuriensis）等魚類進行種間雜交和屬間雜交［15-18］，而本文研究的雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”（以下簡稱雜交黃顙魚）是由經(jīng)二代選育的瓦氏黃顙魚（♂）與三代選育的黃顙魚（♀）組合的雜交后代，其生長速度高于母本黃顙魚，且比黃顙魚個體大，抗逆性強；與父本瓦氏黃顙魚相比，品質(zhì)和市場接受度更高，因而顯示出良好的開發(fā)前景。本研究測量了2齡雜交黃顙魚326尾和3齡雜交黃顙魚183尾的11個計量性狀。在此基礎(chǔ)上，計算出11個標準化性狀，通過對所得實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和比較，旨在明確雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”的主要形態(tài)指標體系，找出雌雄個體形態(tài)上存在的差異，以期為今后雜交黃顙魚新品種培育過程中雌雄的形態(tài)特征判別提供參考方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魚均采自池塘養(yǎng)殖，于2018年6月取自南京市水產(chǎn)科學研究所祿口基地。共取實驗用魚509尾：其中2齡雜交黃顙魚326尾，體長為14.32～27.52 cm，體質(zhì)量為45.00～181.00 g；3齡雜交黃顙魚183尾，體長為14.62～28.42 cm，體質(zhì)量為44.74～291.05 g。

1.2 數(shù)據(jù)測量

采用游標卡尺（573-642，±0.01cm，昆山銘尚精密機電有限公司）測量全長（full length，F(xiàn)L）、體長（body length，BL）、頭長（head length，HL）、體 高 （body height，BH）、體 厚 （body thickness，BT）、尾柄長（caudal peduncle length，CPL）、尾柄高（caudal peduncle height，CPH）、吻長（lip length，LL）、眼徑（eye diameter，ED）、眼間距（interorbital distance，ID）等形態(tài)性狀指標；使用電子天平（JSC-T29-6，±0.01g，惠而邦電子衡器有限公司）稱量體質(zhì)量（body weight，BW）。肥滿度（fatness）＝體質(zhì)量（g）／體長3（cm）×100%，測定形態(tài)指標后，再逐一解剖觀察其性腺特征判斷性別。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將鑒定過性別的509尾雜交黃顙魚進行有效計量性狀測量，其中雌魚261尾，雄魚248尾，為消除個體差異對形態(tài)數(shù)據(jù)的影響，便于差異比較，將測得的數(shù)據(jù)進行整理及標準化，共得到11項計量性狀和11項標準化性狀，其中計量性狀包括全長、體長、頭長、體高、體厚、尾柄長、尾柄高、吻長、眼徑、眼間距、體質(zhì)量，標準化性狀包括肥滿度、體長／頭長、眼徑／吻長、體長／體高、體長／體厚、體長／尾柄長、頭長／吻長、頭長／眼徑、體高／體厚、尾柄長／尾柄高、體長／全長。將11項計量性狀和11項標準化性狀進行主成分分析，同時運用逐步判別分析（所采集的509尾雜交黃顙魚個體按照年齡的不同，篩選出2齡雜交黃顙魚326尾、3齡雜交黃顙魚183尾），根據(jù)各變量對模型貢獻的大小，最終在2、3齡魚群體中分別得出若干個變量，分別建立雜交黃顙魚2、3齡雌雄個體判別方程式，并根據(jù)所建立的方程，對所采集的樣品進行重新檢測，對照實際解剖的性別信息，檢驗方程的有效性。利用 Excel 2010及SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準差（X±SD）表示，變異系數(shù)以標準差與平均值之比（C.V.＝σ／μ）表示，采用 t-檢驗比較雌雄個體指標差異，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 雌雄雜交黃顙魚體質(zhì)量、體長差異

將實驗中采集的2、3齡魚分別以體長、體質(zhì)量為變量做柱狀圖比較分析。結(jié)果表明，2齡雜交黃顙魚雄魚體長、體質(zhì)量高于雌魚，但無顯著性差異（P＞0.05），3齡雜交黃顙魚雄魚體長、體質(zhì)量均顯著高于雌魚（P＜0.05）（圖1）。結(jié)果初步顯示出雜交黃顙魚雌魚與雄魚在外觀上存在著明顯的差異。

2.2 雌雄雜交黃顙魚形態(tài)性狀分析

由表1可知，雌性雜交黃顙魚各項計量性狀指標中，變異系數(shù)最大的是尾柄高，為0.91；雄性雜交黃顙魚各項計量性狀指標中變異系數(shù)最大的是體質(zhì)量，為0.42。從11項計量性狀的數(shù)據(jù)對比可以看出雌魚個體間的變異較雄魚大，雄魚個體計量性狀相對較穩(wěn)定。為了分析雌雄間形態(tài)特征的差異，將雌雄個體的均值差與總體均值相除（MD／Mean）進行標準化處理，可得出：在所有個體計量性狀中，體質(zhì)量的差異最大，為0.29；其次為全長和體長，均值差／均值分別為0.13和0.12；眼徑和尾柄高的差異最小，均為0.01。

