侯高超 劉現(xiàn)立 劉怡文 原 翔 顧晨文

直腸癌是人類消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)生率和病死率呈逐年上升趨勢[1,2]。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(lysine-specific demethylase 1，LSD1)也被稱作KDM1、AOF2、KIAA0601、BCH110、CPRF等，由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即胺氧化酶結(jié)構(gòu)域、FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域和SWIRM結(jié)構(gòu)域。目前研究發(fā)現(xiàn)LSD1與多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[3，4]，但是關(guān)于LSD1對直腸癌干細(xì)胞的影響國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，LSD1在直腸癌組織中表達(dá)顯著高于其相應(yīng)癌旁組織，然而 LSD1在直腸癌腫瘤干細(xì)胞(CSCs)表型及惡性生物學(xué)行為中是否發(fā)揮重要調(diào)控作用尚不明確。因此，本課題旨在通過研究LSD1對直腸癌CACO-2細(xì)胞侵襲能力的影響，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)，為直腸癌靶向治療提供潛在的分子靶點(diǎn)。

材料與方法

1.細(xì)胞與主要試劑：人直腸癌細(xì)胞系CACO-2購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，LSD1抗兔單克隆抗體購自英國Abcam公司，GAPDH 抗兔多克隆抗體購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，DMSO購自美國Gibco公司，BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，DAB顯色試劑盒購自索萊寶公司，MEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：CACO-2的培養(yǎng)液為20%胎牛血清,青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的 MEM 培養(yǎng)液均購自美國 Gibco公司，并置于 37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為 5%的飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。

3.建立穩(wěn)定敲降LSD1的直腸癌細(xì)胞系：實(shí)驗(yàn)分為兩組，即熒光對照組及LSD1敲降組。常規(guī)培養(yǎng)293T細(xì)胞，密度至50%～60%時(shí)，開始轉(zhuǎn)染。配制“DNA質(zhì)粒-EndoFectin”混合物，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集病毒。目的細(xì)胞鋪板，轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。目的細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒后，需每天在熒光顯微鏡下觀察熒光信號。待視野中大部分細(xì)胞都帶有熒光時(shí)，開始用嘌呤霉素或潮霉素(根據(jù)說明書中抗性決定)對目的細(xì)胞進(jìn)行篩選。

4.LSD1蛋白的Western blot法檢測：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，加入適量蛋白裂解液(美國Invitrogen公司)，離心后取上清為蛋白提取物，BCA法進(jìn)行蛋白定量。用12%SDS-聚丙酰胺凝膠進(jìn)行蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉PVDF膜(美國密理博公司)1h，加LSD1抗兔單克隆抗體(稀釋度1∶1000，美國CST公司)或內(nèi)參GAPDH抗兔多克隆抗體(稀釋度1∶2000，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)4℃過夜，以HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體室溫孵育2h，使用顯影劑處理PVDF膜后用凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)檢測目的蛋白條帶，應(yīng)用ImageLab軟件對蛋白條帶灰度值進(jìn)行測定，并以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值比值進(jìn)行定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔取平均值。

5.LSD1mRNA的Q-PCR法檢測：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，Trizol法提取mRNA，將提好的mRNA直接反轉(zhuǎn)錄，或于-80℃冰箱保存，檢測mRNA濃度和質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄(cDNA合成)，根據(jù)人的LSD1 cDNA序列設(shè)計(jì)PCR引物,將干粉引物4℃，12000r/min離心3min，稀釋引物終濃度為0.3μmol/L可以在大多數(shù)體系中獲得良好擴(kuò)增效果，配制實(shí)時(shí)熒光定量Q-PCR反應(yīng)體系，實(shí)時(shí)熒光定量Q-PCR，結(jié)果分析，設(shè)定合適的熒光強(qiáng)度閾值，將每孔樣品對應(yīng)的Ct值導(dǎo)入Bio-Rad公司開發(fā)的Gene Expression Analysis軟件，各樣本的目的基因擴(kuò)增量與GAPDH基因擴(kuò)增量的比較采用2-ΔΔCt法進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔取平均值。

6.細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)：取對數(shù)生長期的細(xì)胞,將細(xì)胞消化并制成單細(xì)胞懸液，以1×105個(gè)/毫升接種于無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，克隆形成，終止培養(yǎng)，計(jì)數(shù)肉眼可見的克隆數(shù)，可采用t檢驗(yàn)，分析各組之間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔取平均值。

