超聲-轉谷氨酰胺酶改善紅豆蛋白功能性質及結構

趙城彬，尹歡歡，劉景圣，許秀穎，張 浩，吳玉柱，曹 勇，齊寶坤*，吳 非*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

紅豆又叫紅小豆、赤豆等，是我國重要的豆科植物，在我國種植和利用已有2 000多年的歷史。作為淀粉質豆類，紅豆中含有豐富的膳食纖維和一定量的鈣、磷、鐵以及B族維生素等。其中淀粉質量分數(shù)最高，為41.83%～59.89%，其次為蛋白質，其質量分數(shù)為16.33%～29.2%，氨基酸種類齊全且組成均衡，是一種潛在的優(yōu)質豆類蛋白資源[1]。轉谷氨酰胺酶（transglutaminase，TG）是一種由一個多肽鏈組成的蛋白質，其結構中含有331 個氨基酸。TG是一種對Ca2+不敏感的有益酶，并能在寬泛的pH值范圍內發(fā)揮作用。TG可使許多蛋白質系統(tǒng)形成異肽鍵并發(fā)生交聯(lián)反應，這些異肽鍵的形成表明TG處理可以修飾蛋白質結構，進而導致蛋白質功能性質的改變，甚至使蛋白質產(chǎn)生新特性[2]。Hwang等[3]研究表明紅豆蛋白含有大量的賴氨酸，通過TG交聯(lián)能夠形成ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸異肽鍵，利于改善蛋白質的乳液性質和凝膠的溶解度。

蛋白質的適當變性可以促進蛋白質對TG的敏感性，通過熱處理或添加亞硫酸氫鹽等還原劑使蛋白質變性可以增強TG催化蛋白質之間的交聯(lián)反應[4]。近年來，超聲技術由于具有空化效應、剪切作用以及湍流作用，廣泛應用于食品蛋白的加工中，并成為國內外的研究熱點。何秋實[5]研究超聲處理對紅豆蛋白功能性質影響，并采用拉曼光譜分析了紅豆蛋白結構特征，發(fā)現(xiàn)超聲處理能夠修飾紅豆蛋白二級結構，改善蛋白質溶解性、表面疏水性和乳化性。Xiong Ting等[6]發(fā)現(xiàn)采用低頻（20 kHz）超聲處理30 min能夠引起豌豆蛋白的適當變性，誘導蛋白分子部分展開，同時改善蛋白質的功能性質。超聲引起蛋白質變性的效率高，可為促進TG交聯(lián)蛋白質提供可能，且在常溫下就能實現(xiàn)，避免高溫和化學變性劑對蛋白質產(chǎn)生不利影響。目前，對紅豆蛋白的研究均是采用單獨超聲處理或單獨TG處理，鮮見關于超聲-TG聯(lián)合作用于紅豆蛋白結構修飾及功能性質改善的相關報道。

本實驗的目的是考察超聲是否能夠改變紅豆蛋白的致密結構，并提高蛋白質對TG的敏感性，從而促進TG對蛋白質的修飾和功能性質的改善作用。采用超聲-TG聯(lián)合處理紅豆蛋白，對其乳化性、發(fā)泡性和凝膠性進行研究，并分析其表面疏水性、游離巰基含量、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）和熱特性，以期探究其結構修飾與功能性質的構效關系，為研發(fā)高功能性紅豆蛋白及闡明其相關機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅豆品種為‘白紅11號’（蛋白質量分數(shù)21.59%、淀粉質量分數(shù)56.82%、脂肪質量分數(shù)0.74%、纖維質量分數(shù)7.98%、水分質量分數(shù)8.12%、灰分質量分數(shù)3.43%），購自吉林省白城市。

TG、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonate，ANS）、溴化鉀 美國Sigma公司；5,5’-二巰基-2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB） 青島捷世康生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