2.3 雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”主成分分析

為明確雜交黃顙魚的形態(tài)指標體系，對22項性狀進行主成分分析，篩選出前6個最大主成分貢獻率，以及各指標在這6個主成分上的負荷量，發(fā)現(xiàn)它們的累積貢獻率達到76.36%，6個主成分及其包含的性狀和負荷量見表2。其中，主成分Ⅰ的貢獻率為27.49%，其中負荷量較大的包括體長、全長、頭長、體高、吻長、眼間距和體質(zhì)量等7項主要指標，可以反映出雜交黃顙魚的整體輪廓特征；主成分Ⅱ貢獻率為11.24%，負荷量較大的是體長／體高、尾柄長／尾柄高以及肥滿度，反映的是雜交黃顙魚體型的肥瘦程度；主成分Ⅲ貢獻率為10.91%，主要包括眼徑、眼徑／吻長以及頭長／眼徑3個指標，反映了雜交黃顙魚的眼間距特征；主成分Ⅳ貢獻率為9.67%，主要包括尾柄長和尾柄長／尾柄高2個指標，反映了雜交黃顙魚的尾部特征；主成分Ⅴ的貢獻率為9.17%，主要包括眼徑／吻長和頭長／吻長，反映了雜交黃顙魚的頭部特征；主成分Ⅵ貢獻率為7.89%，主要包括體厚、頭長／吻長和體高／體厚3個指標，反映了雜交黃顙魚身體前部的T型構(gòu)造。

圖1 雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”雌雄體長（A）和體質(zhì)量（B）的比較Fig．1 Comparison of body length（A）and body weight（B）of hybrid yellow catfish“Huangyou-1”between male and female

表1 雌雄雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”計量性狀比較Tab．1 Comparison of metrological traits of hybrid yellow catfish“Huangyou-1”between male and female

表2 6個主成分貢獻率及各指標負荷量Tab．2 Contribution rate of six principal components and the load quantity of each index

根據(jù)主成分分析的結(jié)果，對主成分Ⅰ和主成分Ⅱ的雌雄個體主成分得分做出散點圖，可以看出，分散不明顯，但仍表現(xiàn)出分離態(tài)勢（圖2）。

圖2 雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”在主成分Ⅰ和主成分Ⅱ上的分布Fig．2 Distribution of hybrid yellow catfish“Huangyou-1”on principal componentⅠand principal componentⅡ

2.4 雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”雌雄判別分析

為了深入了解隨著個體生長和年齡增長，雜交黃顙魚雌雄形態(tài)差異的分化情況，對所采集的509尾雜交黃顙魚個體按照年齡的不同，篩選出2齡雜交黃顙魚326尾、3齡雜交黃顙魚183尾，通過SPSS 19.0軟件對雜交黃顙魚的體長、全長、頭長、體高、尾柄高、尾柄長、體厚、吻長、眼徑、眼間距和體質(zhì)量11項計量性狀和11項標準化性狀進行逐步判別分析，并根據(jù)各變量對模型貢獻大小，逐步剔除不相關(guān)變量，最終在2齡魚群體中篩選出8個變量，3齡魚群體中篩選出2個變量。

對2齡雜交黃顙魚進行判別分析，篩選出的8個變量為 X1（體長，cm）、X2（全長，cm）、X3（體高，cm）、X4（體質(zhì)量，g）；X5（體長／體高）、X6（頭長／眼徑）、X7（體高／體寬）、X8（體長／全長）。這8個指標反映了2齡魚雌雄個體在外部整體輪廓形態(tài)上的差異，根據(jù)篩選出的8個變量，建立典型判別模型方程為：

雌：F1＝5.854X1-8.737X2+2.02X3+0.839X4+2.181X5-0.272X6+0.701X7-3.895 X8-1.175

雄：F2＝-6.301X1+9.405X2-2.175X3-0.903X4-2.348X5+0.293X6-0.755X7+4.193 X8-1.331

判別函數(shù)的顯著性檢驗顯示P＜0.01，表明判別函數(shù)達到極顯著水平。分別計算出雌雄個體的判別分數(shù)值，得到2齡魚群體雌雄個體的頻布圖，表明該模型可以用于區(qū)分2齡雜交黃顙魚的性別（圖 3、圖 4）。

圖3 2齡雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”雌性個體判別分數(shù)的頻布Fig．3 Frequency distribution of discriminant fraction of 2 years old female hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

圖4 2齡雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”雄性個體判別分數(shù)的頻布Fig．4 Frequency distribution of discriminant fraction of 2 years old male hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

