牛天嬌，郭永杰，陳歷水，馬 鶯

（1.哈爾濱工業(yè)大學 化工與化學學院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.蒙牛高科鮮乳制品有限責任公司，北京 101107；3.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209）

生物胺是一類含氮的小分子堿性有機化合物，常見的生物胺有8種，分別為色胺、組胺、苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺和亞精胺[1]。按組成成分可分為單胺和多胺，多胺包括精胺和亞精胺，其余6種為單胺[2]。發(fā)酵制品中生物胺的合成途徑是在微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶的作用下，氨基酸脫羧反應(yīng)的產(chǎn)物[3]。生物胺是人體的正常成分，適量的生物胺有利于人體的健康，而過量的生物胺則會導(dǎo)致中毒，引起頭痛、血壓變化、嘔吐等一系列嚴重反應(yīng)[4]。生物胺在胺氧化酶的作用下氧化成醛，醛進一步氧化生成的羧酸可被生物體利用產(chǎn)能或排泄，而酒精會抑制人體內(nèi)胺類氧化酶的活性，12%的乙醇會抑制91%的胺氧化酶活性[9]，從而加強生物胺的危害作用[5]，使酒中生物胺安全風險增大，因此對酒類產(chǎn)品中生物胺的限量標準比普通食品更嚴格。

黃酒發(fā)酵多以大罐發(fā)酵為主，粳米等原材料經(jīng)過浸泡、蒸煮冷卻后，與酒曲攪拌后呈半固半液狀態(tài)的開放式落罐發(fā)酵[6]，是糖化、乳酸桿菌和酵母菌協(xié)同作用的混合發(fā)酵[7]。黃酒發(fā)酵中浸米漿水中的乳酸桿菌主要來源于環(huán)境，以發(fā)酵用米的形式帶入發(fā)酵醪液[8]。在黃酒復(fù)雜的生產(chǎn)工藝及其開放的發(fā)酵體系中含有豐富的微生物，其中一些微生物能夠產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，氨基酸在氨基酸脫羧酶的作用下脫羧基轉(zhuǎn)化為生物胺，這也是黃酒發(fā)酵過程中生物胺形成的原因[9]。

由于生物胺的形成與微生物緊密相關(guān)，而季節(jié)對微生物的種類和數(shù)量影響很大，因此分析了不同的季節(jié)對生物胺的影響，而冬釀黃酒由于溫度低，后酵時間長，營養(yǎng)更加豐富，味道更加醇厚，著重分析冬釀黃酒生物胺含量的變化。本研究采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對浙江紹興某黃酒廠春釀、秋釀和冬釀黃酒原料（酒母、麥曲）、預(yù)發(fā)酵（浸米、浸米水）、發(fā)酵過程（落缸、前酵和后酵）及后處理階段（壓榨、清酒結(jié)束和煎酒）樣品中生物胺的消長進行了分析，探討了黃酒生產(chǎn)過程中生物胺形成和分解的潛在機制，為控制黃酒中生物胺含量奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

春釀、秋釀和冬釀黃酒（產(chǎn)品類型為特型半干黃酒，主要成分為水、乙醇、糖類、蛋白質(zhì)、有機酸、氨基酸）：浙江紹興某黃酒廠；麥曲、釀酒酒母：人工固態(tài)培養(yǎng)。

1.1.2 化學試劑

色胺、組胺、苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺、亞精胺標準品（純度均＞98%）、乙腈（色譜純）、丹磺酰氯（純度＞99%）：美國Sigma公司；鹽酸、三氯乙酸、丙酮、飽和碳酸氫鈉、氫氧化鈉、谷氨酸鈉、氯化鈉、無水乙醚（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀：日本島津有限公司；DK-8B型恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備公司；Sigma 3K30型低溫高速離心機：德國Satorious公司；UF/UVPL5124超純水儀：美國Pall公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 取樣