JY92-2D超聲探頭發(fā)生器 寧波新芝生物科技股份有限公司；高速離心機 上海安亭科學儀器廠；Alpha1-4LDplus冷凍干燥機 德國Christ公司；DU800型紫外-可見分光光度計 美國貝克曼庫爾特有限公司；臺式掃描電子顯微鏡 荷蘭Phenom公司；TA-XT2質構儀 英國Stable Micro Systems公司；F-4500熒光分光光度計 日本Hitachi公司；VERTEX 70 FTIR儀德國Bruker公司；PE Pyris 6差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 紅豆分離蛋白的制備

將紅豆60 ℃烘干后脫皮，然后粉碎過60 目篩，采用正己烷以4∶1（m/V）的比例對紅豆粉進行脫脂3 h，6 000×g離心20 min后，將沉淀風干得到脫脂紅豆粉。將脫脂紅豆粉與蒸餾水以1∶10（m/V）的比例混合，采用2 mol/L NaOH溶液調pH值至8.5，在50 ℃下攪拌提取2 h，然后在6 000×g條件下離心20 min，采用2 mol/L HCl溶液調節(jié)上清液pH值至4.5，然后以同樣的條件離心，取沉淀水洗3 次，將沉淀復溶后調節(jié)pH值為7.0，然后冷凍干燥即得紅豆分離蛋白（red bean protein isolate，RBPI）。采用凱氏定氮法（GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》）測定蛋白質量分數(shù)，得到RBPI中蛋白質量分數(shù)為90.86%。

1.3.2 超聲-TG處理RBPI

將適量的RBPI溶解于蒸餾水中，室溫下攪拌2 h，得到質量分數(shù)9%的蛋白溶液。實驗分為單獨超聲（US）處理組和超聲-TG（US-TG）組，對于US處理組：采用400 W、20 kHz條件下進行超聲處理0、5、10 min，超聲處理采用間歇式（超聲2 s、間歇4 s），且樣品置于冰浴中，保持溫度為25～30 ℃。對于US-TG處理組：向超聲處理后的蛋白溶液中添加20 U/g TG，1 000 r/min攪拌2 min確保酶在樣品中均勻分散。將樣品分為兩部分，一部分在40 ℃下反應2 h，冷凍干燥，用于乳化性、發(fā)泡性及結構測定；另一部分在40 ℃下反應6 h，4 ℃冷藏過夜，用于凝膠微觀結構和質構分析。對照組為未經(jīng)超聲及TG處理的RBPI，其他處理與實驗組樣品相同。

1.3.3 乳化性測定

將蛋白樣品溶解于0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，使蛋白質量濃度為2 mg/mL。以1∶3的體積比添加大豆油，于22 000 r/min下均質2 min，分別在0 min和10 min時，從測試管底部取樣50 μL，用0.1 g/100 mL SDS溶液稀釋100 倍，測定500 nm波長處的吸光度，以0.1 g/100 mL SDS溶液為空白。乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsifying stability index，ESI）的計算分別見公式（1）、（2）。

式中：D為稀釋倍數(shù)（100）；ρ為蛋白質量濃度/（g/mL），φ為比色皿光程（1 cm）；θ為乳液中油相所占比例（0.25），A0和A10分別為0 min和10 min時的吸光度。

1.3.4 發(fā)泡性測定

將蛋白樣品溶解于0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，配制成1 g/100 mL的蛋白溶液，在10 000 r/min下均質5 min，立即記錄泡沫體積V0/mL。靜置30 min后，再次記錄泡沫體積V30/mL。發(fā)泡能力（foaming capacity，F(xiàn)C）及泡沫穩(wěn)定性（foaming stability，F(xiàn)S）計算分別見公式（3）、（4）

式中：Vs為樣品溶液體積/mL。

1.3.5 凝膠微觀結構觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察凝膠樣品的微觀結構。參照Xu Xiuying等[7]的方法，取一定量凝膠樣品放于離心管中，迅速液氮冷凍，然后冷凍干燥脫水。將凍干樣品置于鋁箔上，用雙面膠碳帶固定，然后離子濺射噴金，置于掃描電子顯微鏡觀察臺上進行微觀結構觀察。設置加速電壓為5 kV，放大500 倍。

