蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基多糖的提取及抗腫瘤活性研究

孫 葉 ，包建忠 ，劉 紅 ，馬 輝 ，張 甜 ，陳秀蘭 *

（1.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 ，江蘇 揚(yáng)州225007；2.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州循天嶺生物科技有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225007）

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militarisL Link），俗稱北冬蟲(chóng)夏草，是蟲(chóng)草屬的模式種。蛹蟲(chóng)草子實(shí)體采收后的培養(yǎng)基富含菌絲體和子實(shí)體殘留以及其他代謝物質(zhì)[1]，可作為原料直接用于釀造食品[2]、飼料[3-4]、肥料等開(kāi)發(fā)；二次發(fā)酵可生產(chǎn)殺蟲(chóng)真菌制劑等產(chǎn)品；蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基的綜合利用能變廢為寶，為企業(yè)增加效益。目前蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基活性物質(zhì)的提取分離[5－8]是研究的熱點(diǎn)，蛹蟲(chóng)草大米培養(yǎng)基多糖提取方法有浸提法、熱回流水提法、超聲波提取、微波提取等，在此基礎(chǔ)上，還發(fā)展了酶提等方法[9-12]。目前小麥培養(yǎng)基的生產(chǎn)規(guī)模在不斷擴(kuò)大，但小麥培養(yǎng)基多糖提取與開(kāi)發(fā)的研究相對(duì)較少。

藥用真菌多糖的抗腫瘤活性已被廣泛認(rèn)可[13-14]，蛹蟲(chóng)草子實(shí)體或菌絲體提取物具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，抗腫瘤，抗衰老，抗感染，降血糖、血脂，治療艾滋病等作用[14-19]，蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基多糖是否也有這些功效還有待研究。肝癌是現(xiàn)代社會(huì)惡性程度和發(fā)病率較高的惡性腫瘤，針對(duì)肝癌的藥物、保健品開(kāi)發(fā)十分重要。有研究證明蛹蟲(chóng)草水提物可通過(guò)線粒體途徑抑制HepG2肝癌細(xì)胞和 MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[20]，高純度蟲(chóng)草素有直接抗HepG2肝癌細(xì)胞的作用[21-22]，蛹蟲(chóng)草的其他活性物質(zhì)對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞是否也有相同作用值得研究探討。MTT法被公認(rèn)為是抗腫瘤藥物大規(guī)模粗篩的有效方法，用MTT法研究蛹蟲(chóng)草多糖抗腫瘤效果已有一定進(jìn)展[23-25]。本實(shí)驗(yàn)首次以蛹蟲(chóng)草小麥培養(yǎng)機(jī)為原料，通過(guò)熱回流水提法正交試驗(yàn)確定多糖的最佳提取工藝，并利用MTT法研究不同提純處理的培養(yǎng)基多糖對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用，并與蛹蟲(chóng)草子實(shí)體多糖進(jìn)行比較，研究結(jié)果對(duì)蛹蟲(chóng)草小麥培養(yǎng)基多糖的開(kāi)發(fā)利用有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基由揚(yáng)州循天嶺生物科技有限公司提供。試驗(yàn)用細(xì)胞株：HepG2肝癌細(xì)胞（上海中科院）。

無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇等均為國(guó)藥分析純，胎牛血清、DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基及0.05%胰酶細(xì)胞消化液購(gòu)自Gibco公司，青霉素鏈霉素混合液及四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自Sigma公司，順鉑凍干粉每支10 mg購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司，二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自AMRESCO公司。