黃酒發(fā)酵工藝流程：

原米→浸米→蒸米（30 min）→落缸（加入酒母）→糖化→發(fā)酵→沖缸（加入麥曲）→開耙→灌壇后酵→壓榨→生酒→煎酒→灌壇陳釀→成品

采集浙江紹興某黃酒廠冬釀黃酒生產(chǎn)中原料（酒母、麥曲）、預(yù)發(fā)酵段（浸米、浸米水）、發(fā)酵段（落缸、前酵第2天和后酵第10天）以及后處理階段（壓榨、生酒和煎酒）樣品。用三點取樣法，分別取樣品的底部、中部和上部，用燒杯取樣，每個取樣點取樣量為500 mL，采用冷凍（-20 ℃）方式保存樣本。

1.3.2 高效液相色譜法測定生物胺含量

參照國標GB/T 5009.208—2016《食品中生物胺含量的測定》規(guī)定的方法，在此基礎(chǔ)上對樣品預(yù)處理方法加以修改，具體如下：

固液混合類樣品（浸米、生酒、煎酒）和純液體類樣品（浸米水、落缸、前酵、后酵、壓榨），直接取適量樣品于離心管中，3 600 r/min離心10 min，取上清液5 mL上樣檢測。

稱取5 g固體類樣品（酒母、麥曲），置于100 mL具塞三角瓶中，加入30 mL的5%三氯乙酸溶液，混勻，振蕩提取60 min后轉(zhuǎn)移至離心管中，3 600 r/min離心10 min，取上清液倒入50 mL容量瓶中，將沉淀部分重復(fù)上述操作，合并兩次上清液并用5%三氯乙酸溶液定容后，取5 mL溶液上樣檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬釀黃酒原料及發(fā)酵過程生物胺的形成及消長規(guī)律

2.1.1 原料生物胺變化

黃酒生產(chǎn)的原料包括糯米、麥曲、酒母、糖化酶和水。酒母主要含有酵母菌和乳酸桿菌及其他微生物，負責把米發(fā)酵成酒精。麥曲主要原料是小麥和水，采用人工固態(tài)培養(yǎng)，麥曲中主要微生物是曲霉、根霉、毛霉，還有微量酵母、青霉和細菌，在黃酒的釀造過程中，它作為菌種、糖化劑和谷物原料一起參與酒醪的復(fù)式發(fā)酵以及分解、重組[10]。糖化酶在黃酒生產(chǎn)中解決麥曲中酶系和微生物產(chǎn)糖化酶活力不足的問題[11]。測定糯米、自來水、酒母、麥曲和糖化酶生物胺總量和8種生物胺含量，探究黃酒原料階段樣品中生物胺形成及含量變化，測定結(jié)果見表1。由表1可知，糯米總生物胺含量為29.39 mg/kg，以腐胺為主，占總生物胺的71.3%，其次是尸胺、精胺、亞精胺，其余4種生物胺均能檢出，但含量很低（＜1 mg/kg）。自來水只檢測出五種生物胺，含量較低（＜0.5 mg/kg），總生物胺含量為1.06 mg/kg。水中生物體腐爛后，由細菌分解其尸體產(chǎn)生的生物胺，會對水體造成污染[12]，生活用水經(jīng)過凈化處理后生物胺含量較低。酒母中腐胺和色胺含量顯著地高于其他生物胺（P＜0.05）；麥曲中色胺含量高于其他七種生物胺。

表1 原料中生物胺含量測定結(jié)果Table 1 Determination results of bioamine content of raw materials mg/kg

2.1.2 預(yù)發(fā)酵階段物料生物胺含量

黃酒預(yù)發(fā)酵階段主要指浸米和蒸飯過程。浸米過程中，漿水中微生物數(shù)量巨大，發(fā)酵產(chǎn)物和自溶產(chǎn)物極其豐富，隨配料加入和蒸飯帶入發(fā)酵醪中，經(jīng)過發(fā)酵、貯存等過程是形成黃酒風味豐富性和復(fù)雜性的主要因素之一[13]。測定漿水、浸米和蒸飯生物胺總量和8種生物胺含量，探究黃酒預(yù)發(fā)酵階段樣品中生物胺形成及含量變化，測定結(jié)果見表2。

表2 預(yù)發(fā)酵階段物料生物胺含量測定結(jié)果Table 2 Determination results of bioamine content of materials in pre-fermentation stage mg/kg

