LDLR基因突變致家族性高膽固醇血癥家系分析

劉 軍 劉 芳

家族性高膽固醇血癥 (familial hypercholesterol-emia，F(xiàn)H)是一種以血漿總膽固醇(total cholesterol，TC) 和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C) 水平增高，機(jī)體不同部位皮膚/肌腱散發(fā)大小不等的黃色瘤、早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、早發(fā)冠心病為特征的常染色體遺傳性疾病, FH有雜合子型和純合子型兩種，發(fā)生率約1/500～1/200和1/30萬～1/16萬[1～3]。雜合子型主要是低密度脂蛋白受體(low density lip-oprotein receptor，LDL-R)、載脂蛋白 B(apolipoproteinB，ApoB)、枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶 9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)的功能改變，純合子型主要是 LDL-R 銜接因子蛋白 1(low density lipopro-tein receptor adaptor protein 1，LDLRAP1)功能改變所致[4]。

本研究報(bào)道了一個(gè)高膽固醇血癥家系4例患者的臨床表現(xiàn)、生化檢測(cè)及基因測(cè)定結(jié)果，證實(shí)該家系患者均存在LDL-R基因突變，現(xiàn)報(bào)道如下。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象:先證者：4歲，女性，因發(fā)現(xiàn)身體不同部位皮膚出現(xiàn)大小不等的黃色凸起物就診?；純合礕3P2，孕40周順產(chǎn)娩出，羊水、胎盤、臍帶無異常，阿氏評(píng)分1、5、10min均為10分，無窒息搶救史。出生后母乳喂養(yǎng)，母自訴患兒平素身體健康，飲食無特殊嗜好。大約半年前患兒四肢皮膚多處出現(xiàn)深淺及大小不一的黃色凸起物，壓之不退色，不伴發(fā)熱，無心前區(qū)不適。無母孕期射線和服藥物史，患兒有一個(gè)姐姐11歲，一個(gè)弟弟1歲，二人體健，無皮膚黃色凸起物。父母非近親婚配，否認(rèn)有遺傳病家族史。先證者入院查體：生命體征平穩(wěn)，神志清，體重18kg，身高1.1m, 呼吸平穩(wěn)，雙肺聽診無異常，心音有力，無雜音，腹部脊柱無異常，雙腿膝關(guān)節(jié)屈側(cè)肌腱處、小腿踝關(guān)節(jié)伸側(cè)屈側(cè)肌腱處、雙肘關(guān)節(jié)屈側(cè)肌腱處可見大小不一的黃色瘤(圖1), 雙眼有明顯角膜弓,心電圖、超聲心動(dòng)圖正常。血TC 16.40mmol/L，高于正常3倍余，LDL-C 15.06mmol/L，高于正常近5倍，載脂蛋白B 2.78g/L高于正常2倍余(表1)。其他成員： 先證者父母、弟弟皮膚或肌腱未發(fā)現(xiàn)黃色瘤，也無其他臨床癥狀。心電圖、心臟彩超正常，但3個(gè)人血TC、LDL-C、載脂蛋白B均有不同程度的增高，只是增高幅度低于先證者。先證者姐姐臨床無癥狀，上述指標(biāo)也無增高。

圖1 先證者踝關(guān)節(jié)伸側(cè)屈側(cè)肌腱附近、肘關(guān)節(jié)肌腱處、膝關(guān)節(jié)肌腱處大小不一的黃色瘤A.伸側(cè)肌腱附近；B.屈側(cè)肌腱附近；C.肘關(guān)節(jié)肌腱處；D.腱關(guān)節(jié)肌腿處

表1 先證者一家5口年齡、身高、體重及血脂檢測(cè)水平

2.外周血基因組DNA的提取：采集先證者、其父親、母親、姐姐、弟弟外周血各2ml EDTA抗凝，用QIAamp全血DNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen 公司)按其指南提取基因組DNA。以上獲得筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)討論通過后，家長(zhǎng)簽署了知情同意書。

