張 娟，李 丹，王順喜，夏曉華，段傳人

（1.重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院，重慶 400030；2.重慶蜂谷美地生態(tài)養(yǎng)蜂有限公司，重慶 404508）

蜂糧顧名思義為蜜蜂的食物，是幼蜂的主要食物來源，對于蜂群的繁衍生息具有重要作用[1]。蜜蜂在蜂巢中將采集到的花粉團咬碎后用蜂蠟封藏，封藏的花粉團在微生物的作用下，經(jīng)過一定時間的發(fā)酵便形成了蜂糧[2-3]。蜂糧的保健作用是近年來才被開發(fā)的，蜂糧具有豐富的營養(yǎng)并且能夠提高人體抵抗力，目前已經(jīng)成為一種極具開發(fā)前景的產(chǎn)品[4-5]。近些年，蜂糧商品在巴西、新加坡等國家已有上市，但是蜂糧商品在我國市場幾乎沒有。

雖然天然蜂糧的產(chǎn)量比較穩(wěn)定，但是由于以下原因無法像其他蜂產(chǎn)品一樣可以容易地獲?。阂皇且驗樘烊环浼Z被蜜蜂封在蜂房中，人為收集會破壞蜂房結(jié)構(gòu)，影響蜂群的生活習(xí)性；二是天然蜂糧的產(chǎn)量低，僅僅只是供應(yīng)幼蟲的營養(yǎng)，人為強取會影響整個蜂群的繁衍生息；三是天然蜂糧的成分復(fù)雜，且含有蜂卵等不易去除的雜質(zhì)，因而對生產(chǎn)加工要求高[6-7]。所以要進行人工發(fā)酵蜂糧，人工發(fā)酵蜂糧的優(yōu)點有以下幾個方面：一是人工發(fā)酵蜂糧的原料是花粉，來源不受限制，可進行大規(guī)模生產(chǎn)；二是人工發(fā)酵蜂糧是用純天然花粉進行發(fā)酵，不添加任何添加劑，從而保證發(fā)酵產(chǎn)品營養(yǎng)成分貼近于天然蜂糧。本研究對人工蜂糧的兩種發(fā)酵方式（固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵）的乳酸菌活菌數(shù)以及主要的營養(yǎng)成分進行了對比分析，為后續(xù)人工蜂糧大規(guī)模生產(chǎn)提供參考依據(jù)[8-10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：從天然蜂糧中提取出植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為發(fā)酵菌株。

MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉5g/L，葡萄糖20g/L，吐溫-80 1 mL，酵母粉4 g/L，瓊脂粉15 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，pH 6.2。

硫酸、乙醇、硼酸、蒽酮、氫氧化鈉（分析純）：重慶川東化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1BU/18U型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；THZ-C型搖床：北京寅韜興業(yè)科技有限公司；30L-7000c發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備有限公司；日立835-50型氨基酸自動分析儀：日本日立公司；723N 型可見分光光度計：上海光學(xué)儀器一廠；SHZ-D真空泵：上海暉創(chuàng)化學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

在超凈工作臺內(nèi)挑取1～2環(huán)保藏在斜面上的植物乳桿菌接種于MRS平板上，置于37 ℃的生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h。然后挑取2～3環(huán)已經(jīng)活化的菌株到30 mL MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)12 h，制成濃度約為106個/mL的菌懸液[11]。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵方法

稱取50 g花粉倒入錐形瓶內(nèi)，與20%的無菌水混勻高壓滅菌之后，待溫度降至40 ℃左右加入9%的乳酸菌培養(yǎng)液后置于35 ℃的生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵8 d，發(fā)酵結(jié)束后對發(fā)酵產(chǎn)品進行冷凍真空干燥[9，12]。

1.3.3 液態(tài)發(fā)酵方法

稱取花粉500 g經(jīng)研磨、過篩后，倒入發(fā)酵罐內(nèi)，加入料液比為0.13∶1（g∶mL）的無菌水充分混勻后高壓滅菌30 min。冷卻后，接入10%的乳酸菌培養(yǎng)液，設(shè)定發(fā)酵罐溫度為33 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為445 r/min，待發(fā)酵罐顯示屏上連續(xù)2 d之內(nèi)的pH變化＜0.02時停止發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后對發(fā)酵產(chǎn)品進行離心、冷凍真空干燥處理[6，13]。