由表2可知，浸米和浸米水中生物胺含量升高，這是由于浸米水中發(fā)酵產(chǎn)物和自溶產(chǎn)物氨基酸極其豐富，為生物胺的形成提供了豐富的前體物質(zhì)，再加上適宜的生長條件促進了生物胺的形成[8]。浸米和浸米水中主要生物胺為腐胺和酪胺，因為浸米和浸米水中彎曲乳桿菌和植物乳桿菌能夠產(chǎn)生酪氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶，以酪氨酸和鳥氨酸為底物分解成腐胺和酪胺[15]。蒸飯中含有較高含量的酪胺（47.08 mg/kg），蒸飯是用于黃酒發(fā)酵的直接原料，其高含量的生物胺能夠影響最終黃酒的生物胺量。

2.1.3 發(fā)酵過程中生物胺含量變化

黃酒釀造發(fā)酵段工藝包括落缸、前酵和后酵。物料落缸后便開始糖化和發(fā)酵，前酵階段酵母菌大量繁殖、代謝，溫度控制在28～30 ℃；前酵結(jié)束后進入后發(fā)酵期，后酵期是部分殘留的淀粉和糖繼續(xù)發(fā)酵，促進酒成熟、增香和提高風味。冬釀黃酒發(fā)酵階段生物胺總量和各種生物胺含量變化結(jié)果見表3。由表3可知，落缸時物料總生物胺含量為34.95 mg/kg，其來源于蒸飯、酒母、麥曲和糖化酶；前酵1 d，總生物胺含量變化不大（36.51 mg/kg），整個前酵期生物胺顯著增加，前酵結(jié)束時（第3天），總生物胺達到了191.92 mg/kg。前酵期發(fā)酵溫度較高（30 ℃），這一階段酵母大量增殖；通過開粑方式鼓入氧氣，一些好氧性細菌（葡萄球菌和芽孢桿菌等）大量繁殖，微生物生長代謝旺盛[16]；發(fā)酵體系中蛋白酶將蛋白質(zhì)水解成氨基酸，為生物按合成提供了充足的條件[17]。前酵結(jié)束后，發(fā)酵醪液從發(fā)酵缸轉(zhuǎn)入壇中進行后酵，后酵溫度在20 ℃，后酵第1天，發(fā)酵物料生物胺含量增加至268.51 mg/kg，后酵第7天，發(fā)酵物料生物胺含量達到了402.58 mg/kg，繼續(xù)發(fā)酵生物胺含量開始降低，到發(fā)酵結(jié)束，物料生物胺降低至234.55 mg/kg。進入后酵期，發(fā)酵醪液酒精度（15%vol～17%vol）逐漸增加，發(fā)酵液酸度、氧氣等環(huán)境因素發(fā)生了改變，微生物生長特性也發(fā)生了改變，對生物胺的形成產(chǎn)生了抑制；同時，發(fā)酵醪液中胺氧化酶活性增加，部分生物胺發(fā)生了降解。

表3 發(fā)酵階段物料生物胺含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of bioamine content of materials in fermentation stage mg/kg

2.1.4 成熟期生物胺含量變化

黃酒成熟期包括壓榨、清酒結(jié)束和煎酒。冬釀黃酒的壓榨、清酒結(jié)束和煎酒階段生物胺總量和各種生物胺含量結(jié)果見表4。由表4可知，壓榨段生物胺總量比后酵段生物胺含量顯著增加（P＜0.05），增加了26.07 mg/L。經(jīng)過壓榨之后，滯留在發(fā)酵醪液中的生物胺進入了發(fā)酵液中[16]。在清酒結(jié)束時，生物胺含量顯著降低（P＜0.05），降低了75.32 mg/L。由于清酒時采用硅藻土過濾，硅藻土能夠吸附一部分生物胺[18]。而煎酒中生物胺含量又略高于清酒結(jié)束，原因是煎酒之后pH降低[17]，黃酒發(fā)酵液pH值與生物胺含量呈負相關(guān)[19]。由表4可見，在成熟期的3個階段中，腐胺、酪胺和色胺仍然是主要的生物胺。清酒結(jié)束時，三種主要生物胺含量均顯著低于壓榨階段（P＜0.05），腐胺降低了54.57 mg/L，酪胺降低了12.87mg/L，色胺降低了1.27mg/L。由于在澄清之前經(jīng)過了勾兌，勾兌所用酒的生物胺含量低于壓榨后發(fā)酵液所致。