1.3.6 凝膠質構特性測定

采用TA-XT2質構儀對凝膠質構特性進行測定。首先將凝膠樣品在室溫下靜置一定時間，然后將樣品放于測量臺上，采用P/0.5的探頭進行測定，模式選擇TPA模式，設置壓縮前速率3.0 mm/s，壓縮中速率2.0 mm/s，壓縮后速率3.0 mm/s，凝膠壓縮比例為30%，兩次下壓間隔5 s，觸發(fā)力為5 g。記錄凝膠的硬度和黏附力。

1.3.7 凝膠脫水收縮作用測定

將凝膠樣品（質量為mt/g）在室溫下靜置10 min以達到溫度平衡，然后在室溫下以5 000 r/min離心10 min，取上清液測定其質量（ms/g），并計算脫水收縮作用（公式（5））。

1.3.8 表面疏水性和游離巰基含量測定

蛋白質表面疏水性通過疏水熒光探針ANS測定，熒光激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為390 nm和470 nm。蛋白樣品溶液質量濃度為0.05～1.00 mg/mL，取8 mmol/L ANS溶液40 μL添加到4 mL的蛋白溶液中，混勻后測定熒光強度，蛋白質表面疏水性用熒光強度對蛋白濃度的斜率表示。

游離巰基含量采用Ellman’s試劑（10 mmol/L DTNB）測定，吸光度采用紫外-可見分光光度計在412 nm波長處測定，游離巰基含量采用摩爾消光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計算，以每克蛋白質中含有的巰基物質的量表示，單位為μmol/g。

1.3.9 FTIR測定

參照Zhao Chengbin等[8]的方法進行FTIR測定，將0.1 mg蛋白樣品與4 mg溴化鉀用研缽充分研磨成均勻粉末，壓制成薄片，然后進行全波段掃描（4 000～400 cm-1），掃描次數(shù)為64 次，分辨率為4 cm-1，測定溫度為25 ℃。采用紅外光譜圖分析軟件Peak Fit 4.12對圖譜的酰胺I帶1 700～1 600 cm-1進行分析，計算蛋白質各二級結構含量。

1.3.10 熱特性測定

參考趙城彬等[9]的方法，樣品的熱特性通過DSC儀測定。取3 mg蛋白樣品于鋁盤中，壓片并以空鋁盤為對照。以5 ℃/min的升溫速率由20 ℃升至120 ℃，氮氣流速為50 mL/min。記錄此過程的起始溫度（To）、峰值溫度（Tp）、終止溫度（Te）和熱焓變（ΔH）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每組實驗重復3 次，采用Origin 8.0軟件作圖，采用SPSS 17.0軟件進行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同處理對RBPI乳化性的影響

圖1 超聲-轉谷氨酰胺酶處理對RBPI乳化性的影響Fig. 1 Effect of US-TG treatment on emulsifying properties of RBPI

如圖1所示，超聲和TG均對乳化活性具有很大的影響。與對照相比，超聲處理5 min能夠使RBPI的乳化活性顯著增加（P＜0.05），而超聲處理10 min會使RBPI的乳化活性稍有降低，但影響不顯著（P＞0.05）。短時間超聲處理能夠使蛋白質部分展開，分子柔順性增加，同時促進蛋白質溶解，利于乳化活性的改善；然而長時間超聲處理會使水相中的蛋白質聚集，導致體系的乳化活性降低。Chandrapala等[10]也報道了超聲處理α-乳白蛋白和β-乳球蛋白混合物能夠提高蛋白質聚集，降低表面疏水性，從而影響其乳化性能。TG能夠使RBPI的乳化活性提高，這是由于TG催化蛋白質相互交聯(lián)，促進了蛋白粒子的兩親特性，并且增強了肽鏈-脂肪相互作用。因此，肽鏈更容易被吸附在水-脂肪界面上，導致乳化活性增強。在多肽形成過程中引起的靜電排斥可能防止蛋白質積聚，從而減少蛋白質聚集[11]。Anuradha等[12]報道了TG處理β-乳球蛋白能使蛋白質乳化活性提高約30%。然而，超聲-TG聯(lián)合處理能夠使RBPI的乳化活性進一步提高，這可能是因為超聲處理使RBPI的分子鏈展開，暴露出更多的基團，導致TG交聯(lián)蛋白質的能力提高。