3.醫(yī)學(xué)外顯子測(cè)序:DNA送第三方檢驗(yàn)公司-北京邁基諾基因公司，對(duì)先證者及父母行醫(yī)學(xué)外顯子測(cè)序。使用Hiseq2000標(biāo)準(zhǔn)流程測(cè)序(二代測(cè)序儀：Illumina NextSeq500, 美國(guó)Illumina公司)。

4.序列比對(duì)，變異注釋和危害性預(yù)測(cè):通過Q20標(biāo)準(zhǔn)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾得到Clean data，使用BWA比對(duì)軟件，將所有的Clean reads 比對(duì)到人參考基因組(HG19)；將分析得到的SNP和INDEL通過ANNOVAR軟件進(jìn)行注釋。篩選掉正常人數(shù)據(jù)庫中頻率<0.05的突變位點(diǎn)， 用MutationTaster和GERP++軟件進(jìn)行致病性預(yù)測(cè)和保守性預(yù)測(cè)，剪切位點(diǎn)的改變用SPIDEX軟件分析其致病性。

5.一代測(cè)序(Sanger法)驗(yàn)證:篩選到的候選變異位點(diǎn)用PCR和Sanger測(cè)序驗(yàn)證(ABI3730xl測(cè)序儀，美國(guó)Applied Biosystems 公司)。最后對(duì)先證者姐姐、弟弟行致病突變點(diǎn)的驗(yàn)證。

結(jié) 果

1.先證者家系醫(yī)學(xué)外顯子測(cè)序分析：先證者樣本分析到 LDL-R 基因有 2個(gè)雜合突變：(1)在LDL-R基因的第5個(gè)外顯子上有一個(gè)雜合突變，即c.727T>A(編碼區(qū)第 727 號(hào)核苷酸由胸腺嘧啶變異為腺嘌呤)，導(dǎo)致氨基酸改變 p.C243S(第 243 號(hào)氨基酸由半胱氨酸變異為絲氨酸)，為錯(cuò)義突變。該變異在正常人群數(shù)據(jù)庫無攜帶頻率。蛋白功能預(yù)測(cè)軟件 SIFT、PolyPhen_2、REVEL的預(yù)測(cè)結(jié)果均為有害。在 HGMD專業(yè)版數(shù)據(jù)庫中未見報(bào)道。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，先證者之父該位點(diǎn)雜合變異，先證者之母該位點(diǎn)無變異。對(duì)先證者姐姐和弟弟進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示先證者弟弟該位點(diǎn)同先證者父親為雜合變異，先證者姐姐該位點(diǎn)無變異(圖2)。(2)在LDL-R基因的第7個(gè)外顯子上有一個(gè)雜合突變，即c.1003G>T(編碼區(qū)第 1003 號(hào)核苷酸由鳥嘌呤變異為胸腺嘧啶)，導(dǎo)致氨基酸改變 p.G335C(第 335號(hào)氨基酸由甘氨酸變異為半胱氨酸)，為錯(cuò)義突變。該變異在正常人群數(shù)據(jù)庫無攜帶頻率。蛋白功能預(yù)測(cè)軟件 SIFT、PolyPhen_2、REVEL的預(yù)測(cè)結(jié)果分別為有害、有害、有害。在 HGMD專業(yè)版數(shù)據(jù)庫中未見報(bào)道。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，先證者之父該位點(diǎn)無變異，先證者之母該位點(diǎn)雜合變異。對(duì)先證者姐姐和弟弟進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示先證者姐弟倆該位點(diǎn)均無變異(圖2)。

圖2 先證者、父母、姐姐及弟弟DNA測(cè)序圖A.先證者測(cè)序圖;B.先證者父親測(cè)序圖;C.先證者母親測(cè)序圖;D.先證者姐姐測(cè)序圖;E.先證者弟弟測(cè)序圖;箭頭指示為突變位點(diǎn)