表4 成熟過程物料中生物胺含量測定結(jié)果Table 4 Determination results of bioamine content of materials in mature stage mg/kg

2.2 春釀黃酒、秋釀黃酒、冬釀黃酒生物胺含量變化

發(fā)酵溫度和貯藏溫度對黃酒中生物胺的形成和積累有顯著的影響，溫度越高越利于生物胺的積累[16-17]。生產(chǎn)季節(jié)不同，溫度差異很大。根據(jù)前期數(shù)據(jù)分析，生物胺形成主要是在發(fā)酵段和后熟段，因此，從黃酒發(fā)酵段（落缸、前酵、后酵）和煎酒對3個季節(jié)生產(chǎn)黃酒的總生物胺、腐胺、酪胺和色胺變化進行分析（以每一階段每種生物胺/該階段總生物胺表示，%），探討生產(chǎn)條件對生物胺形成的影響（圖1）。

由圖1（a）可知，不同生產(chǎn)季節(jié)的黃酒落缸、前酵、后酵和煎酒過程中總生物胺含量變化趨勢和幅度不同。落缸時物料生物胺主要來源于原米、酒母、麥曲、浸米和蒸米。春釀和秋釀黃酒均采用純酵母菌為酒母，由于使用的季節(jié)不同，秋釀酒母中總生物胺顯著高于春釀酒母（P＜0.05）。同一工廠麥曲的生產(chǎn)工藝相同，但是生產(chǎn)季節(jié)不同，麥曲生物胺含量也不同，秋釀黃酒生產(chǎn)用麥曲總生物胺含量高于春釀和冬釀。冬釀黃酒在釀造中為了提高發(fā)酵力，使用了商業(yè)糖化酶，糖化酶中生物胺含量非常高（1 047.29 mg/kg）；在浸米過程中，漿水中微生物數(shù)量較多，發(fā)酵產(chǎn)物和自溶產(chǎn)物極其豐富，漿水的pH較低（3.7～4.0），主要是乳酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)酸。乳酸菌具有分泌氨基酸脫羧酶能力，大量的乳酸菌和漿水中豐富的氨基酸底物，有利于漿水中生物胺的形成[17]，冬釀黃酒由于浸米時間長，漿水中生物含量非常高（707.1 mg/kg）。從食品安全考慮，現(xiàn)代的黃酒生產(chǎn)工藝不用漿水回填工藝，而是將漿水棄掉。生物胺為可溶性化合物，主要存在于浸米漿水中，但是在浸米中也有殘留，冬釀黃酒浸米時間長（18 d），浸米中生物胺含量非常高（315.45mg/kg）。經(jīng)過淋洗、蒸煮、淋飯過程，能夠去除掉一部分生物胺，但是，仍有一部分生物胺進入發(fā)酵階段。因此，冬釀黃酒落缸時物料總生物胺顯著高于秋釀和春釀黃酒。前酵發(fā)酵液中的微生物生長旺盛，尤其是霉菌代謝產(chǎn)生糖化酶、淀粉酶和蛋白酶，將原料中的蛋白質(zhì)、淀粉和糖類轉(zhuǎn)化為微生物可以利用的營養(yǎng)物質(zhì)，并產(chǎn)生合成生物胺所需的各種氨基酸，導(dǎo)致生物胺的變化[19]。而三個季節(jié)釀造的黃酒前酵階段總生物胺含量差異不顯著（P＞0.05）；后酵階段秋釀黃酒和冬釀黃酒總生物胺含量顯著高于春釀黃酒（P＜0.05），而煎酒階段秋釀黃酒總生物胺含量較后酵顯著降低（P＜0.05），春釀黃酒和冬釀黃酒較后酵有所增加?？傮w來講，秋釀、冬釀黃酒總生物胺含量明顯高于春釀黃酒，原因是秋釀黃酒和冬釀黃酒的后酵溫度和濕度更適合產(chǎn)氨基酸脫羧酶微生物的生長，使得生物胺的含量增加[18]。