無論是否添加TG，超聲處理對乳液穩(wěn)定性均沒有顯著影響（P＞0.05），而TG處理的RBPI乳化穩(wěn)定性顯著提高（P＜0.05）。Fraergemand等[13]也得到了相似的結果，他們發(fā)現(xiàn)TG處理的β-乳球蛋白與天然β-乳球蛋白形成的乳液相比，穩(wěn)定性得到了改善。TG處理形成異肽鍵可能是改善蛋白質乳液穩(wěn)定性的原因，如泡沫和乳液的穩(wěn)定性。

2.2 不同處理對RBPI發(fā)泡性的影響

圖2 超聲-轉谷氨酰胺酶處理對RBPI發(fā)泡性的影響Fig. 2 Effect of US-TG treatment on foaming properties of RBPI

由圖2可知，超聲處理顯著提高了RBPI的發(fā)泡能力（P＜0.05），且超聲處理10 min的發(fā)泡能力顯著高于超聲處理5 min的樣品。由此可以推斷，超聲通過均質化作用使脂肪和蛋白顆粒在溶液中分布得更加均勻，從而對樣品發(fā)泡能力具有積極作用。此外，超聲處理能夠使蛋白分子尺寸減小，這利于蛋白質發(fā)泡能力的改善[14]。Jambrak等[15]報道了采用20 kHz和40 kHz的高強度超聲處理15 min，乳清分離蛋白的發(fā)泡能力由132%分別增加至235%和220%。此外，還有研究也發(fā)現(xiàn)高強度（20 kHz和40 kHz）超聲對α-乳白蛋白同樣具有類似的影響，而低強度超聲卻不能改善樣品的發(fā)泡特性[5]。相反，TG的添加會破壞乳清蛋白的發(fā)泡能力。蛋白質的發(fā)泡能力與它在空氣-水界面上形成一層薄而堅固的液膜能力有關，并影響膜內氣泡的形成[14]。TG降低發(fā)泡能力的一個合理解釋是，TG的添加增強了蛋白質的交聯(lián)和黏度，使蛋白質顆粒失去了吸附在空氣-水界面上的能力，從而抑制泡沫的形成。此外，與TG相比，超聲-TG聯(lián)合處理使RBPI的發(fā)泡能力進一步降低。

泡沫穩(wěn)定性也受超聲和TG處理的影響。超聲處理會降低樣品的泡沫穩(wěn)定性，超聲處理10 min的樣品與其他樣品相比泡沫穩(wěn)定性下降，但在整個超聲處理過程中沒有顯著性變化（P＞0.05）。然而，Jambrak等[15]發(fā)現(xiàn)400 W、20 kHz超聲處理15 min對乳清分離蛋白的泡沫穩(wěn)定性具有積極的作用，使泡沫穩(wěn)定性由68.3 min增加至98.4 min。Tan等[16]也發(fā)現(xiàn)隨著超聲振幅的增加和超聲時間的延長，乳清蛋白泡沫析水減少。這些研究結果與本實驗得到的結果之間存在差異，這可能是植物蛋白（紅豆蛋白）和動物蛋白（乳清蛋白）性質不同以及超聲處理條件的不同等多方面因素的結果。TG對發(fā)泡能力和泡沫穩(wěn)定性的影響是相反的。TG處理破壞了樣品的發(fā)泡能力，卻形成了更穩(wěn)定的泡沫。這說明發(fā)揮蛋白質交聯(lián)作用的共價鍵作為發(fā)泡能力的不良因素似乎是泡沫穩(wěn)定性的促進劑。Agyare等[17]也報道了在不同pH值水平下，TG處理的小麥谷蛋白水解物的發(fā)泡能力與泡沫穩(wěn)定性之間成反比關系。此外，超聲10 min聯(lián)合TG處理使RBPI的泡沫穩(wěn)定性得到顯著提高（P＜0.05），這也說明了TG處理蛋白質之前的超聲處理能夠提高蛋白質的交聯(lián)程度，從而改善泡沫穩(wěn)定性。