2.隨訪：先證者父母經(jīng)過4個(gè)月飲食控制加鍛煉，TC、LDL-C有所下降，但仍然高于正常，后加用阿托伐他汀鈣 20mg, 每晚1次,口服，2周后復(fù)查兩人TC分別降至 4.2mmol/L和4.8mmol/L，LDL-C分別降至2.7mmol/L 和3.0mmol/L。先證者經(jīng)過4個(gè)月飲食控制加鍛煉，復(fù)查血TC 14.10mmol/L，LDL-C 11.74mmol/L，較前有所降低。由于患兒皮膚黃色瘤有所增多，家長(zhǎng)十分焦慮。與家長(zhǎng)協(xié)商后，試給患兒加用阿托伐他汀鈣 5mg, 每晚1次，口服，2周后TC降至11.46mmol/L，LDL-C降至9.82mmol/L，繼續(xù)維持現(xiàn)在劑量口服2周，必要時(shí)考慮增加到10mg, 每晚1次，口服，目前筆者還在密切隨訪先證者。先證者弟弟1歲余，主要吃奶和添加輔食，囑少食內(nèi)臟食物，最近1次復(fù)查TC為6.42mmol/L,LDL-C為4.06mmol/L。

討 論

FH是一種常染色體顯性遺傳病，主要表現(xiàn)為血漿LDL-C水平異常升高，肌腱黃色瘤，以及早發(fā)冠心病。中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)動(dòng)脈粥樣硬化及冠心病學(xué)組制定了中國(guó)FH篩查與診治中國(guó)專家共識(shí)[5]。共識(shí)指出兒童FH診斷標(biāo)準(zhǔn)：未經(jīng)治療的血清LDL-C≥3.6mmol/L且一級(jí)親屬中有FH或早發(fā)冠心病。本先證者及弟弟血清LDL-C分別是15.06mmol/L和5.04mmol/L，結(jié)合家族史，符合兒童FH診斷標(biāo)準(zhǔn)。共識(shí)對(duì)成人FH診斷標(biāo)準(zhǔn)是：符合下列3條中的2條：①未經(jīng)治療的血清LDL-C≥4.7mmol/L；②皮膚/腱黃色瘤/脂性角膜弓(<45歲)；③一級(jí)親屬中有FH或早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)患者。先證者父母血清LDL-C分別為4.49mmol/L和5.97mmol/L，結(jié)合家族史符合成人FH診斷標(biāo)準(zhǔn)。FH 可分為純合子和雜合子兩種類型，雜合子癥狀通常較輕，而純合子癥狀嚴(yán)重，表現(xiàn)為多部位黃色瘤、發(fā)展迅速的全身動(dòng)脈粥樣硬化，青少年時(shí)期發(fā)生心肌梗死甚至死亡。本家系中先證者LDL-R基因存在2個(gè)復(fù)合雜合變異，屬于純合子，變異的基因分別來自父母，其他家庭成員除了姐姐正常，LDL-R基因僅存在1個(gè)位點(diǎn)的突變，屬于雜合子。

從臨床上看，先證者血清LDL-C水平遠(yuǎn)高于正常范圍，也高于其他家庭成員，這點(diǎn)也符合純合子的特點(diǎn)，膽固醇代謝涉及了許多蛋白質(zhì)和途徑，LDL分解代謝是該過程中的關(guān)鍵點(diǎn)，參與其中的蛋白質(zhì)功能發(fā)生任何缺陷都可以產(chǎn)生FH。其中起主要決定因素的為L(zhǎng)DL-R，占FH病例的80%～85%，載脂蛋白B占5%～10%的病例，枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶9占 2%，LDL-R銜接因子蛋白占不到1%的病例，其余的少見[4]。目前文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn) LDL-R、載脂蛋白B、枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶9、LDL-R銜接因子蛋白、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體、膽固醇 7α-羥化酶這7 種基因突變可導(dǎo)致 FH，我國(guó)目前僅發(fā)現(xiàn)了前3種基因突變[3]。