1.1.2 設(shè)備 TGL-16M低溫高速離心機(jī)，上海滬湘儀公司產(chǎn)品；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鄭州特爾儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；CU600型電熱恒溫水箱，上海越平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；BS124S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司產(chǎn)品；SOW-25DI冷凍高速微粉機(jī)，山東三清不銹鋼設(shè)備有限公司產(chǎn)品；Ps-250萬(wàn)能破碎機(jī)，南京威利朗食品機(jī)械有限公司產(chǎn)品；RY-NSG-20LC超聲波提取濃縮機(jī)，海銳元機(jī)械設(shè)備有限公司產(chǎn)品；Thermo Multiskan Go全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；Telstar Lyoquest-55凍干機(jī)，西班牙泰事達(dá)公司產(chǎn)品；LKTC-B1-T水浴恒溫振蕩器，常州國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小麥培養(yǎng)基的獲得 小麥、蠶蛹粉和營(yíng)養(yǎng)液（葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂1 g，VB1 1 mg，加水定容至法/三級(jí) mL，pH值自然），按質(zhì)量比（25∶2∶50）加入玻璃瓶中，封口，高溫高壓121℃滅菌60 min，放涼備用。培養(yǎng)基無(wú)菌環(huán)境下接蛹蟲(chóng)草菌種B6，培養(yǎng)子實(shí)體，子實(shí)體采收后，培養(yǎng)基烘干至含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于10%后，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 水熱回流提取法提取蛹蟲(chóng)草粗多糖 取2 g一定目數(shù)蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基粉末，用蒸餾水熱回流重復(fù)提取數(shù)次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮至1 g∶10 mL，冷卻后加入3倍量乙醇使其沉淀，離心后傾出上清液，沉淀加少量水溶解，加入2倍量乙醇使其沉淀，將最后沉淀物用蒸餾水溶解，并定容于50 mL容量瓶中，用苯酚硫酸法[26]測(cè)定蛹蟲(chóng)草多糖含量。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)：①培養(yǎng)基物料大小的影響。固定提取溫度為80℃，提取時(shí)間120 min，提取2次，料液比（1 g∶20 mL），物料大小設(shè)定為 20、40、60、80、100、200目，6個(gè)水平。②料液比影響。固定培養(yǎng)基目數(shù)為60目，提取溫度為80℃，提取時(shí)間120 min，提取 2 次，料液比（g/mL）設(shè)定為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，4個(gè)水平。③提取溫度的影響。固定培養(yǎng)基目數(shù)為60目，提取時(shí)間120 min，提取2次，料液比設(shè)定為 1 g∶20 mL， 提取溫度設(shè)為 60、80、100 ℃，3 個(gè)水平。④提取時(shí)間的影響。固定培養(yǎng)基目數(shù)為60目，提取溫度為80℃，提取2次，料液比設(shè)定為1 g∶20 mL， 提取時(shí)間設(shè)定為 60、120、180 min，3 個(gè)水平。⑤提取次數(shù)的影響。固定培養(yǎng)基目數(shù)為60目，浸提溫度為80℃，提取時(shí)間為120 min，料液比設(shè)定為 1 g∶20 mL，設(shè)定提取次數(shù)為 1、2、3 次，3 個(gè)水平。每水平3次重復(fù)。

1.2.3 超聲波水提法提取蛹蟲(chóng)草粗多糖 取2 g蛹蟲(chóng)草二茬培養(yǎng)基粉末，室溫20℃，用倍量體積蒸餾水于超聲提取器中超聲提取數(shù)次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮至1∶10（g/mL），冷卻后加入3倍量乙醇使其沉淀，離心后傾出上清液，沉淀加少量水溶解，加入2倍量乙醇使其沉淀，將最后沉淀物用蒸餾水溶解，并定容于50 mL容量瓶中，用苯酚硫酸法測(cè)定蛹蟲(chóng)草多糖含量。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)：①料液比影響。固定培養(yǎng)基目數(shù)為60目，超聲波時(shí)間為 60 min，浸提 2次，料液比（g/mL）設(shè)定為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，4 個(gè)水平。②超聲波時(shí)間的影響。固定培養(yǎng)基目數(shù)為60目，超聲波提取2次，料液比設(shè)定為 1 g∶20 mL，超聲波時(shí)間為 30、60、90 min，3個(gè)水平。③提取次數(shù)的影響。固定培養(yǎng)基目數(shù)為60目，超聲波時(shí)間為60 min，料液比設(shè)定為1 g∶20 mL，設(shè)定提取次數(shù)為 1、2、3 次，3 個(gè)水平。每水平3次重復(fù)。

