陳繼華 ， 王 波 ， 劉倩倩 ， 周 圍 *，

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅出入境檢驗檢疫局 綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州730010；3.甘肅檢科院 玫瑰工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州730010）

玫瑰（Rosa ragosa）為薔薇屬植物，是一種集觀賞、食用、藥用、釀酒及香料等多種用途于一身的植物資源?？嗨倒迨侵袊倒搴外g齒薔薇的雜交種，盛產(chǎn)于甘肅永登苦水鎮(zhèn)，耐堿耐旱?？嗨倒寤ㄉ珴梢蠹t，品質(zhì)可與久負(fù)盛名的大馬士革玫瑰媲美。同時，玫瑰花蕾作為花茶具有消炎殺菌、消除疲勞、改善體質(zhì)、潤澤肌膚的功效[1]。研究表明：苦水玫瑰富含黃酮類及多酚類化合物，黃酮類化合物是玫瑰花中最重要的活性成分之一，具有清除自由基、抗氧化、抗衰老等作用[2-4]。此外，苦水玫瑰中的黃酮還可以抑制紅細(xì)胞溶血和脂質(zhì)過氧化過程，具有體外抗補體作用[5-6]。目前由于國內(nèi)外比較注重玫瑰揮發(fā)油的開發(fā)和利用，而對玫瑰總黃酮的研究相對比較少，且多采用超聲波輔助進行總黃酮的提取，雖然提取時間較短，但是運行成本高，僅限于小型實驗研究而難以對其進行工業(yè)化生產(chǎn)。另外，玫瑰總黃酮的提取材料多使用平陰玫瑰，對苦水玫瑰總黃酮的提取鮮有研究[7-8]。

對于黃酮類化合物的檢測，通常使用液相色譜[12-14]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[15-16]以及紫外分光光度法[17-18]等。超高效合相色譜法（UPC2）是傳統(tǒng)超高效液相色譜（UPLC）和超臨界流體色譜（SFC）技術(shù)的結(jié)合，主要使用超臨界CO2為流動相的主體，依靠流動相的溶劑化能力進行分離、分析；因超臨界CO2相對于液體作為流動相的傳統(tǒng)液相色譜來說，它具有較小的粘度、較高的擴散系數(shù)和傳質(zhì)速率，在分離操作時所用的時間短，單位時間內(nèi)分離效能高[19-20]。作者在使用響應(yīng)面分析法優(yōu)化檢測苦水玫瑰總黃酮含量的同時，還使用了區(qū)別于傳統(tǒng)液相色譜（LC）和氣相色譜（GC）的超高效合相色譜（UPC2）檢測苦水玫瑰總黃酮中的槲皮素和山奈酚的含量，為黃酮類化合物的檢測提供新的方法及思路，并為干制苦水玫瑰的質(zhì)量評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦水玫瑰花：摘自甘肅檢科院玫瑰工程技術(shù)研究中心實驗基地，80℃熱風(fēng)烘干，密封備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98%）：中國藥品生物制品檢定所提供；槲皮素、山奈酚 （純度 99%）：Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效合相色譜儀（配有Waters EmpowerTM3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）：美國Waters公司產(chǎn)品；Lambda 25UV紫外可見分光光度計：美國珀金埃爾默公司產(chǎn)品；多功能偏程干燥箱：德國memmert公司產(chǎn)品；冷凍離心機：德國Sigma公司產(chǎn)品；均質(zhì)機：美國Tomtec公司產(chǎn)品；移液槍：美國Thermo Electron公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確稱取于120℃烘至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品25.0 mg，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液定容于25 mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 50 mL 容量瓶中， 依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO2溶液0.5 mL，搖勻靜置5 min后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻靜置5 min后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%氫氧化鈉溶液4 mL搖勻，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容至50 mL，搖勻靜置15 min，用1 cm比色皿于510 nm測定樣品吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度C（mg/mL）為縱坐標(biāo)，吸光度A為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程為C=0.0599A-0.0003，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，表明在0.02～0.10 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curves of rutin

1.3.2 總黃酮的提取 苦水玫瑰花蕾于80℃烘干后粉碎（60目），準(zhǔn)確稱取1.0 g玫瑰粉末于50 mL離心管中，加入15 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，置于漩渦振蕩器上搖勻，然后在70℃恒溫水浴振蕩條件下提取30 min，冷卻后在4℃下10000 r/min離心10 min，取上清液1.0 mL過0.22 μm有機相膜后待UPC2分析；另移取1.0 mL于15 mL離心管中，按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定吸光度。每個樣品重復(fù)3次。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)貯備液：分別精確稱取0.010 g槲皮素和山奈酚，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%H3PO4的體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液，準(zhǔn)確定容至100 mL容量瓶中，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃下冷藏待用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液： 準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移 1000、750、500、250、100、50、25 μL 標(biāo)準(zhǔn)貯備液分別稀釋為 100、75、50、25、10、5、2.5 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃下冷藏待用。