LDL-R基因位于染色體19p13.2，由 18個(gè)外顯子和 17個(gè)內(nèi)含子組成, 包含 5個(gè)不同的功能域,當(dāng)外顯子發(fā)生突變可使 LDL-R相應(yīng)的功能域不同程度受損, 導(dǎo)致LDL-R的功能障礙。文獻(xiàn)報(bào)道LDL-R基因突變位點(diǎn)遍布啟動(dòng)子, 內(nèi)含子及18個(gè)外顯子中, 目前世界范圍已從 FH患者中檢測(cè)出了3000多種突變, 包括缺失、插入、無義突變、錯(cuò)義突變、拷貝數(shù)變異等[4,6～8]。

LDL-R基因突變?yōu)?FH 主要病理基礎(chǔ)，LDL-R是一種富含半胱氨酸的839個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，是一種細(xì)胞表面糖蛋白，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用特異性結(jié)合并內(nèi)吞含載脂蛋白B 100或載脂蛋白 E的脂蛋白,在膽固醇體內(nèi)平衡中起重要作用。LDL-R基因突變導(dǎo)致細(xì)胞膜表面 LDL-R結(jié)構(gòu)功能異常, 不能有效代謝體內(nèi)LDL, 導(dǎo)致LDL因清除障礙而在血液或其他組織中過度淤積引發(fā)高膽固醇血癥[6,9,10]。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，中國(guó)FH 患者 LDLR基因突變均發(fā)生在 1～17 外顯子，第 18 外顯子突變尚未發(fā)現(xiàn)[11]。Chiou等[12]統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)漢族人群中目前存在143種不同LDL-R突變類型(134種位點(diǎn)突變及9種基因重組)。2015年Jiang等[13]對(duì)中國(guó) FH 人群基因情況予以概述，發(fā)現(xiàn) LDLR 突變多位于外顯子 4、9、13 及 14，主要是錯(cuò)義突變，占60.3%，C308Y、H562Y 和 A606T 突變最為常見。其中，我國(guó)內(nèi)陸北方地區(qū) A606T 突變最常見，內(nèi)陸南方地區(qū) W462X 突變最常見，臺(tái)灣地區(qū) C308Y 最常見。2017 年 Li 等[14，15]對(duì)全國(guó)范圍內(nèi) 245 例 FH 患者進(jìn)行基因突變分析發(fā)現(xiàn)，在單基因突變FH患者中，LDL-R基因突變占68.2%，多位于外顯子12、4、9。

本研究中FH先證者LDL-R基因有2個(gè)雜合突變(復(fù)合雜合子)，一個(gè)位于第5號(hào)外顯子，一個(gè)位于第7號(hào)外顯子，分別來自父母，屬于純合子。這兩個(gè)突變c.727T>A (p.C243S)和c.1003G>T (p.G335C)均為錯(cuò)義突變，在正常人群數(shù)據(jù)庫無攜帶頻率，蛋白功能預(yù)測(cè)軟件 SIFT、PolyPhen_2、REVEL的預(yù)測(cè)結(jié)果均為有害，上述變異在 HGMD專業(yè)版數(shù)據(jù)庫中未見報(bào)道，屬于新發(fā)突變。由于先證者本身存在黃色瘤、高膽固醇和高低密度脂蛋白膽固醇，分析該基因突變?yōu)橹虏⌒酝蛔?。先證者父母、弟弟各存在1個(gè)基因突變，屬于雜合子，3個(gè)人同樣存在血高膽固醇和高低密度脂蛋白膽固醇，只是程度較純合子的先證者輕。先證者姐姐臨床生化檢驗(yàn)正常，基因測(cè)序未見LDL-R基因突變，符合共分離特征，因此可以判斷本家系中存在的FH致病因素是LDL-R基因突變所致。