7.Aldefluor實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期的目的細(xì)胞(每組細(xì)胞數(shù)為106個(gè))，每組各加入100μl PBS，根據(jù)CD133-PE試劑說明，再加入10μl CD133-PE(11∶1)，4℃避光反應(yīng)15min，PBS洗滌后離心(1000r/min)1次，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/毫升，每個(gè)Ep管共500μl細(xì)胞懸液，對照組為同樣方法處理的不加CD133-PE的細(xì)胞懸液，各組細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分別進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔取平均值。

8.Tanswell實(shí)驗(yàn)： 取對數(shù)生長期細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸后調(diào)整細(xì)胞密度，然后將細(xì)胞懸液于小室中。實(shí)驗(yàn)分為對照組、轉(zhuǎn)染組和抑制劑組，培養(yǎng)12～48h后，擦去上室內(nèi)細(xì)胞，4%甲醛室溫固定1～2h，4g/L結(jié)晶紫染液，倒置顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)，各組均選10個(gè)視野，于倒置相差顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)并照相。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔取平均值。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：運(yùn)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用配對樣本t檢驗(yàn)對各組間LSD1蛋白表達(dá)、mRNA表達(dá)、干細(xì)胞比例及侵襲能力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.建立直腸癌CACO-2-LSD1敲降穩(wěn)定細(xì)胞系：為驗(yàn)證LSD1在直腸癌干性維持的調(diào)控作用，通過慢病毒載體包裝建立CACO-2-LSD1敲降穩(wěn)定細(xì)胞系(攜帶綠色熒光)和1株GFP熒光對照細(xì)胞系(圖1)。

圖1 建立直腸癌CACO-2-LSD1敲降穩(wěn)定細(xì)胞系(熒光染色，×200)

2.Western blot法檢測LSD1蛋白敲降效率：將構(gòu)建出的CACO-2-LSD1敲降穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行Western blot法實(shí)驗(yàn),檢測LSD1蛋白的表達(dá)水平，通過Image J軟件對蛋白電泳條帶灰度值進(jìn)行定量分析，敲降組的LSD1蛋白表達(dá)顯著受到抑制(t=37.00,P=0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖2 Western blot法檢測LSD1蛋白敲降效率

3.Q-PCR 檢測LSD1 mRNA敲降效率：將構(gòu)建CACO-2-LSD1敲降穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行Q-PCR實(shí)驗(yàn)，檢測LSD1 mRNA表達(dá)水平，并對mRNA進(jìn)行定量分析，從檢測中發(fā)現(xiàn)CACO-2-LSD1敲降組的LSD1mRNA表達(dá)量較熒光對照組顯著降低(t=13.00,P=0.006)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖3 Q-PCR 檢測LSD1 mRNA敲降效率

4.細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果:通過細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測LSD1對直腸癌CACO2克隆成球能力的影響。發(fā)現(xiàn)CACO-2-LSD1敲降組(t=19.00,P=0.003)與CACO-2-LSD1抑制劑-RN1組 (t=37.00,P=0.001)克隆成球能力顯著低于熒光對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖4 LSD1對直腸癌CACO-2克隆成球能力的影響(熒光染色，×200)A.CACO-2-熒光對照組;B.CACO-2-LSD1抑制劑組;C.CACO-2-LSD1敲降組;D.LSD1對直腸癌CACO-2克隆成球能力的對比柱狀圖

5.Aldeflour實(shí)驗(yàn)結(jié)果:采用Aldeflour實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測LSD1對直腸癌細(xì)胞CACO-2干細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)CACO-2-LSD1敲降組 (t=38.50,P=0.001)與CACO-2-LSD1抑制劑-RN1組 (t=18.03,P=0.003)干細(xì)胞比例顯著低于熒光對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

6.Tanswell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果:采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測LSD1對直腸癌細(xì)胞系CACO-2侵襲能力的影響(24h)。CACO-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，消化、重新懸浮后進(jìn)行Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，并對穿過膜的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)CACO-2-LSD1敲降組 (t=30.43,P=0.001)與CACO-2-LSD1抑制劑-RN1組(t=35.50,P=0.001)體外侵襲能力顯著低于熒光對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。

討 論

組蛋白去甲基化酶 LSD1能夠特異性催化賴氨酸去甲基，通過多種途徑參與調(diào)控基因的表達(dá)，在大部分腫瘤形成的過程中起著促進(jìn)作用,研究表明，LSD1與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，不同腫瘤細(xì)胞的LSD1表達(dá)明顯差異，發(fā)揮的作用也不同[5]。