1.3.4 UPC2條件 色譜柱：Waters CSH Fluoro-Phenyl C182.1 mm×100 mm×1.7 μm； 流動相：A：CO2，B：甲醇（含質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.2%H3PO4）；流量：0.4 mL/min，進樣體積：1.0 μL，柱溫：50 ℃，檢測波長：360 nm，動態(tài)背壓（ABPR）：12.4 MPa。

梯度洗脫：0～0.25 min時甲醇體積分?jǐn)?shù)為20%，25 min時甲醇體積分?jǐn)?shù)由20%變?yōu)?5%，27 min時甲醇體積分?jǐn)?shù)由35%變?yōu)?0%，保持3 min。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖及樣品圖見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖及樣品圖Fig.2 Chromatography of standards and sample

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取溶劑的選擇 控制提取條件在液料體積質(zhì)量比15 mL/g、提取溫度70℃、提取時間90 min的條件下，分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%和100%的條件下提取苦水玫瑰中總黃酮。以總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)，研究提取溶劑對苦水玫瑰總黃酮提取率的影響，選取最適提取溶劑。從圖3中可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%～70%時，黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在逐漸增大，在70%時達(dá)到最大值，隨后逐漸降低。由此可以得知乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時提取效果較好。

2.1.2 液料體積質(zhì)量比的選擇 控制提取條件在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度70℃、提取時間90 min的條件下，分別在液料體積質(zhì)量比為10、15、20、25、30 mL/g的條件下提取苦水玫瑰中的總黃酮。以黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)，研究液料體積質(zhì)量比對苦水玫瑰總黃酮提取率的影響，選取最適液料體積質(zhì)量比。從圖4中可以看出，液料體積質(zhì)量比為10～15 mL/g時，黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在逐漸增大，液料體積質(zhì)量比為15 mL/g時達(dá)到最大值，隨后逐漸降低。由此可以得知液料體積質(zhì)量比為15 mL/g時提取效果較好。

圖3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

圖4 不同液料體積質(zhì)量比對黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

2.1.3 提取溫度的選擇 控制提取條件在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料體積質(zhì)量比15mL/g、提取時間90min的條件下，在提取溫度為40～95℃的條件下提取苦水玫瑰中總黃酮。以黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)，研究提取溫度對苦水玫瑰總黃酮提取率的影響，選取最適提取溫度。從圖5中可以看出，隨著提取溫度的升高，黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在逐漸增大，在提取溫度為40～70℃時顯著增大，在70℃以后呈平穩(wěn)狀態(tài)。由此可以得知提取溫度為70℃時提取效果較好。

2.1.4 提取時間的選擇 控制提取條件在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料體積質(zhì)量比15 mL/g、提取溫度70℃的條件下，分別在提取時間為30～150 min的條件下提取苦水玫瑰中總黃酮。以黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)，研究提取時間對苦水玫瑰總黃酮提取率的影響，選取最適提取時間。從圖6中可以看出，提取時間為30～90 min時，黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大，時間為90 min時達(dá)到最大值，隨后逐漸降低。由此可以得知提取時間為90 min時提取效果較好。

圖5 提取溫度對黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

圖6 提取時間對黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.6 Effect of extraction time nn the extraction rate of total flavonoids

2.2 響應(yīng)面實驗

根據(jù)單因素實驗，同時考慮到總黃酮提取過程中溫度的變化規(guī)律，鑒于溫度在70℃之后呈平穩(wěn)狀態(tài)，為了節(jié)約能源，直接選取70℃為最佳提取溫度，選擇3因素3水平進行響應(yīng)面實驗，以黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為響應(yīng)值，采用中心組合設(shè)計，得到3因素3水平優(yōu)化模型共17個試驗組，其中中心點“0”水平重復(fù)5次以計算誤差。各因素與水平的設(shè)計如表1所示，實驗結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table1 Experimental design and results for response surface analysis

