姜立生，陳 瑋，李寶山，孫永智，王際英，黃炳山，王世信

（山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室，煙臺 264006）

水解蛋白是利用現(xiàn)代生物學技術將傳統(tǒng)蛋白原料進行水解而獲得的，因其中含有大量的小肽，易于消化吸收，水解蛋白原料也逐漸被應用于水產飼料中［1-2］。研究表明：低魚粉飼料中添加5.5%水解魚蛋白［3］或 10%磷蝦水解物［4］可以提高大菱鲆（Scophthalmus maximus）對飼料氨基酸的利用，12.5%的羽毛水解物替代飼料中76%的魚粉不影響歐洲舌齒鱸（Dicentrarchus labrax）的生長［5］，飼料中添加3%～5%的酵母水解物能有效改善凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）生長性能、提高飼料利用率、促進消化吸收以及改善腸道形態(tài)學指標［6］，水解豆粕部分替代魚粉可提高星斑川鰈（Platichthys stellatus）幼魚的生長性能和飼料利用效率［7］。此外，也有研究表明，不同來源的水解蛋白對花鱸（Lateolabrax japonicus）的生長及體成分的影響也不相同［8］。目前關于水解蛋白替代魚粉的研究主要集中在生長性能、血清生化指標及腸道健康等方面，且在大多數(shù)的報道中水解蛋白的適宜添加量較低。水解蛋白中的小肽分為營養(yǎng)性小肽和功能性小肽，營養(yǎng)性小肽可降低機體吸收時的能耗，促進攝食，顯著促進生長；功能性小肽影響機體生理代謝，進而影響營養(yǎng)素的利用；此外，水解蛋白中含有某些生理活性物質，在機體內可執(zhí)行多種生理功能［2］。飼料中添加水解蛋白勢必會對實驗動物的代謝生理、尤其是內分泌生理產生影響。

大豆?jié)饪s蛋白（soybean protein concentrated）因其粗蛋白含量與魚粉相當、且氨基酸組成相對平衡，而被廣泛應用于漁用飼料中。研究表明：大豆?jié)饪s蛋白可以替代大黃魚（Larimichthys crocea）［9］配合飼料中20%及75%的魚粉。而劉興旺等［10］研究表明大豆?jié)饪s蛋白會對大菱鲆飼料的適口性產生影響，從而不適宜應用于大菱鲆配合飼料中。因此，本研究分別用水解魚粉和水解大豆?jié)饪s蛋白全部替代飼料中的魚粉蛋白，研究對大菱鲆生長及代謝生理的影響，以期為水解蛋白在水產配合飼料中的應用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料與制作

以魚粉和大豆?jié)饪s蛋白為蛋白源，魚油為脂肪源，設計粗蛋白含量為50%、粗脂肪含量為10%的基礎飼料配方。分別以水解魚粉（99%＜3 000 Da）和水解大豆?jié)饪s蛋白（36% ＜3 000 Da）替代飼料中的魚粉，制作3組等氮等能的實驗飼料，分別命名為 FM（fishmeal）、HF（hydrolyzed fishmeal）、HS（hydrolyzed soybean meal）組，實驗飼料組成及基本成分見表1，實驗所用的魚粉、水解魚粉及水解大豆?jié)饪s蛋白基本成分及氨基酸組成見表2。水解魚粉及水解大豆?jié)饪s蛋白為本實驗室酶解制作，制作流程見文獻［7］。飼料制作時各固體原料（過60目標準篩）采用逐級混勻法混勻后，加入新鮮魚油和蒸餾水，再次混勻后用小型飼料擠壓機制成直徑分別為3 mm和5 mm的顆粒，60℃烘干后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗管理

養(yǎng)殖實驗在山東省海洋資源與環(huán)境研究院循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行。實驗用魚購自山東省蓬萊宗哲養(yǎng)殖有限公司。實驗開始前，將500尾大菱鲆幼魚放養(yǎng)于系統(tǒng)中，使其適應養(yǎng)殖環(huán)境。2周后挑選規(guī)格整齊、健康體壯的魚180尾，平均體質量（58.50±0.65）g。實驗分為3個飼料組，每個飼料組3個平行。將實驗用魚平均置于9個綠色養(yǎng)殖水桶中（直徑70 cm，水深45 cm），每個桶20尾魚，日投喂 2次（8∶00、16∶00），飽食投喂，初始日投喂量為魚體質量的1.5%，投喂30 min后，從系統(tǒng)自帶的收集裝置排出殘餌，數(shù)顆粒計算殘餌量，養(yǎng)殖實驗持續(xù)56 d。實驗期間水質條件為：水溫（18±0.5）℃，溶氧 ＞5 mg·L-1，非離子氨和亞硝酸氮含量均＜0.01 mg·L-1，鹽度28～30。