圖1 不同季節(jié)生產(chǎn)黃酒發(fā)酵過程中生物胺變化Fig.1 Changes of bioamine in Chinese rice wine produced in different seasons during fermentation process

由圖1（b）可知，在整個發(fā)酵過程中，春釀黃酒中腐胺占總生物胺43.3%～70.5%；冬釀黃酒中腐胺占總生物胺44.3%～60.6%左右；秋釀黃酒中腐胺占總生物胺的比例較低（7.0%～28.6%）。就絕對含量而言，腐胺含量則是冬釀黃酒最高，顯著高于秋釀黃酒和春釀黃酒（P＜0.05），可能原因是冬釀黃酒中有更多的彎曲乳桿菌能夠產(chǎn)生鳥氨酸脫羧酶和鳥氨酸，鳥氨酸在鳥氨酸脫羧酶的作用下轉(zhuǎn)化為腐胺，導(dǎo)致腐胺含量顯著增加（P＜0.05）。

由圖1（c）可知，秋釀黃酒后酵階段酪胺總生物胺84.7%，顯著高于春釀、冬釀黃酒后酵階段酪胺占總生物胺30.2%、2.2%（P＜0.05）。由于在pH 5.5，40 ℃時，酪氨酸轉(zhuǎn)化為酪胺的效率最高[19]，秋釀黃酒后酵溫度為33 ℃，高于春釀黃酒和冬釀黃酒后酵溫度，增強了酪氨酸脫羧酶的活性，導(dǎo)致秋釀黃酒酪胺含量顯著高于春釀黃酒和冬釀黃酒（P＜0.05）。

由圖1（d）可知，在整個發(fā)酵過程中，春釀、秋釀、冬釀黃酒中色胺分別占總生物胺17.6%～38.0%、3.0%～29.3%及1.5%～7.56%，其中在煎酒階段中色胺占總生物胺比例最高。冬釀黃酒中色胺分別占總生物胺最低，可能原因是冬釀黃酒中色氨酸比例相對較低，即色胺的前體物質(zhì)含量較低，導(dǎo)致冬釀黃酒中色胺比例低于春釀和秋釀黃酒。

綜上分析，不同生產(chǎn)季節(jié)的黃酒，不但總生物胺含量差異顯著，主要生物胺組分含量上差異也較大。冬釀黃酒中生物胺含量最高（210.21 mg/kg），春釀黃酒中生物胺含量最低（28.92 mg/kg）；春釀黃酒中主要生物胺是腐胺和色胺，秋釀黃酒中主要生物胺是酪胺、色胺、腐胺；冬釀黃酒中主要生物胺是腐胺、酪胺、色胺。冬釀和秋釀黃酒中酪胺含量分別為72.11 mg/kg和30.26 mg/kg，以及高含量的腐胺和色胺，具有潛在的食品安全隱患。在黃酒釀造中控制生物胺的形成對保證黃酒產(chǎn)品安全性具有重要的意義。

3 結(jié)論

通過高效液相色譜法對春、秋和冬釀黃酒的生產(chǎn)過程的總生物胺及色胺、組胺、苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺、亞精胺8種生物胺含量監(jiān)測，實驗結(jié)果顯示，冬釀黃酒中，生物胺總量在整個發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，其中后酵第7天時生物胺含量最高，為402.6 mg/L。春釀、秋釀和冬釀黃酒前酵階段生物胺含量差異不明顯（P＞0.05），后酵階段秋釀黃酒和冬釀黃酒生物胺含量顯著高于春釀黃酒（P＜0.05），煎酒階段冬釀黃酒生物胺含量顯著高于春釀黃酒和秋釀黃酒（P＜0.05）。綜合得知，冬釀和秋釀黃酒中煎酒階段酪胺含量分別為72.11mg/kg和30.26 mg/kg，以及高含量的腐胺和色胺，具有潛在的食品安全隱患，在黃酒釀造中控制生物胺的形成或者采取有效措施去除生物胺對保證黃酒產(chǎn)品安全性具有重要的意義。