李 想，黃文樹，黃 貝，徐繼松，翟少偉，梁 英，張婉婷，劉海姿

（1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門 361021；2.福建省特種水產(chǎn)配合飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福清 350308；3.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建廈門 361021）

Ⅱ型干擾素（interferon，IFN），即 IFN-γ，是一類二聚化的可溶性細(xì)胞因子，主要由T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌，具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用。IFN-γ還是一種多效能的細(xì)胞因子，能促使巨噬細(xì)胞活化、增加抗原遞呈作用、激活先天性免疫系統(tǒng)以及調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡［1］。

在哺乳動(dòng)物中，Ⅱ型干擾素只有一種類型，即 IFN-γ，由一個(gè)基因編碼［1］。與哺乳動(dòng)物不同的是，魚類的Ⅱ型干擾素存在2個(gè)IFN-γ基因，即IFN-γ1和 IFN-γ2，與哺乳動(dòng)物同源的 IFN-γ命名為IFN-γ2，而IFN-γ1與高等脊椎動(dòng)物同源性很低，所以又被命名為干擾素相關(guān)因子（IFN-γ related molecule，IFN-γrel）［2］。IFN-γrel首次在斑馬魚 （Danio rerio）和綠河豚 （Tetraodon nigirovirdis）中 被 發(fā) 現(xiàn)［3］。隨 后 在 大 西 洋 鮭（Salmo salar）［4］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［5］、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［6］、鯉（Cyprinus carpio）［7］、金 魚 （Carassius auratus）［8］、日 本 鯽（Carassius auratus langsdorfii）［9］、 草 魚（Ctenopharyngodon idella）［10］以 及 日 本 鰻 鱺（Anguilla japonica）［11］等魚類中均鑒定出兩個(gè)IFN-γ基因。與IFN-γ基因結(jié)構(gòu)不同的是 IFN-γrel基因的C端缺乏核定位信號(hào)（NLS）結(jié)構(gòu)域，這使其喪失了誘導(dǎo)趨化因子的能力［4］。在免疫原刺激下，斑馬魚IFN-γ和IFN-γrel基因在各組織中的表達(dá)水平有所不同，說明其功能可能存在差異［7，12］。有研究顯示硬骨魚類的兩個(gè) IFN-γ基因分別有其特異性的受體。在斑馬魚及金魚中發(fā)現(xiàn) 了 2個(gè) IFN-γR1基 因，即 IFN-γR1-1／CRFB17和 IFN-γR1-2／CRFB13，它們可以分別和不同的Ⅱ型干擾素配體結(jié)合。金魚的IFN-γR1-1特異性結(jié)合 IFN-γrel，IFN-γR1-2特異性結(jié)合IFN-γ［13］，說明 IFN-γrel的細(xì)胞信號(hào)途徑可能不同于 IFN-γ。已有的這些研究表明，IFN-γ和IFN-γrel的結(jié)構(gòu)、功能以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)存在差異。

有研究表明，魚類干擾素是通過類似哺乳動(dòng)物的JAK-STAT信號(hào)通路誘導(dǎo)ISGs的表達(dá)從而建立宿主抗病毒防御體系［14］。因此，魚類的Ⅱ型干擾素也能夠參與機(jī)體的抗病毒免疫。這些發(fā)現(xiàn)為探討魚類Ⅱ型干擾素的功能奠定了一定的基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步了解魚類Ⅱ型干擾素的功能特性，還需要在基因水平研究的基礎(chǔ)上完善蛋白質(zhì)水平的研究。但是目前對于魚類干擾素的應(yīng)用研究并不多見，且主要集中于I型干擾素，對魚類IFN-γ的研究較少，特別是對魚類中特有的Ⅱ型干擾素IFN-γrel的應(yīng)用研究幾乎沒有，導(dǎo)致對魚類兩種Ⅱ型干擾素基因的認(rèn)識(shí)非常有限。