2.3 不同處理對RBPI凝膠性質的影響

2.3.1 凝膠微觀結構

許多學者對TG誘導的各種蛋白質凝膠微觀結構做了大量研究[18]，因此，本實驗探究了超聲和TG聯(lián)合作用對RBPI凝膠微觀結構的影響。如圖3所示，未經(jīng)超聲處理的條件下，TG誘導的RBPI凝膠具有松散片狀的微觀結構，在蛋白凝膠網(wǎng)絡中具有較大的孔隙，更少的交聯(lián)，更不均勻的結構（圖3A）。超聲和TG的聯(lián)合處理對凝膠微觀結構具有很大的影響（圖3B、C）。超聲處理可使TG誘導凝膠的微觀結構更加均勻致密，且孔隙度更小，超聲處理5 min聯(lián)合TG誘導的凝膠樣品與其他樣品相比微觀結構更加均勻。Zhao等[19]也報道了山羊奶經(jīng)超聲處理后凝膠結構發(fā)生了顯著變化，他們指出，超聲預處理可以使山羊奶形成更緊湊的凝膠結構，導致孔隙更小。Riener等[20]在超聲處理的酸奶凝膠中也得到了同樣的結果，即超聲處理促進了蛋白質分子之間的交聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)超聲的空化效應會導致蛋白分子部分展開并暴露出活性基團[21]，這可能會促進TG催化的交聯(lián)反應，導致凝膠微觀結構出現(xiàn)差異。

圖3 超聲-轉谷氨酰胺酶誘導的RBPI凝膠掃描電子顯微鏡圖（×500）Fig. 3 Scanning electron microscope (SEM) images of RBPI gel induced by US-TG treatment (× 500)

2.3.2 凝膠質構特性和脫水收縮作用

超聲和TG處理對組分之間的相互關系和結構性質均具有重要影響，因此兩者聯(lián)合作用能夠改善蛋白質凝膠的質構特性。如表1所示，質量分數(shù)9%的RBPI溶液經(jīng)過TG處理能夠形成具有一定硬度（965.9 g）和黏附力（11.65 g·s）的凝膠。Gauche等[22]研究發(fā)現(xiàn)向乳清蛋白中添加TG可以改善凝膠的質構特性，其硬度和黏附力均得到改善。超聲處理能夠使TG誘導的RBPI凝膠硬度和黏附力增加。Frydenberg等[23]也報道了超聲處理對乳清蛋白凝膠的硬度具有相似的影響，他們發(fā)現(xiàn)由于二硫鍵含量的增加，非熱條件下的超聲處理顯著提高了蛋白質的凝膠硬度。然而，當超聲處理達到10 min時，TG誘導的凝膠樣品硬度相比于超聲處理5 min的樣品硬度顯著降低（P＜0.05），這可能是由于超聲促進了TG對蛋白質的交聯(lián)作用，但過度交聯(lián)會形成超長分子的蛋白質，不利于凝膠網(wǎng)絡均勻結構的形成[14]。在相同條件下，超聲處理5 min不會使TG誘導的RBPI凝膠黏附力發(fā)生顯著改變，超聲處理10 min才能使凝膠黏附力顯著升高（P＜0.05），這可能僅僅與樣品表面特性的改變有關。由此可以推斷，長時間超聲處理促進了TG的交聯(lián)作用，而交聯(lián)過程中形成的共價鍵可能是蛋白凝膠黏附力增強的原因[24]。