表1 實驗飼料配方及其基本營養(yǎng)成分Tab．1 Formulation and approximate composition of experimental diet （%）

表2 飼料蛋白原料基本成分及氨基酸組成Tab．2 Composition and amino acids profiles of diet protein ingredients （%）

1.3 樣品采集與測定

養(yǎng)殖實驗結束后，實驗用魚饑餓24 h，用MS-222（30 mg·L-1）麻醉后，稱魚體質量、計數(shù)量，計算增重率及成活率。每組隨機取10尾魚，逐尾稱重后，用無菌注射器尾靜脈取血，血液置于4℃冰箱內4 h后，3 000 r·min-1離心，分離血清。取血后的魚置于冰盤上解剖，分離肌肉、內臟，然后從內臟團中分離出肝胰臟、腸道、脾臟，分別稱重并測量腸道長度，用于計算臟體比、肝體比、腸體比、脾體比及腸長比。肌肉及血清樣品均保存于-80℃冰箱中，待測。

生長及形體指標：

增重率（weight gain rate，WGR，%）＝100×（Wf-Wi）／Wi；

特定 生 長 率 （specific growth rate，SGR，%·d-1）＝100×（ln Wf-ln Wi）／56；

飼料系數(shù)（feed conversion ratio，F(xiàn)CR）＝FI／WG；

日攝食率（daily feeds intake，DFI，%）＝100×FI／［（Wi+Wf）／2×56］；

蛋白質效率（protein efficiency ratio，PER，%）＝100×WG／（FI×CP）；

成活率（survive rate，SR，%）＝100×Ns／20；

臟體比（viseraosomatic index，VSI，%）＝100×WV／WB；

肝體比（hepatosomatic index，HSI，%）＝100×WH／WB；

腸體比（ratio of intestine weight to body weight，ISI，%）＝100×WI／WB；

脾體比（ratio of spleen weight to body weight，SSI，%）＝100×WS／WB；

腸長比（ratio of intestine length to body length，IBR，%）＝100×LI／LB；

式中：Wf為均末體質量（g）；Wi為均初體質量（g）；FI為攝食量（g）；WG為實驗用魚的增重量；CP為飼料中粗蛋白含量（%）；Ns為存活尾數(shù)；WV為內臟團質量（g），WB為體質量（g）；WH為肝胰臟質量（g）；WI為腸道質量（g）；WS為脾臟質量（g）；LI為腸道長度；LB為體長（cm）。

基本營養(yǎng)成分：

水分采用105℃恒重法測定（GB／T6435-2006），粗蛋白采用杜馬斯燃燒法測定（Leco FP528，USA），粗脂肪采用索氏抽提法測定（GB／T6433-2006），粗灰分采用灰化法測定（GB／T6438-2007），能量采用氧彈儀燃燒法測定（Parr 6100，USA）［7］。

血清生化指標測定：

血清中谷丙轉氨酶（alanine amino transferase，ALT）、谷草轉氨酶（asparate amino transferase，AST）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TCHO）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）采用全自動生化分析儀測定（Hitachi7020，Japan），試劑購自北京利德曼生化股份有限公司。

血清生理指標測定：

血清中生長激素（growth hormone，GH）、皮質 醇 （cortisol， COS）、去 甲 腎 上 腺 素（noradrenaline，NE）、三碘甲狀腺原氨酸（three iodine thyroid，T3）、補體3（complement 3，C3）、免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、己糖激酶（hexokinase，HK）采用Elisa試劑盒測定（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）測定，測定方法及活力單位設定見文獻［7］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007和SPSS17.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），差異顯著時（P＜0.05），采用 Duncan氏檢驗進行多重比較分析。統(tǒng)計結果以平均值±標準差（Means±SD）的形式表示。

2 結果與分析

2.1 水解蛋白替代魚粉對大菱鲆幼魚生長及形體指標的影響

由表3可見，水解魚粉和水解大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉，均顯著降低了試驗魚的增重率、特定生長率和蛋白質效率（P＜0.05），提高了飼料系數(shù)（P＜0.05），但是對成活率無顯著性影響（P＞0.05）。水解魚粉組試驗魚的生長性能及飼料利用效率顯著高于水解大豆?jié)饪s蛋白組（P＜0.05）。