日本鰻鱺（Anguilla japonica）是我國重要的名優(yōu)養(yǎng)殖水產(chǎn)品種類，隨著鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，各種病害也接踵而來。目前，對鰻鱺免疫系統(tǒng)的作用機(jī)制研究較少，對鰻鱺免疫相關(guān)基因也所知甚少。之前，筆者首次在日本鰻鱺中發(fā)現(xiàn)2個(gè)Ⅱ型干擾素基因的存在，本研究在此基礎(chǔ)上建立了日本鰻鱺IFN-γ和IFN-γrel基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，旨在進(jìn)一步對日本鰻鱺干擾素系統(tǒng)的功能及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，也為深入研究低等脊椎動(dòng)物Ⅱ型干擾素的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株與質(zhì)粒包括：pMD19-T載體購自TaKaRa公司（日本）；pQE30載體、pET32載體、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli M15以及Escherichia coli BL21（DE3）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑及耗材包括：Green Master Mix購自Promega公司（美國）；Gel Extraction Kit試劑盒、Plasmid Mini Kit I（200）試劑盒購自O(shè)MEGA公司（美國）；Sac I、BamH I和HindⅢ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase、DL 2000 Marker、DL 5000 Marker以及 Premixed Protein Marker（Low）購自 TaKaRa公司（日本）；預(yù)染蛋白 Marker和 HisPurTM Ni-NTA Spin Columns購自Thermo公司（美國）；histag Mouse Mcab和Goat anti-Mouse IgG-HRP購自Proteintech公司（美國）；PVDF膜購自Bio-rad公司（美國）；Ecl曝光液購自advansta公司（美國）；Temed、吐溫 20以及甲叉雙丙烯酰胺購自GENERAY公司（中國）；過硫酸銨購自aladdin公司（中國）；丙烯酰胺購自biosharp公司（中國）；考馬斯亮藍(lán)G-250購自MP公司（美國）；咪唑購自MACKLIN公司（中國）；透析袋購自 Solarbio公司（中國）；胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、Trisbase、SDS、甲醇、無水乙醇、異丙醇、冰醋酸、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉以及氯化鉀等其它常用試劑均為國藥分析純。

1.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)已獲得的日本鰻鱺IFN-γ和IFN-γrel基因的cDNA序列以及pQE30和pET32a多克隆位點(diǎn)，利用生物信息學(xué)軟件Primer Premier 6.0分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增IFN-γ的引物AJIFNg-F／AJIFNg-R和擴(kuò)增 IFN-γrel的引物 AJIFNgrel-F／AJIFNgrel-R，并分別在上游及下游引物中引入酶切位點(diǎn)。AJIFNg-F：CGAGCTCGACACCATATCTCAAAAAA T（下劃線部分為 Sac I酶切位點(diǎn)），AJIFNg-R：CCCAAGCTTGACCCTGCCTC（下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)）；AJIFNgrel-F：CGGATCCAACTCCCC GCTCGTCCTGG（下劃線部分為 BamH I酶切位點(diǎn)），AJIFNgrel-R：CAAGCTTGTCGGACAGTGAAT CAGTCAGCC（下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)）。

分別以日本鰻鱺IFN-γ和IFN-γrel的重組質(zhì)粒 pMD19-T-IFN-γ和 pMD19-T-IFN-γrel為模板擴(kuò) 增，以 AJIFNg-F／AJIFNg-R 和 AJIFNgrel-F／AJIFNgrel-R為上下游引物。IFN-γ擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。IFN-γrel擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進(jìn)行膠回收。將IFN-γPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pQE30分別于37℃進(jìn)行SacⅠ和HindⅢ水浴雙酶切，IFN-γrel PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET32a分別于37℃水浴進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，利用氨芐青霉素和卡那霉素雙抗性平板篩選IFN-γ重組質(zhì)粒陽性克隆，利用氨芐青霉素抗性平板篩選IFN-γrel重組質(zhì)粒陽性克隆。IFN-γ及 IFN-γrel重組質(zhì)粒陽性克隆分別用pQE30通用引物和pET32a通用引物經(jīng)PCR鑒定后送通用生物技術(shù)有限公司測序，其中pQE30與pET32a通用引物序列分別為pQE30-F：TGAGCGGATAACAATTTC AC， pQE30-R： GTTCTGAGGTCATTACTGG；pET32a-F：TAATACGACTCACTATAGG，pET32a-R：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG。測序正確的陽性重組質(zhì)粒分別命名為pQE30-IFN-γ和pET32a-IFN-γrel。