利用所建立的判別方程，對所采集的326尾2齡雜交黃顙魚進行性別回判，將每尾個體的8個特征參數(shù)值代入方程，分別計算F1和F2，如果F1＞F2，則該個體為雌性，反之，為雄性。經(jīng)過驗證，綜合判別的準確率達到87.0%，其中雌性判別準確率為89.3%，雄性判別準確率為84.7%（表3）。同時，對篩選出的用于建立判別函數(shù)的8個性狀進行t-檢驗，結(jié)果顯示這8個性狀在雌雄個體之間全部呈現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01）（表4）。從以上8個性狀的數(shù)據(jù)分析中可以得出，2齡雜交黃顙魚雌雄個體在整體形態(tài)上具有較大差異，雄性個體較雌性更為豐滿，體型上呈現(xiàn)厚胖型。

表3 2齡雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”性別判別結(jié)果Tab．3 Discriminant results of sexual distinction of 2 years old hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

表4 2齡雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”性狀的t-檢驗及雌雄差異分析Tab．4 t-test and analysis of male and female traits of 2 years old hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

對3齡雜交黃顙魚進行判別分析，篩選出的2個變量為X1（全長，cm）和X2（體質(zhì)量，g）。這兩個指標反映了3齡魚雌雄個體在整體生長上的差異。根據(jù)篩選出的2個變量，建立典型判別模型方程為：

雌：F1＝-2.114X1+0.766X2-1.173

雄：F2＝2.185X1-0.791X2-1.24

判別函數(shù)的顯著性檢驗顯示P＜0.01，表明判別函數(shù)達到極顯著水平。分別計算出雌雄個體的判別分數(shù)值，得到3齡魚群體雌雄個體的頻布圖。該模型可以用于區(qū)分3齡雜交黃顙魚的性別（圖5、圖6）。

圖5 3齡雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”雌性個體判別分數(shù)的頻布Fig．5 Frequency distribution of discriminant fraction of 3 years old female hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

圖6 3齡雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”雄性個體判別分數(shù)的頻布Fig．6 Frequency distribution of discriminant fractions of 3 years old male hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

利用所建立的判別方程，對采集的183尾3齡雜交黃顙魚進行性別回判，將每尾個體的2個特征參數(shù)值代入方程，分別計算F1和F2，如果F1＞F2，則該個體為雌性，反之，為雄性。經(jīng)過驗證，綜合判別的準確率達到84.2%，其中雌性判別準確率為83.9%，雄性判別準確率為84.4%（表5）。同時，對篩選出的用于建立判別函數(shù)的2個性狀進行t-檢驗，結(jié)果顯示這2個性狀全部表現(xiàn)為雌雄個體之間的極顯著差異（P＜0.01）（表6）。從這2個性狀的數(shù)據(jù)分析中可以得出，3齡雜交黃顙魚雌雄個體的差異主要體現(xiàn)在外部形態(tài)上，在整體形態(tài)和體長上已具有明顯差異，雄性較雌性個體表現(xiàn)為體長更長、體質(zhì)量更大，體型上呈現(xiàn)長重型。

3 討論

形態(tài)學研究是雜交黃顙魚研究的重要內(nèi)容，與開展雌雄差異分析、進行雌雄性別鑒定息息相關(guān)。目前對雜交黃顙魚的形態(tài)學研究主要集中在不同群體、家系及親子代間的比較。如李镕等［19］對黃顙魚♀×烏蘇里鲿♂、黃顙魚♀×瓦氏黃顙魚♂的雜交后代進行了同塘生長對比和形態(tài)學測量研究；陳建明等［20］對雜交黃顙魚（Pelteobagrus fuividraco♀ ×P.vachelli♂）、瓦氏黃顙魚和黃顙魚形態(tài)指數(shù)、出肉率和肌肉的營養(yǎng)組成等進行了比較分析。近年來，多元統(tǒng)計分析方法如主成分分析、因子分析以及判別分析等廣泛應用于水產(chǎn)科學領(lǐng)域研究。許多學者將主成分分析、判別分析等應用于水產(chǎn)動物雌雄個體形態(tài)差異分析上。諶微等［21］根據(jù)554尾大黃魚的12個計量性狀及11項標準化性狀，利用主成分分析、判別分析等方法，得出雌魚個體變異較雄魚更大，雌雄之間體長／體厚差異最大。董浚鍵等［22］采用相關(guān)分析、通徑分析和判別分析，探究了翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）主要形態(tài)性狀與體質(zhì)量的相關(guān)性，以及雌雄形態(tài)性狀的差異，結(jié)果表明，在各形態(tài)性狀中，全長、體高與體質(zhì)量的相關(guān)系數(shù)最大，對體質(zhì)量的直接影響最大，性別判別方程對于體質(zhì)量小于200 g的個體判別準確率較高。吳波等［23］對 178尾金線魚 （Nemipterus virgatus）形態(tài)性狀進行主成分分析和R-聚類分析，建立了金線魚雌雄判別方程，結(jié)果表明雌性個體相比于雄性個體具有體型較高、頭較大且吻較長的特征。岳亮等［24］基于主成分分析、逐步判別分析和t-檢驗的方法，對紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）雌雄個體形態(tài)差異做了比較分析。結(jié)果表明，雄性與雌性相比體型較寬且體周長較長。

