劉 環(huán)，王華笑，楊國(guó)平,2，張 琇,2

(1.北方民族大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川 750021；2.寧夏特殊生境微生物資源開(kāi)發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021)

鹽堿化屬于土地荒漠化的一種[1-3]，致使土壤肥力下降，植物根系吸水困難，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)的發(fā)展[4-5]。利用生物措施改良鹽堿地成為目前備受關(guān)注的措施之一[6-10]。近幾十年的研究顯示，在鹽脅迫環(huán)境中，植物根際促生細(xì)菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria-PGPR)、AM真菌和印度梨形孢等共生菌在降低鹽害對(duì)植物影響的方面發(fā)揮著重要作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)施用一些改良肥料能促進(jìn)植物的耐鹽堿能力[12]。雖然通過(guò)微生物與植物相互作用來(lái)增強(qiáng)植物的耐鹽性這一現(xiàn)象已經(jīng)引起人們的關(guān)注，但迄今該類(lèi)微生物菌劑產(chǎn)品尚屬少見(jiàn)，將微生物與植物聯(lián)合起來(lái)改良鹽堿土的研究更為少見(jiàn)。

本研究通過(guò)模擬自然鹽堿地生態(tài)，同時(shí)采用NaCl調(diào)節(jié)鹽離子濃度;Na2CO3調(diào)節(jié)pH，同時(shí)也提供鹽離子，鹽離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.45%，且溶液pH達(dá)到9.0，為中度鹽堿地(pH為8.5～9.5，鹽離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%～0.6%)的標(biāo)準(zhǔn)，篩選獲得能夠提高玉米對(duì)鹽堿地抗性的菌株，并通過(guò)菌株形態(tài)結(jié)合分子生物學(xué)分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，以期為鹽堿化土壤的修復(fù)提供參考，對(duì)于中國(guó)的糧食生產(chǎn)具有重大意義[4]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土樣采集 取鹽堿地植物根系土壤(表1)。

1.1.2 供試植物品種 ‘鄭單958’玉米種子。

1.1.3 試驗(yàn)主要器材 植物光照培養(yǎng)箱，LED 植物生長(zhǎng)補(bǔ)光燈，紫外分光光度計(jì)，H-3400N掃描式電子顯微鏡，光學(xué)顯微鏡,VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)。

1.1.4 溶液和培養(yǎng)基的配制 植物營(yíng)養(yǎng)液為 1 000倍濃縮液，由寧夏特殊生境微生物資源開(kāi)發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。母液1： CoCl2·6H2O 0.002 g， H3BO31.43 g， MnCl2·4H2O 0.905 g， ZnSO4·7H2O 0.11 g， CuSO4·5H2O 0.051 g， Na2MoO4·2H2O 0.061 g， 去離子水 500 mL；母液2： MgSO4·7H2O 24.648 g，去離子水 500 mL；母液3：K2HPO487.09 g，KH2PO468.443 g，去離子水500 mL；母液4：CaCl2·2H2O 55.495 g，去離子水 500 mL；母液5：FeC6H5O7·3H2O 2.5 g，去離子水 500 mL；母液6：(NH4)2SO40.33 g，去離子水 500 mL。

表1 取樣地基本情況Table 1 Basic situation of sampling sites

以上6種母液各取1 mL與1 000 mL蒸餾水混合即得植物營(yíng)養(yǎng)液，常規(guī)滅菌后作為正常的植物營(yíng)養(yǎng)液。

鹽堿脅迫條件確立。溶液Ⅰ：上述6種植物營(yíng)養(yǎng)液母液各取1 mL加入500 mL蒸餾水中，然后加入3.0 g NaCl，1×105Pa滅菌15 min；溶液Ⅱ 稱(chēng)量0.8 g Na2CO3加入500 mL蒸餾水中， 1×105Pa滅菌15 min；將滅過(guò)菌的溶液Ⅰ和溶液Ⅱ等量混合制得植物生長(zhǎng)培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液pH為9.0，電導(dǎo)率為7.84，其中鹽離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.45%。

TSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨17 g,大豆木瓜蛋白酶消化物3 g，氯化鈉 5 g，磷酸二氫鉀2.5 g，葡萄糖2.5 g。

TSA培養(yǎng)基:稱(chēng)取TSB 30.0 g，瓊脂15.0 g，加入1 000 mL蒸餾水中，1×105Pa滅菌 15 min。

初篩培養(yǎng)基：植物營(yíng)養(yǎng)液1 mL,0.8 g瓊脂，加入1 000 mL蒸餾水中，1×105Pa滅菌 15 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離純化 分別稱(chēng)取10 g土壤樣品搗碎后，加入到裝有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩30 min后，進(jìn)行逐級(jí)梯度稀釋。取100 μL適當(dāng)稀釋梯度的樣品溶液涂布于TSA培養(yǎng)基分離平板。于37 ℃倒置培養(yǎng)24～72 h，用稀釋平皿涂抹法純化3次，獲得純化菌株于4 ℃保藏， 備用。