1.3.4 蜂糧中乳酸菌活菌數(shù)的測定

稱取5.0 g蜂糧倒入三角瓶（裝有適量玻璃珠）中，然后加入15 mL蒸餾水進行振蕩，使樣品被研磨成均勻的稀釋液。用梯度稀釋法再次進行稀釋，稀釋梯度分別為10-1，10-2，10-3，……10-9，在超凈工作臺內(nèi)吸取100 μL各個梯度的樣品到MRS固體培養(yǎng)基上，涂布均勻后將平板放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d后選擇蜂糧含菌量大概在10個/cm2的梯度平板為適宜濃度，兩個平板為一個濃度，結(jié)果取平均值[14-15]。

1.3.5 蜂糧感官評定

（1）感官評定評價標(biāo)準(zhǔn)

感官評定主要考慮蜂糧產(chǎn)品的顏色、香氣、口感，具體的評價方法為：采用標(biāo)準(zhǔn)比色卡對蜂糧的顏色進行對比之后，在距離鼻子0.5 cm處通過嗅覺感受香氣，然后稱取5 g蜂糧取食感受蜂糧的口感。每項指標(biāo)滿分5分，請5名專業(yè)的食品評判員對這三個指標(biāo)進行打分，評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示[16]。

表1 蜂糧感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of bee bread

（2）感官評定指標(biāo)權(quán)重

為了把握單個指標(biāo)在總評價中的相對水平，請8名從事食品檢測和評價的工作人員對以上三個感官評價因素進行打分，從而確定蜂糧感官評價時各因素的權(quán)重。

1.3.6 蜂糧中總糖含量的測定

采用蒽酮比色法[17-18]對蜂糧中的總糖含量進行測定。在試管中加入0.2 g新鮮蜂糧，加入5 mL蒸餾水，振蕩均勻后管口加蓋在沸水浴煮沸10 min，流水冷卻至室溫，過濾，將濾液配制成25 mL的水溶液。然后取上述溶液0.1 mL，然后加0.9 mL的蒸餾水進行稀釋，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的方法，測定溶液的吸光度值，并重復(fù)操作3次?？偺呛康挠嬎愎饺缦拢?/p>

1.3.7 總蛋白含量的測定

采用凱氏定氮法對花粉、天然蜂糧、固態(tài)以及液態(tài)發(fā)酵的蜂糧進行蛋白質(zhì)含量的測定[19]。

1.3.8 氨基酸含量的測定對花粉、天然蜂糧、固態(tài)以及液態(tài)發(fā)酵的蜂糧進行氨基酸含量的測定[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵蜂糧中乳酸菌活菌數(shù)的曲線分析

對固態(tài)及液態(tài)發(fā)酵過程中每一天的蜂糧進行乳酸菌活菌數(shù)的測定，連續(xù)測定8 d，測定結(jié)果如圖1所示。

圖1 兩種發(fā)酵方式蜂糧中乳酸菌活菌數(shù)的曲線Fig.1 Curve of viable lactic acid bacteria count in bee bread by two fermentation methods

根據(jù)圖1的曲線可以觀察到，固態(tài)發(fā)酵過程中蜂糧中乳酸菌的活菌數(shù)在發(fā)酵第7天達到最大值為1.65×107CFU/g，液態(tài)發(fā)酵條件下，蜂糧中乳酸菌活菌數(shù)在發(fā)酵第3天達到最大值為2.12×107CFU/g，且遠遠高于固態(tài)發(fā)酵。這說明液態(tài)發(fā)酵條件更有利于乳酸菌的生長繁殖，因而經(jīng)液態(tài)發(fā)酵的蜂糧中的活菌數(shù)更多。

2.2 兩種發(fā)酵方式發(fā)酵蜂糧的感官評分

8名工作人員對蜂糧3個感官因素的評價結(jié)果見表2。

表2 感官評定的指標(biāo)權(quán)重Table 2 Index weight of sensory evaluation

綜合表1和表2，經(jīng)過計算，蜂糧的顏色、香味、口味的權(quán)重系數(shù)分別為0.29、0.27、0.44。設(shè)蜂糧顏色評分為X，香味評分為Y，口味評分為Z，則蜂糧綜合感官評分公式為：蜂糧綜合感官評分=0.29X+0.27Y+0.44Z。

請專業(yè)的食品評判員對固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵的蜂糧進行感官評分，再根據(jù)綜合計算公式得到感官評分，結(jié)果如表3所示。

表3 兩種發(fā)酵方式蜂糧感官評分對比Table 3 Comparison of sensory score of bee bread between two fermentation methods

根據(jù)表3的結(jié)果可知，從顏色來看，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵的蜂糧顏色較液態(tài)發(fā)酵的顏色淺；從香味來看，液態(tài)發(fā)酵的蜂糧香氣更濃；從口感分析，液態(tài)發(fā)酵的蜂糧的口感更好。綜合分析，相比于固態(tài)發(fā)酵，液態(tài)發(fā)酵的蜂糧的感官評分更高，得分為4.44分。