1.2.4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)粗多糖得率的影響利用熱回流水提法單因素試驗(yàn)獲得的最佳工藝提取粗多糖濃縮液，設(shè)定醇沉體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%，5個(gè)水平3次重復(fù)，沉淀過(guò)夜，4000 r/min常溫離心，傾出上清液，冷凍干燥，獲得粗多糖質(zhì)量，計(jì)算粗多糖得率。

1.2.5 熱回流水提法提取蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基粗多糖正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案優(yōu)化水熱回流提取法提取蛹蟲(chóng)草二茬草培養(yǎng)基多糖最佳工藝參數(shù)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels in orthogonal design

1.2.6 蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基去脂去蛋白質(zhì)多糖A和去脂粗多糖B、水提醇沉粗多糖C的獲得 稱量60目的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基5 g，3次重復(fù)，1 g∶10 mL乙醇去脂處理，離心去乙醇后40℃烘干，料液比1 g∶25 mL，100℃熱回流提取3次、提取時(shí)間90 min、體積分?jǐn)?shù)80%乙醇、醇沉，離心傾出上清液，沉淀溶于少量蒸餾水，加2倍體積乙醇，醇沉離心，重復(fù)1次，沉淀用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚各清洗1次，獲得沉淀一半冷凍干燥獲得去脂粗多糖B；一半溶于少量蒸餾水，saverage（氯仿∶正丁醇=4∶1，體積比）去蛋白質(zhì) 5 次，加3倍無(wú)水乙醇，離心，沉淀冷凍干燥，獲得去脂去蛋白質(zhì)多糖A。

稱量60目培養(yǎng)基5 g，3次重復(fù)，料液比1 g∶25 mL，100℃熱回流提取3次、提取時(shí)間90 min、體積分?jǐn)?shù)80%乙醇、醇沉，離心傾出上清液，沉淀溶于少量蒸餾水，加2倍體積乙醇，醇沉離心，重復(fù)1次，沉淀用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚各清洗1次，沉淀干燥獲得水提醇沉粗多糖C。

1.2.7 蛹蟲(chóng)草子實(shí)體不同處理獲得提純多糖 稱量蛹蟲(chóng)草B6菌種培養(yǎng)的100目子實(shí)體粉5 g，3次重復(fù)，質(zhì)量比1∶10乙醇去脂去脂處理，離心去乙醇后 40 ℃烘干，料液比 1 g∶25 mL，60、80、100 ℃熱回流提取3次、提取時(shí)間90 min、體積分?jǐn)?shù)80%乙醇、醇沉，離心傾出上清液，沉淀溶于少量蒸餾水，加2倍體積乙醇，醇沉離心，重復(fù)1次，沉淀用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚各清洗 1 次，saverage（氯仿∶正丁醇=4∶1，體積比）去蛋白質(zhì)5次，加3倍無(wú)水乙醇，離心，沉淀用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚各清洗1次，沉淀冷凍干燥獲得去脂去蛋白質(zhì)多糖D、E、F。

采用菌種B6培養(yǎng)的100目蛹蟲(chóng)草子實(shí)體粉5 g，3次重復(fù)，料液比1 g∶25 mL，80℃熱回流提取3次、提取時(shí)間90 min、體積分?jǐn)?shù)80%乙醇醇沉，離心傾出上清液，沉淀溶于少量蒸餾水，加2倍體積乙醇，醇沉離心，重復(fù)1次，沉淀用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚各清洗1次，沉淀干燥獲得子實(shí)體水提醇沉粗多糖G。

1.2.8 MTT比色法測(cè)定提取多糖抗腫瘤活性 配置加體積分?jǐn)?shù)10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)肝癌Hepg2細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用體積分?jǐn)?shù)0.05%胰酶消化，加含體積分?jǐn)?shù)10%牛血清的DMEM培養(yǎng)液吹打成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×104每孔后，接種于96孔板中，每孔接種200 μL細(xì)胞懸液，37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，棄培養(yǎng)液，給藥組分別加入200 μL質(zhì)量濃度分別為0.25、0.5、1、2.5、5 mg/mL 的藥物 A、B、C、D、E、F、G， 對(duì)照組則加入等體積的完全培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照加質(zhì)量濃度為20 μg/mL順伯，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 24、48、72 h。每孔加入 10 μL濃度為5 mg/mL MTT試劑培養(yǎng)4 h。小心棄去上清液，每孔加入 100 μL DMSO，振蕩 10 min，再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD492，由測(cè)得的吸光度計(jì)算抑制率。