表2 實驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Design and results

Box-Behnken設(shè)計回歸分析結(jié)果顯示，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與各個因素之間的關(guān)系為：y=5.73+0.14A+0.031B-0.51C+0.032AB+0.11AC-0.030BC-0.22A2-0.023B2-0.62C2，決定系數(shù)R2=0.9980，說明該回歸模型的擬合情況較好，試驗值與預(yù)測值較為接近，模型的可靠性可通過方差分析及相關(guān)系數(shù)來考察。

響應(yīng)面方差分析表見表3。

表3 回歸分析結(jié)果Table3 Results of variance analysis

由表3可知模型P＜0.0001，表明模型極顯著，失擬項P=0.8155＞0.05不顯著，說明該模型擬合程度良好，可以用此模型對苦水玫瑰總黃酮的超聲輔助提取效果進行分析和預(yù)測。由回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果可知，模型的一次項A（液料體積質(zhì)量比）、B（乙醇體積分?jǐn)?shù)）、二次項A2、C2和交互項AC均對苦水玫瑰中總黃酮提取的線性效應(yīng)極顯著；一次項C（提取時間）對苦水玫瑰中總黃酮提取的曲面效應(yīng)顯著；交互項AB、BC對苦水玫瑰中總黃酮提取的曲面效應(yīng)不顯著。

模型響應(yīng)曲面見圖7～9。從響應(yīng)面分析圖上看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。

對模型方程解逆矩陣得苦水玫瑰中總黃酮提取最佳工藝為：液料體積質(zhì)量比16.49 mL/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)65.85%，提取時間120 min。為檢驗試驗結(jié)果與實際情況是否相一致，對上述條件進行修正后進行驗證，即：液料體積質(zhì)量比16 mL/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)66%，提取時間120 min。用此最佳試驗條件重復(fù)3次，得到平均總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.85 mg/g，與理論最佳總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.87 mg/g基本一致。

圖7 液料體積質(zhì)量比和時間對黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用的響應(yīng)曲面Fig.7 Response surface plot showing the interactive effects of extraction ratio and time on the content of total flavonoid

圖8 液料體積質(zhì)量比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用的響應(yīng)曲面Fig.8 Response surface plot showing the interactive effects of extraction ratio and ethanol?concentration on the content of total flavonoids

圖9 乙醇體積分?jǐn)?shù)和時間對黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用的響應(yīng)曲面Fig.9 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and time on the content of total flavonoids

2.3 UPC2方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍和靈敏度 在優(yōu)化實驗條件下，選取 100、75、50、25、10、5、2.5 mg/kg 的槲皮素和山奈酚系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按“1.7色譜條件”進行測定。結(jié)果表明，該方法在5.0～100 mg/kg范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.9989及0.9993。該方法對槲皮素和山奈酚的檢出限（LOD）分別為0.75 mg/kg和1.25 mg/kg，定量限（LOQ）分別為2.5 mg/kg和3.75 mg/kg。

2.3.2 回收率和精密度 分別準(zhǔn)確稱取1.00 g粉碎后的烘干苦水玫瑰花，分別加入高、中、低3個質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5、50、100 mg/kg）的槲皮素和山奈酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于50 mL聚乙烯管中，分別按照最佳提取條件和“1.7色譜條件”進樣測定，計算其回收率。結(jié)果表明，該方法的加標(biāo)回收率在96.05%～101.15%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）為0.52%～1.76%。方法的回收率和重現(xiàn)性均較好。

2.3.3 穩(wěn)定性實驗 取同一份苦水玫瑰供試品溶液， 每隔 0、l、5、10、24 h 進樣 l.0 μL 測定槲皮素和山奈酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）為3.17%，表明槲皮素和山奈酚在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.4 實際樣品測定 作者利用上述最佳優(yōu)化條件，分別稱取5個不同批次的烘干苦水玫瑰花10.00 g，粉碎后稱取1.00 g，置于50 mL聚乙烯管中，分別按照最佳提取條件和“1.7色譜條件”進樣測定，結(jié)果見表4，色譜圖見圖2。

表4 不同批次烘干玫瑰花蕾中槲皮素和山奈酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table4 Contents of quercetin and kaempferol in different batches of dried rose

3 結(jié)語

響應(yīng)面分析法在優(yōu)化中藥提取工藝方面具有一定的優(yōu)勢。在使用UPC2檢測總黃酮中槲皮素和山奈酚中，由于UPC2的分離機理與傳統(tǒng)液相色譜不同，在分離總黃酮中槲皮素和山奈酚的過程中，具有效率高、成本低、所需時間短、測定結(jié)果準(zhǔn)確等特點。該方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，可用于苦水玫瑰花中主要活性成分含量的分析與質(zhì)量控制，具有很好的實用價值。