1.2.2 種子催芽 選取約200粒飽滿(mǎn)無(wú)損傷的玉米種子置于500 mL 60 ℃溫水中浸泡到水溫自然降至室溫為止，取出玉米種子，用質(zhì)量濃度為1 g/L的 HgCl表面[13]消毒30 s，再用無(wú)菌水沖洗5次。置于鋪有濕潤(rùn)無(wú)菌紗布的培養(yǎng)皿內(nèi)，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)2 d至根長(zhǎng)為0.5～1.0 cm，萌發(fā)備用。

1.2.3 初篩 平板篩選可促進(jìn)玉米幼苗耐鹽堿的菌株。催芽后種子與試驗(yàn)菌株在鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.45%,pH為8.50的固體培養(yǎng)中共培養(yǎng)，分為以下3種處理。CK0處理：無(wú)鹽堿脅迫、不接種試驗(yàn)菌株；CK1處理：鹽堿脅迫、不接種試驗(yàn)菌株；菌株篩選處理：鹽堿脅迫、分別接種試驗(yàn)菌株，接種濃度為1×108cfu/mL，接種量為每株 20 μL。

每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，所有處理均放置于光照培養(yǎng)箱(25 ℃，16 h光照與18 ℃，8 h黑暗，光照度20 000 lx)中培養(yǎng)，共培養(yǎng)3 d后觀察玉米的長(zhǎng)勢(shì)，挑選在鹽堿脅迫條件下對(duì)玉米生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用的菌株作為供試菌株。

1.2.4 復(fù)篩 水培法篩選促進(jìn)植物耐鹽堿脅迫菌株。

供試菌株的準(zhǔn)備工作：將待試菌株接種到TSA斜面培養(yǎng)基上，30 ℃條件下培養(yǎng)2 d，備用。用接種環(huán)挑取待測(cè)試菌加入到含有1 mL無(wú)菌水的1.5 mL離心管中，制成濃度為1×108cfu/mL的菌懸液，備用。

玉米苗與供試菌株的共培養(yǎng):選取無(wú)污染、長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米幼苗，避免選擇過(guò)大或過(guò)小的幼苗。每組6株玉米苗種于含有500 g白石子的培養(yǎng)瓶中，加入80 mL植物生長(zhǎng)培養(yǎng)液，分為3種處理(與初篩一致)。

在培養(yǎng)過(guò)程中，實(shí)時(shí)測(cè)定營(yíng)養(yǎng)液的pH，使其保持穩(wěn)定(pH為9.0±0.2)。

每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，所有處理均放置于光照培養(yǎng)箱(25 ℃，16 h光照與18 ℃，8 h黑暗)中培養(yǎng)，共培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計(jì)玉米的株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量等生長(zhǎng)指標(biāo)。

1.3 菌株YM6的鑒定

1.3.1 培養(yǎng)特征和形態(tài)特征觀察 將菌株 YM6 劃線接種在 TSA 培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)72 h，觀察記錄單菌落形態(tài)；采用革蘭氏染色法和電鏡法觀察細(xì)胞形態(tài)[14]。

1.3.2 分子鑒定 將純化好的 YM6菌株送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司提取基因組DNA，然后PCR擴(kuò)增進(jìn)行sanger測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)。

1.3.3 菌株YM6對(duì)鹽、堿及高溫耐性測(cè)定 將菌株YM6劃線接種在TSA斜面上，30 ℃培養(yǎng)72 h，備用；用無(wú)菌水梯度稀釋制成菌濃度為1×108cfu/mL菌懸液，取1 mL菌懸液分別加入鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、2%、4%、6%、8%、10%、12%的TSB培養(yǎng)液中，180 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)72 h，在600 nm波長(zhǎng)條件下以不接菌培養(yǎng)液為空白對(duì)照組測(cè)定吸光值；用無(wú)菌水梯度稀釋制成菌濃度為1×108cfu/mL菌懸液，取1 mL菌懸液分別加入裝有100 mL的TSB培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，pH分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，9.5、 10.0、10.5、11.0，180 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng) 72 h，在600 nm波長(zhǎng)條件下以不接菌培養(yǎng)液為空白對(duì)照組測(cè)定吸光值；用無(wú)菌水梯度稀釋制成菌濃度為1×108cfu/mL菌懸液，取1 mL菌懸液加入裝有100 mL TSB培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，分別置25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和 50 ℃，于180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，在600 nm波長(zhǎng)條件下以不接菌培養(yǎng)液為空白對(duì)照組測(cè)定吸 光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的促生作用

將由根際土壤樣品中分離篩選到的350株分離物與玉米幼苗在平板上培養(yǎng)，共篩選到63株可有效促進(jìn)玉米幼苗耐鹽堿的菌株。這63株菌株與供試玉米在植物生長(zhǎng)培養(yǎng)液共培養(yǎng)14d后，供試玉米生長(zhǎng)出現(xiàn)明顯差異，主要呈現(xiàn)3種結(jié)果(圖1，2)。

表觀無(wú)影響型：在植株色澤、株高、根長(zhǎng)、莖粗等方面與對(duì)照CK1無(wú)明顯差異，有24株菌。

生長(zhǎng)減弱或致死型：菌株與供試玉米共培養(yǎng)后，玉米苗出現(xiàn)生長(zhǎng)衰弱或死亡，有3株菌。

表觀促生型：供試玉米苗在加入植物生長(zhǎng)培養(yǎng)液共生后，長(zhǎng)勢(shì)明顯強(qiáng)于對(duì)照CK1，有36 株菌。