2018年11月8日下午3時，隨著汽笛聲傳來，由白俄羅斯開往重慶的第三趟傳化乳制品直達班列順利抵達團結村中心站。該班列由41個集裝箱組成，滿載白俄羅斯優(yōu)質乳制品，全程8000多公里，歷時12天。這是繼今年首趟重慶直達白俄羅斯班列開通后雙方的再一次深入合作，也是白俄羅斯到中國的首個整裝班列，當天舉行了隆重的接車活動。

水解魚粉和水解大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉后，對試驗魚的臟體比、肝體比、腸體比、腸長比均無顯著影響（P＞0.05），但降低了脾體比（P＜0.05）。水解大豆?jié)饪s蛋白組試驗魚肥滿度顯著高于其他組（P＜0.05）

2.2 水解蛋白替代魚粉對大菱鲆幼魚肌肉基本成分的影響

由表5可見，水解魚粉和水解大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉后顯著提高了試驗魚肌肉中水分含量（P＜0.05），降低了粗蛋白含量（P＜0.05），但是對粗脂肪及粗灰分含量無顯著影響（P＞0.05）。

表3 水解蛋白對大菱鲆幼魚生長的影響Tab．3 Effects of dietary hydro-protein on growth performance of S．maximus juveniles

2.3 水解蛋白替代魚粉對大菱鲆幼魚血清生化指標的影響

由表6可見，水解魚粉和水解大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉后，試驗魚血清中谷丙轉氨酶及谷草轉氨酶的活力有顯著升高（P＜0.05），總蛋白、白蛋白、甘油三酯、總膽固醇及高密度脂蛋白膽固醇含量均有了顯著降低（P＜0.05）。3組魚血清中低密度脂蛋白膽固醇含量無顯著差異（P＞0.05）。目前關于大菱鲆血清生化指標的報道相對較多，本實驗中所測得指標均在參考范圍之內。

表4 水解蛋白對大菱鲆幼魚形體指標的影響Tab．4 Effects of dietary hydro-protein on figure index of S．maximus juveniles

表5 水解蛋白對大菱鲆幼魚肌肉基本成分的影響Tab．5 Effects of dietary hydro-protein on muscle compositions of S．maximus juveniles（%wet weight）

表6 水解蛋白對大菱鲆幼魚血清生化指標的影響Tab．6 Effects of dietary hydro-protein on biochemical indices of serum of S．maximus juveniles

2.4 水解蛋白替代魚粉對大菱鲆幼魚血清生理指標的影響

由表7可見，水解魚粉及水解大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉后，試驗魚血清中生長激素、三碘甲狀腺原氨酸含量及己糖激酶活力均無顯著變化（P＞0.05）；水解魚粉組皮質醇含量顯著高于其他兩組（P＜0.05），補體3含量顯著低于其他兩組（P＜0.05），其他兩組之間無顯著差異（P＞0.05）；水解大豆?jié)饪s蛋白組去甲腎上腺素含量顯著低于其他兩組（P＜0.05），其他兩組之間無顯著差異（P＞0.05）；水解大豆?jié)饪s蛋白組免疫球蛋白M含量顯著高于魚粉組（P＜0.05），水解魚粉組與其他二組均無顯著差異（P＞0.05）；魚粉組丙酮酸激酶活力顯著高于大豆?jié)饪s蛋白組（P＜0.05），顯著低于水解魚粉組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 水解蛋白替代魚粉對大菱鲆幼魚生長、形體指標及體成分的影響

本實驗中，水解蛋白完全替代魚粉后，試驗魚的生長性能和飼料利用效率均有了顯著降低，這與其他研究者的報道較為一致［5-7］。目前關于水解蛋白的研究報道中，水解蛋白替代魚粉適宜比例為15%～76%，且在魚飼料中的替代量顯著高于蝦，過量添加則對實驗動物的生長有抑制作用［5，21］。但從本實驗結果來看，不同的蛋白水解物對實驗動物影響并不一致，水解魚粉蛋白的完全替代效果顯著優(yōu)于水解大豆?jié)饪s蛋白。蛋白質水解后會產生低分子量的肽，可以促進動物的攝食并降低消化吸收及合成過程中的能耗［22］，因此低濃度添加時，可以促進動物的生長；當飼料中低分子量肽含量過高時，會影響其他結構氨基酸的吸收，破壞蛋白質的氨基酸平衡，導致氨基酸氧化，從而降低動物的生長［23］。