式（1）中，I為抑制率；OD0為對(duì)照組 OD 值；OD1為給藥組OD值。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行處理，單因素、二因素方差分析、正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析、方差分析、圖表制圖采用SPSS 19.0、Excel軟件制作分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗多糖提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 物料顆粒大小、提取溫度對(duì)熱回流水提法提取粗多糖含量的影響 由表2可知，采用熱回流水提法提取蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基粗多糖，物料大小從20～60目，粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加明顯，差異顯著；60～100目后粗多糖含量趨于平穩(wěn)，無(wú)顯著差異，200目粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低。

粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著提取溫度提高而增加，提取溫度80℃時(shí)粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較提取溫度60℃時(shí)有明顯提高且差異顯著，但較提取溫度100℃時(shí)粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著差異。

表2 物料大小、提取溫度對(duì)粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響Table2 Effect of diameter of materials and extraction temperature on the content of coarse polysaccharide

2.1.2 時(shí)間對(duì)熱回流水提法和超聲波水提法提取粗多糖含量的影響 由表3可知，物料大小60目、提取溫度為80℃、提取2次、料液比1 g∶20 mL、熱回流提取法的提取時(shí)間為120 min時(shí)粗多糖得率最高，較提取時(shí)間為60 min和180 min，有顯著差異。

物料大小60目、提取2次時(shí)、料液比1 g∶20 mL，室溫超聲波水提法提取時(shí)間30 min粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，與提取時(shí)間60 min處理有顯著差異，與提取時(shí)間90 min處理無(wú)顯著差異。在料液比、物料大小、提取時(shí)間同為60 min時(shí)，熱回流水提法提取粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于超聲波水提法。

表3 提取時(shí)間對(duì)粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響Table3 Effect of extraction time on the content of coarse polysaccharide

2.1.3 料液比對(duì)熱回流水提和超聲波水提粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 由表4可知，熱回流水提法，提取時(shí)間為120 min、物料大小60目、提取溫度為80℃、提取2次，料液比為1 g∶20 mL時(shí)粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，較料液比1 g∶10 mL 和 1 g∶15 mL 有顯著差異；與料液比為1 g∶25 mL時(shí)粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著差異。

超聲波水提法，提取時(shí)間30 min、物料大小60目、室溫提取2次，料液比為1 g∶25 mL時(shí)粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，較其他處理差異顯著。

表4 料液比對(duì)粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響Table4 Effect of ratio of materialto solvent raw（w/v） on the content of coarse polysaccharide

2.1.4 熱回流水提和超聲波水提提取次數(shù)對(duì)粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 由表5可知，在料液比1 g∶20 mL、物料大小60目，提取溫度為80℃、提取時(shí)間120 min，熱回流提取3次時(shí)粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，較提取2次處理無(wú)顯著差異，與提取1次處理有顯著差異。

在料液比1 g∶20 mL、物料大小60目、提取時(shí)間30 min時(shí)，室溫超聲波提取3次時(shí)粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，較提取1次和提取2次粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著差異。

表5 提取次數(shù)對(duì)粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響Table5 Effect of extraction number on the content of coarse polysaccharide

2.1.5 乙醇濃度對(duì)熱回流水提培養(yǎng)基粗多糖得率的影響 由表6可知，熱回流法提取蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基多糖，醇沉濃度越高，粗多糖得率越高，醇沉體積分?jǐn)?shù)60%～70%時(shí)，粗多糖得率無(wú)顯著差異，醇沉體積分?jǐn)?shù)90%時(shí)，粗多糖得率最高，達(dá)25.146%，與其他處理有顯著差異。

表6 醇沉濃度對(duì)粗多糖得率的影響Table6 Effect of extraction number on the content of coarse polysaccharide