2.3 總糖含量

為了研究發(fā)酵對花粉中總糖含量的影響，對天然花粉、天然蜂糧、固態(tài)發(fā)酵以及液態(tài)發(fā)酵的人工蜂糧進行總糖含量的測定，測定結(jié)果如表4所示。

表4 花粉、天然蜂糧、固態(tài)發(fā)酵蜂糧以及液態(tài)發(fā)酵蜂糧的總糖含量對比Table 4 Comparison of total sugar content of pollen,natural bee bread,solid-state and liquid-state fermented bee bread

由表4可知，經(jīng)過發(fā)酵后的花粉的總糖含量升高，且人工發(fā)酵的蜂糧中的總糖含量高于天然蜂糧；液態(tài)發(fā)酵的蜂糧中的總糖含量略微高于固態(tài)發(fā)酵。這可能是因為液態(tài)發(fā)酵更為徹底，使得蜂糧中的可溶性糖含量尤其是果糖含量增多。

2.4 總蛋白含量

為了探究發(fā)酵對花粉中總蛋白含量的影響，對花粉、天然蜂糧、固態(tài)以及液態(tài)發(fā)酵的蜂糧進行總蛋白含量的測定，測定的結(jié)果如表5所示。

表5 花粉、天然蜂糧、固態(tài)以及液態(tài)發(fā)酵蜂糧中總蛋白含量的對比Table 5 Comparison of total protein content in pollen,natural bee bread,solid-state and liquid-state fermented bee bread

根據(jù)表5的數(shù)據(jù)可以得知，經(jīng)過發(fā)酵后的蜂糧總蛋白的含量有輕微上升，并且可以看出液態(tài)發(fā)酵的蜂糧中總蛋白含量略高于固態(tài)發(fā)酵。分析可能是因為液態(tài)發(fā)酵加入的乳酸菌培養(yǎng)液較多，而培養(yǎng)液中有含氮物質(zhì)，經(jīng)過發(fā)酵后轉(zhuǎn)變成了某種有機氮分子，從而使得總蛋白含量升高。

2.5 氨基酸含量

為了探究發(fā)酵對花粉中氨基酸含量的影響，對花粉、天然蜂糧、固態(tài)以及液態(tài)發(fā)酵的蜂糧中氨基酸含量進行測定，測定的結(jié)果如表6所示。

表6 花粉、天然蜂糧、固態(tài)以及液態(tài)發(fā)酵蜂糧中氨基酸含量的對比Table 6 Comparison of amino acid contents in pollen,natural bee bread,solid-state and liquid-state fermented bee bread g/100 g

根據(jù)表6的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，人工發(fā)酵蜂糧中各種氨基酸含量豐富，尤其是天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量較高，而這些氨基酸對增強免疫能力有很大幫助。并且可以看出固態(tài)發(fā)酵的蜂糧中氨基酸含量不及液態(tài)發(fā)酵氨基酸含量高。原因可能為乳酸菌培養(yǎng)液中的含氮分子經(jīng)過一系列反應(yīng)生成了各種氨基酸。

3 結(jié)論

通過考察蜂糧發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)，對蜂糧的總糖含量、總蛋白含量以及氨基酸含量進行了分析測定。實驗證明了人工發(fā)酵蜂糧中的總糖、總蛋白含量以及氨基酸含量均優(yōu)于天然蜂糧和花粉；使用同樣的乳酸菌對同種花粉進行發(fā)酵的結(jié)果表明，無論是蜂糧中總糖含量、總蛋白含量還是氨基酸含量，液態(tài)發(fā)酵的蜂糧的結(jié)果都明顯高于固態(tài)發(fā)酵。這是由于液態(tài)發(fā)酵經(jīng)過攪拌，乳酸菌與花粉的接觸面積變大，有利于花粉的充分發(fā)酵。從大規(guī)模生產(chǎn)的角度上來考慮，液態(tài)發(fā)酵乳酸菌繁殖快，能夠提高生產(chǎn)效率；另一方面液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的蜂糧感官評分以及主要營養(yǎng)成分，如總糖、總蛋白以及氨基酸含量都高于固態(tài)發(fā)酵，保證了人工發(fā)酵蜂糧的質(zhì)量。因此用液態(tài)發(fā)酵蜂糧的方式具有更多的優(yōu)勢，可用此進行蜂糧的大規(guī)模生產(chǎn)。