TG誘導的RBPI凝膠的脫水收縮作用為4.08%，超聲處理顯著降低了TG誘導凝膠的脫水收縮作用（P＜0.05）。與超聲10 min聯(lián)合TG處理的凝膠樣品相比，超聲5 min聯(lián)合TG處理的凝膠樣品具有更低的脫水收縮作用（表1）?？梢酝茢?，TG的交聯(lián)作用使聚合度增加，從而降低了凝膠結構中的孔隙尺寸，形成更加均勻、一致的結構，此外超聲處理也有助于樣品中孔隙的均勻分布。然而，過長的超聲時間會導致脫水收縮作用的增加，這可能是樣品中過多聚集體形成導致的，超聲10 min聯(lián)合TG處理的凝膠樣品就是最好證明。脫水收縮作用得到的結果與SEM結果一致，證實了超聲和TG的聯(lián)合作用是一個重建凝膠結構的可行方法，同時使凝膠結構更加均勻。Frydenberg等[23]報道在α-乳白蛋白與β-乳球蛋白質量比較高的溶液中，超聲處理可以有效增加其凝膠持水性，這與本研究中降低脫水收縮作用的效果相同。這種脫水收縮作用下降可能是大量的解折疊和分子間二硫鍵數(shù)量增加從而形成更緊湊的凝膠結構導致的[25]。

表1 超聲-轉谷氨酰胺酶誘導的RBPI凝膠硬度、黏附力和脫水收縮作用Table 1 Hardness, adhesiveness and syneresis of RBPI gel induced by US-TG treatment

2.4 不同處理對RBPI表面疏水性和游離巰基含量的影響

表面疏水性用來表征在極性環(huán)境中蛋白質表面疏水殘基的數(shù)量，可反映蛋白質構象變化。游離巰基是蛋白質中重要的官能團，它能參與弱次級鍵的形成，維持三級結構穩(wěn)定，其含量能反映蛋白質的變性程度。表面疏水性和游離巰基含量均與蛋白質的功能性質密切相關。

如圖4所示，與對照組相比，超聲處理5 min的RBPI的表面疏水性顯著增加（P＜0.05），由507.43增加至562.75。超聲處理會破壞蛋白質空間結構，使蛋白分子發(fā)生部分解折疊和展開，暴露出內部的疏水基團，導致表面疏水性增加[26]。然而，TG處理會使RBPI的表面疏水性顯著降低（P＜0.05），這可能是由于TG催化蛋白質交聯(lián)，形成分子間和分子內共價鍵，蛋白質分子發(fā)生聚集，將疏水基團包裹在分子內部[17]。此外，Gauche等[27]報道采用TG處理乳清蛋白后，谷氨酰胺和ε-氨基發(fā)生部分脫酰胺反應，產(chǎn)生帶負電的氨基酸，這也是導致表面疏水性降低的一個原因。超聲-TG聯(lián)合處理RBPI的表面疏水性進一步降低，這表明超聲和TG聯(lián)合處理具有協(xié)同作用，能夠促進蛋白質的交聯(lián)反應而發(fā)生聚集，造成疏水基團的內卷。

圖4 超聲-轉谷氨酰胺酶處理對RBPI表面疏水性和游離巰基含量的影響Fig. 4 Effect of US-TG treatment on surface hydrophobicity and free sulfhydryl content of RBPI