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

由方差分析可知，影響提取多糖含量的因素中提取溫度、提取次數(shù)、提取時(shí)間、料液比對(duì)提取蛹蟲(chóng)草二茬草培養(yǎng)基粗多糖的提取率具有顯著的影響，4個(gè)因素的主次關(guān)系是：提取溫度＞提取時(shí)間＞提取次數(shù)＞料液比。通過(guò)鄧肯多重比較和邊際均值的直觀圖和經(jīng)濟(jì)成本的考慮，確定提取蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基粗多糖的最佳工藝為A3B2C1D3，即提取溫度為100℃、提取3次、提取90 min、料液比1 g∶25 mL。該工藝為正交試驗(yàn)8號(hào)處理，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為34.724 g/hg，為正交試驗(yàn)所有處理中最高，提取工藝優(yōu)良得到了驗(yàn)證（表 7、8，圖 1）。2015 年王雪等[10]利用超聲波—酶法所得蛹蟲(chóng)草大米基質(zhì)多糖的得率為30.27%，數(shù)據(jù)偏高是因?yàn)樾←溑囵B(yǎng)基多糖組成復(fù)雜，既有菌絲體多糖、子實(shí)體多糖、小麥淀粉，也有蟲(chóng)草生長(zhǎng)過(guò)程中轉(zhuǎn)化的產(chǎn)生的多糖。已有除淀粉的相關(guān)研究[5]，本研究認(rèn)為培養(yǎng)基淀粉具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，除淀粉工藝需要從產(chǎn)品安全性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和開(kāi)發(fā)成本綜合考慮。

表7 正交表L9（34）及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table7 Orthogonal table and experimental results

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table8 Analysis of variance of orthogonal experiment

圖1 不同處理的粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的估算邊際均值Fig.1 Mean estimate the marginal average about content of coarse Polysaccharide of different treatments

2.3 蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基提取多糖和子實(shí)體多糖對(duì)Hepg2腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

采用MTT法測(cè)定蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基、子實(shí)體多糖提取物對(duì)Hepg2腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2、3所示。①藥物質(zhì)量濃度5 mg/mL時(shí)，所有藥物對(duì)Hepg2腫瘤細(xì)胞的抑制率與培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)；培養(yǎng)72 h后，培養(yǎng)基脫脂脫蛋白多糖A的抑制率為83.02%，培養(yǎng)基脫脂多糖B的抑制率為75.388%，培養(yǎng)基粗多糖C的抑制率為30.612%；100℃熱回流水提蛹蟲(chóng)草子實(shí)體脫脂脫蛋白質(zhì)多糖F72 h培養(yǎng)后，對(duì)Hepg2細(xì)胞抑制率平均值達(dá)到92.974%，超過(guò)了對(duì)照SB對(duì)Hepg2細(xì)胞抑制率，80℃熱回流水提蛹蟲(chóng)草子實(shí)體多糖G72 h培養(yǎng)后，對(duì)Hepg2細(xì)胞抑制率平均值為67.09%，子實(shí)體多糖對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率與水提溫度呈正相關(guān)。②質(zhì)量濃度為2.5～5 mg/mL，作用時(shí)間為72 h，多糖A對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的抑制率好于多糖B，而質(zhì)量濃度為0.25～1 mg/mL的抑制率則相反，但絕對(duì)值較低。③藥物質(zhì)量濃度 2.5 mg/mL 時(shí)，D、E、F、G，在48、72 h培養(yǎng)后，對(duì)Hepg2細(xì)胞抑制率均為正效應(yīng)；藥物F、G，在48、72 h培養(yǎng)后，所有質(zhì)量濃度對(duì)Hepg2細(xì)胞抑制率均為正效應(yīng)。④藥物質(zhì)量濃度1～0.25 mg/mL 時(shí)，24 h 培養(yǎng)后 D、E、F、G 對(duì) Hepg2 細(xì)胞抑制率均為負(fù)效應(yīng)。⑤除D外，所有藥物培養(yǎng)72 h后，對(duì)Hepg2細(xì)胞抑制率與濃度呈正相關(guān)。

圖2 蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基提取物及對(duì)照SB對(duì)Hepg2腫瘤細(xì)胞的平均抑制率Fig.2 Production of mean estimate the marginal about different treatments