1.3 原核表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化與表達(dá)形式的鑒定

將重組質(zhì)粒 pQE30-IFN-γ轉(zhuǎn)化至 E.coli M15，重組質(zhì)粒 pET32a-IFN-γrel轉(zhuǎn)化至 E.coli BL21（DE3），37℃培養(yǎng)過夜，挑取重組質(zhì)粒pQE30-IFN-γ陽性菌落轉(zhuǎn)接至40 mL含氨芐青霉素和卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，挑取重組質(zhì)粒pET32a-IFN-γrel陽性菌落轉(zhuǎn)接至40 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)過夜。當(dāng)菌液 OD200達(dá)到0.6左右時(shí)，于37℃誘導(dǎo)溫度下，測定以不同誘導(dǎo)劑濃度（0.2、0.5、1.0、2.0 mmol·L-1IPTG）、不同誘導(dǎo)時(shí)間（2、4、6 h）誘導(dǎo) IFN-γ蛋白表達(dá)工程菌表達(dá)重組蛋白的表達(dá)量。測定以1.0 mmol·L-1IPTG分別誘導(dǎo) IFN-γrel蛋白表達(dá)工程菌2、4、6 h時(shí)表達(dá)重組蛋白的表達(dá)量。收集菌液并用PBS重懸，SDS-PAGE電泳鑒定重組蛋白表達(dá)量。同時(shí)設(shè)置空載體即未加IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒作為對照。

在最佳誘導(dǎo)條件下收集表達(dá)菌液，10 000×g離心5 min，棄上清液，用30 mL PBS重懸菌體，于4℃下進(jìn)行超聲波裂解（工作6 s間隔9 s），13 000×g離心5 min。分別收集上清液和沉淀，取少量樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，鑒定重組蛋白的表達(dá)形式。

1.4 IFN-γrel目的蛋白的變復(fù)性處理

選擇最佳條件誘導(dǎo)IFN-γrel表達(dá)工程菌，收集沉淀；用事先預(yù)冷的PBS重懸沉淀，加入適當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿㏄MSF，4℃超聲波裂解（工作6 s間隔9 s），13 000×g離心 5 min，收集沉淀；加入10 mL含4 mol·L-1尿素的變性液洗滌沉淀2次，再加入10 mL含8 mol·L-1尿素的蛋白變性液，4℃震蕩過夜，徹底溶解包涵體；次日將收集的蛋白變性液放入處理好的透析袋中，移至含4 mol·L-1尿素的透析液中，期間更換透析液，使變性液中8 mol·L-1的尿素逐步降低至4、2、1 mol·L-1，最后用pH8.0的PBS透析2次，將溶液中的尿素全部去除完成復(fù)性。

1.5 目的蛋白的分離純化及Western blot鑒定

將IFN-γ表達(dá)工程菌上清液和復(fù)性好的IFN-γrel重組蛋白溶液分別過 HisPurTMNi-NTA Spin Columns純化目的蛋白。IFN-γ目的蛋白純化步驟：首先加入 6 mL平衡緩沖液（20 mmol·L-1磷酸鈉、500 mmol·L-1氯化鈉、10 mmol·L-1咪唑各 2 mL，pH8.0）平衡柱子，重復(fù)操作1次；向柱子內(nèi)加入IFN-γ表達(dá)工程菌上清液，4℃結(jié)合30 min，使樣品在重力的作用下緩慢流出，收集流出液；將收集的流出液再加入柱子內(nèi)，重復(fù)過柱1次；加入6 mL洗滌緩沖液（20 mmol·L-1磷酸鈉、500 mmol·L-1氯化鈉、25 mmol·L-1咪唑各 2 mL，pH8.0）洗滌柱子，重復(fù)洗柱 2次；而后加入 3 mL洗脫緩沖液（20 mmol·L-1磷酸鈉、500 mmol·L-1氯化鈉、250 mmol·L-1咪唑各 1 mL，pH 8.0），收集洗脫液，并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測。純化IFNγ-rel目的蛋白使用的緩沖液為將上述緩沖液中的氯化鈉濃度置換為300 mmol·L-1，其余試劑及其濃度不改變，純化步驟同IFN-γ。

將純化的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。電泳后，以300 mA 70 min轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，然后將PVDF膜置于封閉液中浸泡1 h，清洗后加入 his-tag Mouse Mcab（稀釋濃度1∶1 000），4℃孵育過夜，加入Goat anti-Mouse IgG-HRP（稀釋濃度1∶10 000）室溫孵育1 h。各步驟之間用TBST（Washing Buffer）清洗 3次，每次各 20 min。最后將PVDF膜放入避光處加Ecl顯色液，2 min后置凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體的鑒定