魚類存在著兩性生長差異現(xiàn)象，如大西洋鮭（Salmo salar）［25］、 裸 蓋 魚 （Anoplopoma fimbria）［26］、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）［27］等不同性別個體之間存在著明顯差異。研究發(fā)現(xiàn)，雄魚的生長速度優(yōu)于雌魚，雜交黃顙魚雌雄個體在外部形態(tài)上也顯示出差異性。通過分析雜交黃顙魚各計量性狀均值及其變異系數(shù)可以看出，雌魚個體間變異較雄魚大，而雄魚體型更為齊整、變異范圍小。分析各性狀變異系數(shù)，以雌魚尾柄高變異系數(shù)最大，為0.91，可能的原因為雜交黃顙魚雌魚體型較雄魚更不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)畸形。體質(zhì)量則雄魚變異系數(shù)更大為0.42，雌魚則為0.26，雌雄間差異較大。從各計量性狀均值可以看出，雄魚個體較雌魚更為豐滿，體型上為厚胖型，此結(jié)果在后續(xù)的判別分析中也得到了進一步驗證。

主成分分析結(jié)果顯示，排名前6位的主成分累計貢獻率為76.36%。這6個主成分分別代表雜交黃顙魚整體輪廓特征、肥瘦程度、眼間距特征、頭部特征、尾部特征和身體前部T型結(jié)構(gòu)特征。通過對這些指標的測定和分析，基本可以反映雜交黃顙魚的外形特征。主成分分析的散布圖顯示，雌雄魚均成彌散型分布，表現(xiàn)出分離的趨勢，但雄魚相對雌魚更為集中，雌魚處在邊緣的個體明顯多于雄魚，分離態(tài)勢也更為明顯，進一步驗證了雌魚個體間變異較雄魚大。根據(jù)得分情況可知，對雌雄魚分離作用最大的是體質(zhì)量，分析原因應為雌雄魚在3齡階段生長產(chǎn)生了較大差異，這可為雜交黃顙魚雌雄判別提供重要參考。

表5 3齡雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”性別判別結(jié)果Tab．5 Discriminant results of sex distinction of 3 years old hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

表6 3齡雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”性狀的t-檢驗及性別差異分析Tab．6 t-test and analysis of sex distinct traits of 3 years old hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

隨著魚類個體的生長與形態(tài)發(fā)育，雜交黃顙魚不同年齡段個體表現(xiàn)出不同的外部形態(tài)特征，通過逐步判別分析分別建立的雜交黃顙魚2、3齡雌雄判別方程，可以有效地區(qū)分魚類雌雄差異。2齡魚群體的判別方程共有體長、全長、體高、體質(zhì)量、體長／體高、頭長／眼徑、體高／體厚、體長／全長8個變量，綜合準確率達到了87.0%；3齡魚群體的判別方程僅有體長和體質(zhì)量兩個變量，綜合準確率為84.2%，這表明在雜交黃顙魚的發(fā)育過程中，隨著年齡的增長，雌雄差異逐漸明顯，顯示為更易簡單區(qū)分。雌雄判別的頻步圖也顯示出篩選的變量可以有效判別雌雄差異。郭弘藝等［28］對長江口銀色鰻（Anguilla japonica）的雌雄判別的準確率達到了88.59%；吳波等［23］對金錢魚的雌雄綜合判別準確率達到了85.96%；岳亮等［20］對紅鰭東方鲀的性別判別研究中，綜合判別準確率均達到了81.90%。可見建立形態(tài)學判別方程是鑒定魚類性別的一種有效的方法。此外t-檢驗結(jié)果顯示，雌雄雜交黃顙魚的主要差異集中在肥滿度及外部輪廓指標上，雄魚較雌魚體型寬且長。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，雌雄雜交黃顙魚在生長過程中形態(tài)存在著明顯差異，多個性狀均達到極顯著差異（P＜0.01），證明了雜交黃顙魚雄魚生長速度明顯優(yōu)于雌魚，但要找出雌雄魚生長產(chǎn)生差異的具體階段還需要更深入的研究。在今后的性別差異研究中，需要進一步考慮魚體規(guī)格、個體間差異大小以及形態(tài)指標選取等因素。