圖3 蛹蟲(chóng)草子實(shí)體提取物及對(duì)照SB對(duì)Hepg2腫瘤細(xì)胞平均抑制Fig.3 Production of mean estimate the marginal about different treatments

由表9可知，培養(yǎng)72 h后，多糖A和F質(zhì)量濃度為5、2.5 mg/mL時(shí)，對(duì)Hepg2細(xì)胞抑制率差異顯著，質(zhì)量濃度為1～0.25 mg/mL時(shí)，對(duì)Hepg2細(xì)胞抑制率差異不顯著；但多糖A和F各自不同質(zhì)量濃度處理對(duì)Hepg2細(xì)胞抑制率差異顯著，且抑制率與多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

表9 培養(yǎng)72 h后多糖F和多糖A對(duì)Hepg2腫瘤細(xì)胞的平均抑制率Table9 Average inhibition rate of against HepG2 tumor cell of F and A polysaccharide A after 72 h training

蛹蟲(chóng)草子實(shí)體多糖抗腫瘤研究較多，效果也比較肯定。蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖研究證明蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖對(duì)酒精誘導(dǎo)的小鼠急性、亞急性肝損傷有明顯的保護(hù)作用[27]，抗腫瘤作用的相關(guān)研究尚少見(jiàn)報(bào)道。JING等[28]從蛹蟲(chóng)草分離出一種新的低分子多糖（CMP-1），作用于 HepG2肝癌細(xì)胞 48 h后，IC50值為0.1763 mg/mL。本試驗(yàn)多糖復(fù)合物 A、B、D、E、F、G在濃度小于1 mg/mL時(shí)，作用于HepG2肝癌細(xì)胞48 h后，抑制率均未超過(guò)50%，可以推測(cè)多糖成分的純化，一定程度上有利于對(duì)腫瘤抑制率的提高。同時(shí)葛曉宇[29]發(fā)現(xiàn)純化獲得質(zhì)量濃度為2 mg/mL的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體酸性多糖（F2），培養(yǎng)48 h后，對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的抑制率達(dá)到27.9%。本試驗(yàn)質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL培養(yǎng)基脫脂脫蛋白質(zhì)多糖（A），作用于HepG2肝癌細(xì)胞48 h，制率達(dá)73.238%，培養(yǎng)72 h后抑制率達(dá)79.735%，培養(yǎng)基提純多糖表現(xiàn)出較高的抑制率。

3 結(jié)語(yǔ)

多糖的提取、分離和純化是相對(duì)復(fù)雜的工藝，多糖純度越高，提取成本越高。自然提取多糖產(chǎn)品開(kāi)發(fā)需要綜合考慮開(kāi)發(fā)產(chǎn)品的功效、成本和安全，本試驗(yàn)旨在為最大限度提高產(chǎn)品的性價(jià)比提供一定的參考。本研究對(duì)蛹蟲(chóng)草小麥培養(yǎng)基通過(guò)熱回流水提取法、超聲波提取多糖單因素試驗(yàn)進(jìn)行比較，得出熱回流水提法提取多糖效果較優(yōu)，這與以往研究結(jié)果[5-7]一致。本試驗(yàn)以蛹蟲(chóng)草小麥培養(yǎng)基為原料，通過(guò)熱回流水提法正交試驗(yàn)結(jié)合提取成本優(yōu)化粗多糖提取工藝。結(jié)果表明提取溫度100℃、料液比1∶25、提取3次、每次提取時(shí)間90 min，為蛹蟲(chóng)草小麥培養(yǎng)基粗多糖最佳提取工藝。不同提純處理后獲得的培養(yǎng)基多糖通過(guò)MTT試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞抑制率，結(jié)果表明質(zhì)量濃度為5 mg/mL、培養(yǎng)時(shí)間72 h時(shí)，培養(yǎng)基提純多糖表現(xiàn)出較高的抑制率，培養(yǎng)基脫脂脫蛋白質(zhì)多糖A對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞抑制率＞脫脂多糖B＞未脫脂脫蛋白質(zhì)粗多糖C；多糖抑制率與濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)，在一定范圍增加粗多糖的濃度和作用細(xì)胞時(shí)間，有利于對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率的提高。