以重組質(zhì)粒 pMD19-T-IFN-γ作為模板，以AJIFNg-F和AJIFNg-R為上下游引物，PCR擴(kuò)增IFN-γ基因成熟肽編碼序列，結(jié)果如圖1-A所示，在約464 bp處有一條特異性條帶，與預(yù)期大小基本一致。以重組質(zhì)粒 pMD19-T-IFN-γrel作為模板，以AJIFNgrel-F和AJIFNgrel-R為上下游引物，PCR擴(kuò)增IFN-γrel基因成熟肽編碼序列，結(jié)果如圖1-B所示，在約440 bp處有一條特異性條帶，與預(yù)期大小符合。表明已分別擴(kuò)增出IFN-γ和IFN-γrel基因的成熟肽編碼序列。

圖1 IFN-γ和IFN-γrel基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig．1 PCR amplification results of IFN-γand IFN-γrel

挑取單克隆做陽性克隆鑒定，結(jié)果如圖2所示，回收片段比成熟肽編碼序列多100 bp左右，初步判斷IFN-γ和IFNγ-rel成熟肽編碼序列分別與載體連接成功。將重組質(zhì)粒測序，結(jié)果表明重組表達(dá)載體 pQE30-IFN-γ和 pET32a-IFN-γrel構(gòu)建成功。

2.2 重組表達(dá)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

將重組表達(dá)載體 pQE30-IFN-γ轉(zhuǎn)化至 E.coli M15，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖3所示，與pQE30空載體相比，重組質(zhì)粒pQE30-IFN-γ在M15中有明顯的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白條帶，大小在21 kD左右，與預(yù)計(jì)算的理論分子量（20.5 kD）相似，初步判斷已誘導(dǎo)表達(dá)出IFN-γ目的蛋白。分別測定4個(gè)IPTG誘導(dǎo)濃度以及不同誘導(dǎo)時(shí)間對重組蛋白表達(dá)量的影響，發(fā)現(xiàn)pQE30-IFN-γ在IPTG濃度為1.0 mmol·L-1時(shí)表達(dá)量最高，并且表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加，即1.0 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)6 h時(shí)表達(dá)量最高。

圖2 p QE30-IFN-γ和 pET32a-IFN-γrel重組載體的陽性克隆鑒定Fig．2 Identification of positive clones of pQE30-IFN-γand p ET32a-IFN-γrel recombinant vectors

將重組表達(dá)載體pET32a-IFN-γrel轉(zhuǎn)化至E.coli BL21，經(jīng)1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖4所示，與pET32a空載體相比，重組質(zhì)粒pET32a-IFN-γrel在BL21中有明顯的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白條帶，大小在31 kD左右，與預(yù)計(jì)算的理論分子量（34 kD）相似，故初步判斷已誘導(dǎo)表達(dá)出IFN-γrel目的蛋白。與未誘導(dǎo)的IFN-γrel蛋白表達(dá)工程菌相比，誘導(dǎo)0～6 h內(nèi)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，蛋白表達(dá)量越高，即誘導(dǎo)6 h為最優(yōu)時(shí)間。

2.3 重組蛋白表達(dá)形式的鑒定

取表達(dá)菌體超聲波破碎裂解后，分離上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果顯示，重組表達(dá)pQE30-IFN-γ蛋白大部分以可溶性蛋白的形式存在于破碎菌體的上清液中（圖5-A），而重組表達(dá)pET32a-IFN-γrel蛋白大部分以包涵體蛋白的形式存在于破碎菌體的沉淀中（圖5-B）。

圖3 不同誘導(dǎo)條件對pQE30-IFN-γ在E．coli M15中表達(dá)的影響Fig．3 Influence of different induction conditions on expression of pQE30-IFN-γin E．coli M15

圖4 不同誘導(dǎo)時(shí)間對pET32a-IFN-γrel在E．coli BL21中表達(dá)的影響Fig．4 Influence of different induction time on expression of pET32a-IFN-γrel in E．coli BL21

2.4 重組蛋白的純化和Western blot分析結(jié)果

采用鎳離子親和層析柱純化目的蛋白。收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢查，結(jié)果顯示，在IFN-γ表達(dá)工程菌破碎后的上清液中純化得到IFN-γ融合蛋白，大小約為21 kD（圖6-A），在復(fù)性好的IFN-γrel表達(dá)工程菌破碎后的沉淀中純化得到 IFNγ-rel融合蛋白，大小約為31 kD（圖6-B）。兩者均為單一條帶，說明經(jīng)過純化步驟獲得的重組蛋白純度較高。