游離巰基含量與表面疏水性變化趨勢相似。超聲處理會顯著增加RBPI的游離巰基含量（P＜0.05），這可能是由于超聲產(chǎn)生的空化和微流束作用使蛋白質分子內和分子間的二硫鍵發(fā)生斷裂，導致包埋于蛋白質內部的巰基基團暴露[28]。然而，經(jīng)TG處理后RBPI的游離巰基含量顯著下降（P＜0.05），Stangierski等[29]采用TG處理肌原纖維蛋白也得到了類似的結果。TG通過交聯(lián)作用使蛋白質形成高分子多聚體，在這個過程中游離巰基可轉化為二硫鍵。經(jīng)過超聲-TG聯(lián)合處理的RBPI具有更低的游離巰基含量，表明RBPI經(jīng)過超聲處理后更利于TG對蛋白質的交聯(lián)作用。

2.5 不同處理RBPI的FTIR分析結果

蛋白質功能性質改善過程中其結構也發(fā)生改變，F(xiàn)TIR圖譜能夠有效提供蛋白質的結構信息。由圖5可知，與未經(jīng)處理的RBPI相比，超聲處理后RBPI紅外光譜的酰胺I帶處吸收峰沒有明顯變化，而經(jīng)TG處理和超聲-TG聯(lián)合處理后RBPI酰胺I帶處吸收峰強度明顯增加，這可能是由于TG催化蛋白質之間的交聯(lián)作用，增加了氫鍵的形成[30]。此外，超聲-TG聯(lián)合處理的RBPI酰胺I帶處吸收峰強度高于TG處理的RBPI，說明超聲-TG聯(lián)合處理進一步提高了TG的交聯(lián)作用。

對FTIR光譜中的酰胺I帶進行去卷積，然后進行二階導數(shù)擬合，得到各子峰所對應的歸屬：1 650～1 660 cm-1為α-螺旋，1 618～1 640 cm-1和1670～1690 cm-1為β-折疊，1 660～1 670 cm-1和1 690～1 700 cm-1為β-轉角，1 640～1 650 cm-1為無規(guī)卷曲[31]。通過峰面積計算得到各二級結構的含量，結果見表2。超聲處理5 min后RBPI的α-螺旋和β-轉角含量顯著降低（P＜0.05），無規(guī)卷曲含量顯著增加（P＜0.05），β-折疊含量變化不顯著（P＞0.05），這說明超聲處理能夠降低蛋白質二級結構的有序性，使二級結構變得更加無序。Hu Hao等[21]采用功率為200 W的超聲處理大豆蛋白15 min，導致二級結構發(fā)生顯著改變，無序結構含量大幅上升，這與本研究結果一致。與未經(jīng)處理的RBPI相比，TG處理會導致RBPI的α-螺旋和無規(guī)卷曲含量顯著降低（P＜0.05），β-結構（β-折疊和β-轉角）含量顯著增加（P＜0.05）。這可能是由于TG催化的?；磻茐牧耸功?螺旋結構規(guī)則排布的氫鍵的穩(wěn)定性，而展開的多肽鏈暴露出更多的氫鍵以及疏水基團重新排列，導致在分子聚集過程中重新連接形成β-結構[32]。由此可以推斷，TG處理后使RBPI分子二級結構變得更加有序，這也與TG催化蛋白質交聯(lián)形成聚集體有關[33]。此外，超聲5 min與TG聯(lián)合處理會使更多的無規(guī)卷曲結構轉變?yōu)棣?折疊結構，這表明超聲-TG聯(lián)合處理能夠促進蛋白質交聯(lián)，是修飾蛋白質二級結構的有效手段。RBPI功能性質的改善可能與蛋白質二級結構的這種變化有關。

圖5 超聲-轉谷氨酰胺酶處理的RBPI FTIR圖Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of RBPI treated by ultrasound and/or transglutaminase

表2 超聲-轉谷氨酰胺酶處理的RBPI二級結構含量Table 2 Secondary structure content of RBPI treated by ultrasound and/or transglutaminase