為提高 FH 診斷率，應(yīng)盡早對(duì) FH 予以篩查，方法有人群篩查、選擇性篩查、家族級(jí)聯(lián)篩查、脂質(zhì)級(jí)聯(lián)篩查、基因級(jí)聯(lián)篩查、反向級(jí)聯(lián)篩查等。Starr 等[16]建議在年齡>2 歲的兒童中篩查 FH，再進(jìn)一步對(duì)確診兒童父母進(jìn)行篩查，即進(jìn)行反向級(jí)聯(lián)篩查，這種篩查的優(yōu)點(diǎn)是大多數(shù)國(guó)家兒童有常規(guī)體檢，易實(shí)施。2017 年 Wu 等[17]在我國(guó)47例FH患者的1、2級(jí)親屬中進(jìn)行反向級(jí)聯(lián)篩查發(fā)現(xiàn)，總篩查檢出比例為2.8例新診患者/1 例先證者，證實(shí)我國(guó)反向級(jí)聯(lián)篩查是高效的。

本研究報(bào)道的家系成員中，先證者作為兒童首先因?yàn)辄S色瘤就診，隨后發(fā)現(xiàn)異常血脂增高，對(duì)其家中成員進(jìn)行血脂篩查，結(jié)果父母、弟弟均不正常，僅姐姐正常。最后進(jìn)行基因測(cè)定，證實(shí)家族中除了姐姐，其余成員均存在LDLR基因突變，且先證者為復(fù)合雜合突變，即存在兩個(gè)位點(diǎn)的突變，屬于純合子，此檢測(cè)結(jié)論也驗(yàn)證了先證者臨床癥狀突出、血脂異常明顯的特點(diǎn)。

FH 的治療包括生活方式和飲食控制、藥物治療、脂蛋白血漿置換以及肝臟移植等[18]。成人 FH 患者一旦確診應(yīng)立即改變生活方式并開始藥物治療如他汀類藥物、膽汁酸螯合劑等，對(duì)于純合子患者及患有冠心病并對(duì)其他治療無效的雜合子患者采取血漿清除。本研究先證者父母屬于雜合子，臨床沒有癥狀，心電圖和心臟超聲均正常，治療最初依靠飲食和鍛煉，但血膽固醇不能降至滿意，加用阿托伐他汀鈣口服效果滿意。本研究先證者為4歲多兒童，依靠調(diào)整飲食效果不理想，且皮膚黃色瘤增多，試加用阿托伐他汀鈣5mg,每晚口服1次，目前血TC、LDL-C仍然比較高，由于患兒年齡小，筆者尚在密切隨訪治療效果，必要時(shí)調(diào)整藥物劑量為10mg,每晚口服1次。對(duì)于兒童患者，基于生長(zhǎng)發(fā)育的考慮，無論純合子型還是雜合子型 FH，2 歲前均不宜應(yīng)用低脂飲食，因此先證者弟弟僅囑少食動(dòng)物內(nèi)臟，其余未做特殊處理[4,19]。該研究不足之處是未對(duì)先證者皮膚黃色瘤予以病理學(xué)檢查，原因是患兒父母堅(jiān)決反對(duì)。

對(duì)一家族性高膽固醇血癥家系進(jìn)行醫(yī)學(xué)外顯子測(cè)定，結(jié)果顯示該家系5人中的4人存在LDLR基因突變，分別是5號(hào)外顯子c.727T>A 和(或)7號(hào)外顯子c.1003G>T，這兩種突變?cè)谡Ｈ巳簲?shù)據(jù)庫無攜帶頻率，在 HGMD專業(yè)版數(shù)據(jù)庫中未見報(bào)道，提示對(duì)臨床出現(xiàn)不明原因皮膚黃色瘤，血膽固醇增高的兒童要積極尋找致病原因，對(duì)其親屬也應(yīng)該積極進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，及早做出診斷，給予干預(yù)，避免疾病進(jìn)展。