將純化得到的目的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果表明，與空載體相比，表達(dá)產(chǎn)物泳道顯示為陽性條帶，即帶有His標(biāo)簽的重組蛋白IFN-γ和 IFN-γrel得到表達(dá)（圖7）。

3 討論

圖5 pQE30-IFN-γ和pET32a-IFN-γrel重組蛋白表達(dá)形式鑒定Fig．5 Identification of protein expression patterns of pQE30-IFN-γ and pET32a-IFN-γrel recombinant proteins

圖6 純化的 IFN-γ和 IFN-γrel重組蛋白SDS-PAGE分析Fig．6 SDS-PAGE analysis of purified IFN-γ and IFN-γrel recombinant proteins

圖7 IFN-γ和 IFN-γrel重組蛋白Western blotting鑒定結(jié)果Fig．7 Identification results of IFN-γand IFN-γrel recombinant proteins by Western blotting

目前，哺乳動(dòng)物和禽類的重組IFN-γ蛋白已得到廣泛研究和利用。崔然［15］構(gòu)建了豬 IFN-γ基因的原核表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)重組蛋白具有抵抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒和水泡性口炎病毒的能力。王立紅等［16］成功利用E.coli M15感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)出具有生物活性的雞IFN-γ。然而，有關(guān)魚類基因工程干擾素制劑的研究并不多見。ZOU等［17］將重組虹鱒IFN-γ蛋白對巨噬細(xì)胞進(jìn)行刺激，重組蛋白能刺激IFN-γ信號(hào)通路下游基因的表達(dá)。GRAYFER等［8］發(fā)現(xiàn)金魚重組IFN-γ蛋白刺激后的巨噬細(xì)胞能增強(qiáng)吞噬作用。此外，重組IFN-γ蛋白還能刺激一些促炎癥因子（如：TNFα-1、TNFα-2等）的表達(dá)。IFN-γrel是硬骨魚特有的基因，對于此基因的報(bào)道很少，而對其應(yīng)用研究幾乎沒有。目前僅見鱖（Siniperca chuatsi）IFN-γrel重組蛋白應(yīng)用的報(bào)道，其能夠誘導(dǎo)免疫相關(guān)基因Mx、IRF1、STAT1等的表達(dá)上調(diào)，可作為魚類免疫增強(qiáng)劑或者免疫佐劑［18］。為了深入研究干擾素基因的功能，在基因水平研究的基礎(chǔ)上通過基因重組技術(shù)進(jìn)一步完善蛋白質(zhì)水平的研究是有必要的。

融合表達(dá)載體是目前原核表達(dá)系統(tǒng)中常用的基因工程載體。由于pET表達(dá)載體系統(tǒng)含有的his-tag是一個(gè)廣泛應(yīng)用于親和層析的標(biāo)簽，并根據(jù)已有的關(guān)于魚類IFN-γ重組蛋白表達(dá)的研究報(bào)道，在選擇載體時(shí)，筆者首先使用高效融合表達(dá)載體pET32a來構(gòu)建2個(gè)Ⅱ型干擾素重組質(zhì)粒。將IFN-γrel成熟肽編碼序列克隆至原核表達(dá)載體 pET32a上，成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET32a-IFN-γrel，并在 E.coli BL21中得到表達(dá)，說明所選pET32a載體和IFN-γrel宿主表達(dá)菌是合適的。但在實(shí)驗(yàn)中，重組載體pET32a-IFN-γ表達(dá)的蛋白與預(yù)測不符，未能正確表達(dá)，后嘗試優(yōu)化培養(yǎng)條件，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)證明重組pET32a質(zhì)粒無法表達(dá)出IFN-γ重組蛋白，所以改為選用帶有6個(gè)his標(biāo)簽的pQE30質(zhì)粒作為表達(dá)載體，以E.coli M15作為宿主菌，最終成功表達(dá)出IFN-γ蛋白。

對動(dòng)物干擾素進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，除了基因本身的序列影響表達(dá)量外，誘導(dǎo)表達(dá)條件（如誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑濃度等）同樣重要［19］。因此，有必要對原核表達(dá)條件進(jìn)行摸索。蔡梅紅等［20］對雞IFN-γ陽性大腸桿菌宿主菌的不同誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了對比研究，確定了4 h為最佳的誘導(dǎo)時(shí)間。馬普等［21］對重組載體的最佳表達(dá)條件進(jìn)行了探索，最終確定了重組紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）IFN-γ蛋白在 IPTG為 1.0 mmol·L-1、37℃條件下誘導(dǎo)6 h時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量。在本研究中發(fā)現(xiàn)通過調(diào)整不同的IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，日本鰻鱺IFN-γ和IFN-γrel在1.0 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)6 h時(shí)表達(dá)量最高。