2.6 不同處理對RBPI熱特性的影響

熱誘導蛋白質結構的變化伴隨著熱特性的改變，可通過DSC儀測定蛋白質變性過程中熱量改變以及能量變化而分析蛋白質的熱特性[34]。由圖6可知，與未經(jīng)處理的RBPI相比，超聲處理5 min的RBPI反應吸收熱降低，而TG處理和超聲5 min聯(lián)合TG處理的RBPI反應吸收熱增加且向右偏移，說明蛋白質熱穩(wěn)定性發(fā)生改變。

圖6 超聲-轉谷氨酰胺酶處理的RBPI的DSC圖Fig. 6 Differential scanning calorimetry (DSC) thermograms of RBPI treated by ultrasound and/or transglutaminase

在DSC結果中，峰值溫度（Tp）即為蛋白質的變性溫度，代表蛋白質的熱穩(wěn)定性；熱焓變（ΔH）為蛋白質的有序結構，表征蛋白質分子的聚集程度[35]。由表3可知，與未經(jīng)處理的RBPI相比，超聲處理5 min的RBPI的Tp沒有顯著改變（P＞0.05），均在87 ℃左右，而To和Te略有降低。然而，超聲處理顯著降低了RBPI的ΔH（P＜0.05），這可能與蛋白質的折疊和聚集狀態(tài)有關[36]。Dissanayake等[37]研究表明熱焓變與有序的二級結構含量有關，有序結構的減少可能導致ΔH的降低，這可以由FTIR分析二級結構的結果中得到證實（表2）。TG處理組RBPI的Tp（91.41 ℃）顯著高于未經(jīng)處理RBPI的Tp（87.35 ℃）（P＜0.05），這表明TG催化蛋白質之間的交聯(lián)，有利于提高RBPI的熱穩(wěn)定性。TG的交聯(lián)作用使蛋白質形成高分子質量聚合物，促進分子間與分子內相互作用，導致結構變的更加的緊湊而有序，因此增強了蛋白質的熱穩(wěn)定性[38]。經(jīng)TG處理后RBPI的ΔH顯著增加（P＜0.05），這可能與TG促進無序的蛋白分子內、分子間疏水鍵的重新形成以及蛋白質交聯(lián)形成聚集體有關[36]。此外，超聲5 min與TG聯(lián)合處理進一步增加了Tp和ΔH，由于超聲引起的空化作用和微流束作用使蛋白質分子內部的基團暴露在分子表面[26]，為TG的交聯(lián)作用提供了更多的作用位點，利于蛋白質交聯(lián)形成致密的空間結構，從而改善熱穩(wěn)定性或三級結構穩(wěn)定性[39]。

表3 超聲-轉谷氨酰胺酶處理的RBPI的DSC熱力學參數(shù)Table 3 DSC thermodynamic parameters of RBPI treated by ultrasound and/or transglutaminase

3 結 論

超聲處理能夠使RBPI的乳化活性和發(fā)泡能力顯著增加，但會降低泡沫穩(wěn)定性。TG能夠使RBPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性提高，破壞樣品的發(fā)泡能力，卻形成了更穩(wěn)定的泡沫。超聲-TG聯(lián)合處理能夠進一步提高RBPI的乳化活性和泡沫穩(wěn)定性。超聲處理5 min聯(lián)合TG誘導的RBPI凝膠微觀結構更加均勻、致密，孔隙度更小，且凝膠硬度更大，脫水收縮作用更低，同時使蛋白質表面疏水性和游離巰基含量降低。FTIR和DSC分析表明，超聲-TG聯(lián)合處理能夠使RBPI更多的無規(guī)卷曲結構轉變?yōu)橛行虻摩?折疊結構，且峰值溫度和熱焓變顯著增加，有效改善蛋白質熱穩(wěn)定性，這表明RBPI經(jīng)過超聲處理后更利于TG催化蛋白質發(fā)生交聯(lián)反應，超聲-TG聯(lián)合處理能促進蛋白質功能性質的發(fā)揮。