目前，有研究報道水解蛋白對實驗動物的促生長作用與其中小肽的生物活性有關［24］。但蛋白質水解產生的小肽的結構和功能存在較大差異［25］，在水解過程中是否失活，穿越腸道屏障后是否存在生理活性［26］等均存在不確定性。本實驗中水解魚粉的替代效果優(yōu)于水解大豆?jié)饪s蛋白，這與它們的水解度及氨基酸組成（水解大豆?jié)饪s蛋白中蛋氨酸和賴氨酸含量較低）存在較大差異有關［1］，這也是造成二者之間生長存在差異的原因之一。因此，在水解蛋白的使用中，仍需進一步研究以確定其中的功能性或營養(yǎng)性成分的種類及含量。

水解蛋白的使用效果與水解蛋白的添加比例、來源及水解度有密切關系［3，21，27］。在相當多的研究報道中，水解蛋白替代魚粉對試驗魚的臟體比、肝體比、肌肉基本成分含量均無顯著影響［8，28］，本實驗結果與之較為一致。本實驗中，水解蛋白替代魚粉提高了肌肉中水分含量，間接降低了大菱鲆肌肉粗蛋白含量（粗蛋白含量占干物質的比例并沒有顯著變化），與對珍珠龍膽石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀ ×E.lanceolatus♂）的研究結果一致［21］。

表7 水解蛋白對大菱鲆幼魚血清生理指標的影響Tab．7 Effects of dietary hydro-protein on physiological indices of serum of S．maximus juveniles

3.2 水解蛋白替代魚粉對大菱鲆幼魚血清生化生理指標的影響

血清中谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶是評價機體肝臟功能的重要指標，雖然本實驗所測得酶活力在參考范圍之內，但水解蛋白替代魚粉顯著提高了二者的活力，表明水解蛋白給試驗魚肝臟造成了損傷［29］，且水解大豆?jié)饪s蛋白對肝臟的損傷高于水解魚粉。從本實驗的結果分析，水解蛋白引起大菱鲆肝臟損傷的原因可能與水解蛋白的水解度有關［23］，也與水解蛋白中氨基酸和實驗動物有關［6-7］。

血清總蛋白和白蛋白含量也是肝臟功能的重要指標之一，與機體的營養(yǎng)狀況密切相關［23］。本研究中，水解蛋白替代魚粉降低了試驗魚血清中總蛋白和白蛋白含量，這與在黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）［30］中的研究結果一致，但對草魚（Ctenoparyngodon idellus）［31］的研究表明，血清蛋白不受飼料組成的影響，這可能與飼料中蛋白質的形式有關。水解蛋白中含有豐富的小分子肽，其吸收與結構氨基酸不同步，從而降低了血清中蛋白含量。

血脂指標的變化反應了機體脂肪代謝的變化，血脂中的主要成分是甘油三酯和膽固醇，其中甘油三酯參與能量代謝，膽固醇則主要用于合成細胞漿膜、類固醇激素和膽汁酸。在已有的報道中，飼料中添加水解蛋白，影響了黃顙魚［30］、花鱸［8］、星斑川鰈［7］的血脂指標，但對黃顙魚［28］、褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）［32］的血脂指標均無影響。

本實驗所測的血清生理指標包含了激素、免疫及糖代謝3個方面，且攝食不同蛋白源對各方面的影響不盡相同。本研究中，不同蛋白原料對試驗魚的生長激素和三碘甲狀腺原氨酸含量均無顯著影響，但顯著影響了皮質醇和去甲腎上腺素的含量，表明水解蛋白對試驗魚造成了脅迫，但水解魚粉和水解大豆?jié)饪s蛋白對魚體造成脅迫的原因是不同的。補體3和免疫球蛋白M是魚體免疫能力的重要評價指標，其中補體3是抵抗微生物感染的重要物質，免疫球蛋白M具有強大的殺菌、激活補體、免疫調理和凝集作用。本實驗中，水解魚粉降低了試驗魚補體C3的含量，而水解大豆?jié)饪s蛋白提高了免疫球蛋白M的含量，表明二者影響魚體免疫能力機理的不同。己糖激酶和丙酮酸激酶是生物體糖代謝過程中的關鍵酶，其中己糖激酶專一性差、Km值低、易飽和，活力較難發(fā)生變化［33］；丙酮酸激酶活力的變化表明機體對糖利用能力的差異，也反應了機體供氧能力的差異。研究表明，飼料糖來源及含量［34］、環(huán)境脅迫［35］均能影響魚體丙酮酸激酶的活力。本實驗中不同飼料蛋白源對丙酮酸激酶活力的影響差異較大，這反應了不同蛋白源中功能性物質的差異。