外源基因表達(dá)量低以及易形成包涵體是外源基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)常見的難題。據(jù)估計(jì)，有15%～20%是可溶性蛋白，大約20%～40%是包涵體蛋白，剩余的可能在表達(dá)過程中有降解或者不表達(dá)。獲得可溶性蛋白可以避免蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性，便于今后對蛋白活性的研究。因此，在大腸桿菌中進(jìn)行外源基因表達(dá)時(shí)首先要考慮改善和優(yōu)化影響外源基因可溶性表達(dá)的因素，如表達(dá)菌株、表達(dá)載體、培養(yǎng)基的組成及培養(yǎng)條件等［22］。有研究表明，在高水平表達(dá)時(shí)，新生肽鏈聚集速率一旦超過蛋白折疊的速率就會(huì)導(dǎo)致包涵體的形成，而表達(dá)量低則利于產(chǎn)生可溶性表達(dá)［23］。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)IFN-γ蛋白呈現(xiàn)可溶性表達(dá)，但蛋白表達(dá)量卻不高。而IFN-γrel蛋白則以包涵體形式表達(dá)，且獲得了高效表達(dá)，這也是包涵體存在的一個(gè)優(yōu)勢，即高效的表達(dá)易于從宿主細(xì)胞中純化［24］。

HisPurTMNi-NTA Spin Columns是以預(yù)掛Ni2+電荷的形式提供的。蛋白和金屬離子之間的結(jié)合強(qiáng)度受幾種因素影響，包括長度、位置、親和標(biāo)記在蛋白中的暴露程度、所用離子的類型以及緩沖液的pH等。在純化IFN-γ蛋白的過程中，根據(jù)蛋白的等電點(diǎn)，筆者最初選擇pH值為7.4的平衡、洗滌及洗脫緩沖液，但在收集的平衡和洗滌穿透液中檢測到大量目的蛋白，說明目的蛋白和Ni2+未能有效結(jié)合，純化效果不理想。所以筆者通過改變緩沖液的pH值（比較了7.4、8.0和8.5等3個(gè)pH值）來優(yōu)化純化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在緩沖液pH值為8.0的條件下，獲得了較高純度和較高產(chǎn)量的目的蛋白。咪唑的濃度在重組蛋白純化過程中起著十分重要的作用［25］。低濃度咪唑能夠減少宿主細(xì)胞中其它蛋白質(zhì)與Ni2+的非特異性結(jié)合，所以，通常在平衡和洗滌緩沖液中采用低濃度的咪唑。筆者在實(shí)驗(yàn)中選擇了10～25 mmol·L-1的咪唑配制平衡洗滌緩沖溶液。高濃度咪唑則有利于洗脫目的蛋白。本實(shí)驗(yàn)采用250 mmol·L-1咪唑進(jìn)行洗脫達(dá)到了較好的純化效果。而參照純化IFN-γ蛋白的條件對IFN-γrel蛋白進(jìn)行純化時(shí)發(fā)現(xiàn)在洗脫液中僅收集到非常少的目的蛋白，因此改變了緩沖液中氯化鈉的濃度，將氯化鈉濃度從500 mmol·L-1降低至300 mmol·L-1，結(jié)果回收到的目的蛋白量明顯增加。這是因?yàn)橄疵撘旱膒H值和鹽度是影響蛋白質(zhì)和金屬螯合配體間作用力的主要因素［26］。在蛋白純化過程中加入中性鹽（如氯化鈉）能影響蛋白質(zhì)的溶解度。一般蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨著鹽度的升高而增加，當(dāng)鹽度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度出現(xiàn)不同程度下降并先后析出，而且不同的蛋白質(zhì)純化時(shí)其洗脫體系存在不同的合適鹽度條件。故推測IFN-γrel蛋白在500 mmol·L-1氯化鈉的緩沖液體系中發(fā)生了一定的鹽析作用，導(dǎo)致蛋白的損耗。

采用His標(biāo)簽抗體對誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白進(jìn)行的Western blot檢測，結(jié)果表明重組載體按照正確的翻譯框架翻譯并成功表達(dá)。