圖5 SD1對直腸癌CACO-2干細(xì)胞的影響

圖6 LSD1對直腸癌細(xì)胞系CACO-2侵襲能力的影響(熒光染色，×200)A.CACO-2-熒光對照組;B.CACO-2-LSD1敲降組;C.CACO-2-LSD1抑制劑-RN1組;D.LSD1對直腸癌細(xì)胞系CACO-2侵襲能力的對比柱狀圖

LSD1在腫瘤干細(xì)胞(CSCs)/胚胎干細(xì)胞(ESCs)、神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)自我更新和多潛能性維持中皆扮演著重要的角色[6～10]。大量研究均已證實(shí)，LSD1在白血病、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、膀胱癌干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用[3,11,12]。

研究顯示，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，LSD1 shRNA可使LSD1的表達(dá)下降，同時(shí)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LoVo細(xì)胞穿過膜的數(shù)量也明顯減少，這說明抑制LSD1的表達(dá)可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，提示LSD1的高表達(dá)可能與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移侵襲能力存在密切聯(lián)系。還有通過LSD1抑制劑抑制LSD1活性并下調(diào)胃癌細(xì)胞中LSD1蛋白的表達(dá)水平，可抑制胃癌細(xì)胞的浸潤及轉(zhuǎn)移。Kashyap等研究發(fā)現(xiàn)LSD1在前列腺癌中表達(dá)升高，并證明LSD1的過表達(dá)可促進(jìn)促血管生成通路的活性升高。除上述研究外，隨著對LSD1研究的深入，越來越多的研究報(bào)道了LSD1在多種腫瘤中存在高表達(dá)，并調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。然而，目前關(guān)于直腸癌腫瘤干細(xì)胞的研究尚未見類似報(bào)道，本課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，LSD1蛋白表達(dá)主要位于直腸腺癌細(xì)胞胞核，且隨著分化程度的降低染色強(qiáng)度逐漸加強(qiáng)；LSD1蛋白表達(dá)陽性患者生存期顯著低于陰性患者。

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)是一類存在于腫瘤中的，具有高度自我更新和異常分化潛能的細(xì)胞亞群。CSCs具有很多特殊表型，如抗凋亡因子的異常表達(dá)，含有多種藥物泵分子，DNA自我修復(fù)能力較高，對抗外界毒素的能力。CSCs的這些特性很可能與腫瘤目前的耐受性有關(guān)。CSCs在化療后存活下來，為復(fù)發(fā)埋下隱患。有效地減少腫瘤中的CSCs，可以減少耐受性的存在，并且成為降低復(fù)發(fā)率、抵抗耐藥、改善預(yù)后的關(guān)鍵突破口。以胚胎干細(xì)胞(ESCs)和神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)為模型，近年來干細(xì)胞的定向分化和自我維持的表觀遺傳調(diào)控已成為研究熱點(diǎn)[13]。以表觀遺傳學(xué)為基礎(chǔ)的新方案得到更多人的關(guān)注。表觀遺傳藥與傳統(tǒng)化療藥物相結(jié)合，有望成為緩解化療耐藥的新途徑。目前在美國已有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和組蛋白去乙酰化酶抑制劑上市，并且用于腫瘤的治療。

本研究通過構(gòu)建LSD1敲降的直腸癌CACO-2穩(wěn)定細(xì)胞系，經(jīng)Western blot法及Q-PCR法驗(yàn)證LSD1蛋白表達(dá)mRNA表達(dá)均顯著受到抑制；經(jīng)克隆成球與流式細(xì)胞術(shù)(Aldefluor)顯示抑制LSD1蛋白可顯著減少CACO-2干細(xì)胞比例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 經(jīng)Transwell顯示抑制LSD1蛋白可顯著抑制CACO-2侵襲能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，本研究證實(shí)抑制LSD1蛋白表達(dá)可顯著降低直腸癌CACO-2細(xì)胞系體外侵襲能力，抑制LSD1可能是直腸癌靶向治療的潛在分子靶點(diǎn)之一。同時(shí)本研究為進(jìn)一步設(shè)計(jì)和合成新型LSD1家族組蛋白去甲基化酶抑制劑的研發(fā)提供了有意義的實(shí)驗(yàn)參考，為尋求新的直腸癌治療策略提供依據(jù)。