通過(guò)3次重復(fù)共培養(yǎng)試驗(yàn)復(fù)篩表觀無(wú)影響型和表觀促生型的菌株，最終得到44株在含植物生長(zhǎng)培養(yǎng)液的樣品中可穩(wěn)定促進(jìn)玉米生長(zhǎng)的菌株，分別為Sh21、NF38、NF89、NF85、cd52、cd51、cd68、Sm3等。

挑選出效果較為明顯且穩(wěn)定的10株供試菌株與玉米于鹽堿脅迫條件下水培，探究生物量差異。

圖1 菌株對(duì)玉米抗鹽堿的影響Fig.1 Effect of strain on salt tolerance of corn

圖2 鹽堿脅迫條件下菌株與玉米共培養(yǎng)14 d后生長(zhǎng)狀況Fig.2 Growth status of the strain after co-cultivation with maize for 14 days

鹽堿脅迫處理后玉米苗的株高及根長(zhǎng)生物量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。在該鹽堿條件下，接種上述10株菌對(duì)玉米苗在株高及鮮質(zhì)量和干質(zhì)量上比對(duì)照均分別有不同增加，說(shuō)明這10株菌均可以增強(qiáng)玉米苗對(duì)鹽堿脅迫的抵御能力且對(duì)玉米幼苗有不同程度的促生作用，通過(guò)重復(fù)試驗(yàn)，菌株YM6表現(xiàn)最為突出。

2.2 菌株YM6的鑒定

2.2.1 培養(yǎng)特征和形態(tài)特征觀察 菌株YM6菌落較大，球狀或橢球狀，乳白色，邊緣褶皺，表面光滑，有粘性(圖3)，革蘭氏陽(yáng)性菌，可產(chǎn)芽孢，能在堿性條件下生長(zhǎng)；在電鏡下觀察菌體為桿狀(圖4)，大小基本為(0.4～0.5) μm×(1.0～1.3) μm。

表2 10株菌接種14 d后玉米苗生長(zhǎng)狀況Table 2 Growth status of maize seedlings after inoculation for 10 strains for 14 days

注：“a、b、c、d、e”表示同列數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

Note:“a,b,c,d,e” means the same column difference significance result(P<0.05).

圖3 菌株YM6的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of strain YM6

圖4 菌株YM6電鏡觀察結(jié)果圖(×20K)Fig.4 Electron microscopic observation of strain YM6

2.2.2 菌株YM6分子鑒定 根據(jù)生理生化及16S rRNA分子生物學(xué)鑒定，菌株YM6為Bacillusvelezensis，即貝萊斯芽孢桿菌，該菌株在中國(guó)典型微生物菌種保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCCM 2018428。

2.2.3 菌株YM6對(duì)鹽、堿及高溫的耐性 經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定，在鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)菌株生長(zhǎng)最為良好，菌株YM6最大耐鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%；pH 7～7.5時(shí)生長(zhǎng)良好，pH達(dá)11.0時(shí)不能生長(zhǎng)；最適生長(zhǎng)溫度為30～31 ℃，可耐受48 ℃高溫(圖5)。

3 討 論

有關(guān)促進(jìn)植物耐鹽堿的微生物研究多見(jiàn)于菌根真菌的研究[10,15-18]。但與真菌相比較，細(xì)菌更有利于人工培養(yǎng)并進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)。有文獻(xiàn)[15]報(bào)道，芽孢桿菌屬可有效促進(jìn)植物生長(zhǎng)。目前，關(guān)于耐受鹽堿的細(xì)菌資源開(kāi)發(fā)與研究，多聚焦于菌株對(duì)鹽或堿的單一耐受性的評(píng)價(jià)[5]；另外，以往研究方法主要采取自然界篩選耐一定鹽堿度的細(xì)菌，再將耐鹽堿菌株與植物在一定鹽堿條件下進(jìn)行互作檢測(cè)，最終獲得耐鹽堿菌種，較為耗時(shí)耗力[1,4-5]。本研究利用菌株與植物在鹽堿環(huán)境中的相互作用，直接通過(guò)觀察植物的根、莖、葉等表觀現(xiàn)象，可初步篩選出促進(jìn)植物在中度鹽堿條件下生長(zhǎng)的有效菌株。通過(guò)上述方法和思路，成功從土壤中分離獲得1株具有明顯促進(jìn)玉米耐鹽堿性能的細(xì)菌，編號(hào)為YM6，經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，具有較大的應(yīng)用潛力。本研究存在的不足之處為：在植物生長(zhǎng)過(guò)程中，根系分泌的有機(jī)酸導(dǎo)致水培溶液pH變化程度與在自然鹽堿土環(huán)境中不一致。因此，篩選到的有效菌株在實(shí)際生產(chǎn)中的效果需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖5 菌株YM6耐受性(n=3)Fig.5 Strain YM6 tolerance (n=3)