丁 婕，王夢夢，汪立平，盧 瑛*

（上海海洋大學食品學院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）最初是從河豚中提取出來的。與許多其他微藻來源的海洋毒素不同，TTX的產(chǎn)生被認為是由假單胞菌屬、希瓦氏菌屬、交替單胞菌屬或弧菌屬細菌產(chǎn)生的[1-2]。在刺鲀、鸚哥魚、甲殼類、宏觀藻類以及陸生動物中均發(fā)現(xiàn)TTX的存在[3-4]。TTX是世界上最致命的生物毒素之一，0.5 mg TTX即可使人致死[5]。在生理pH值條件下，TTX可特異性與神經(jīng)細胞膜上的鈉通道結合，選擇性抑制Na+激活機制。誤食河豚者大約在20 min內(nèi)就會出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如麻痹癥、呼吸系統(tǒng)衰弱、心臟不規(guī)律跳動和痙攣，繼而導致死亡，且目前沒有有效的解救措施[6-8]。

近年來，乳酸菌被證實具有脫除生物毒素的功能。Mari等[9]發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌能夠脫除麻痹性貝類毒素。2016年，Zhu Yuanting等[10]研究發(fā)現(xiàn)6 種乳酸菌對雙酚A具有較好的去除能力，其中嗜酸乳桿菌與植物乳桿菌對雙酚A的去除能力更穩(wěn)定。Bovo等[11]發(fā)現(xiàn)7 種乳酸菌都能夠去除牛奶中的黃曲霉毒素，熱滅活處理的乳酸菌去除毒性效果更佳。Nybom等[12]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌主要依靠其細胞外定位的細胞包膜蛋白酶參與飲用水中藍藻素的去除，與乳酸菌的代謝產(chǎn)物無關。由此可見，乳酸菌能夠消減生活中的生物毒素。

我國的河豚養(yǎng)殖業(yè)始于1990年[7]，經(jīng)過20多年的發(fā)展，目前我國在河豚養(yǎng)殖方面取得了顯著的成績。由于河豚體內(nèi)含有毒素，如果烹飪前操作不當會引起食物中毒。河豚體內(nèi)的毒素主要存在于肝臟、卵巢魚皮中，導致即使其肝臟中含有豐富的二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）也只能被當作廢棄物處理。EPA和DHA分別被稱為“血管清潔劑”和“腦黃金”，具有促進大腦發(fā)育、預防心腦血管疾病等多種重要的生理活性[13-14]。我國成人對EPA與DHA的攝入量只為美國醫(yī)學報道建議值的1/4，主要原因是我國DHA與EPA的來源較少、價格昂貴[15]。衛(wèi)煜英等[16]報道，河豚肝臟中DHA和EPA分別占脂肪酸總量的33.31%和6.3%，為另外9 種淡水魚的3～4 倍。但是，由于肝臟是TTX含量最多的組織，所以難以作為DHA和EPA提取的原料。

為了消減河豚組織中的TTX，本實驗研究活化與熱滅活處理的鼠李糖乳桿菌對TTX的消減能力，分析野生河豚肝臟在鼠李糖乳桿菌發(fā)酵過程中EPA和DHA含量的變化趨勢，以期為今后河豚內(nèi)臟組織中TTX的消減以及EPA與DHA的開發(fā)與利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級昆明小鼠（生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0004），雄性，體質(zhì)量19～21 g，購自上海捷思捷實驗動物有限責任公司。

鼠李糖乳桿菌由上海海洋大學分子生物學實驗室保藏；磁性免疫層析試紙條 上海海洋大學水產(chǎn)品重點實驗室；TTX標準品（純度＞99%） 北京盈澤納新化工技術研究院；野生河豚肝臟 江蘇中洋集團股份有限公司；EPA甲酯、DHA甲酯標準品、十九烷酸甲酯內(nèi)標美國Sigma公司；其他試劑 國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水均為去離子水。

1.2 儀器與設備

Trace1310 ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo Fisher公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；高速冷凍離心機 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 鼠李糖乳桿菌的活化制備

將凍存于-80 ℃的鼠李糖乳酸桿菌接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，連續(xù)活化3 代后用于后續(xù)實驗。

1.3.2 鼠李糖乳桿菌消減TTX

取解凍后的野生河豚肝臟，剪碎置于研缽中研磨至無明顯塊狀顆粒。鼠李糖乳桿菌用滅菌的磷酸鹽緩沖液重懸，并將其密度控制在1.0×107CFU/mL。

發(fā)酵處理：稱取河豚肝臟，按質(zhì)量比1∶100加入活化的鼠李糖乳酸菌菌落，混合均勻，放入發(fā)酵罐中，置于25 ℃恒溫箱中，分別于第3、7天取樣檢測。參照方國鋒等[17]的方法對肝臟中TTX進行提取。

消減TTX標準品：重新懸浮后的鼠李糖乳桿菌分成兩組，第1組分別直接加入10 μg/mL TTX標準品溶液，第2組于98 ℃水浴鍋中加熱滅活后分別加入TTX標準品溶液。放置在37 ℃恒溫搖床中，設置時間1 h，轉(zhuǎn)速為180 r/min。

1.3.3 TTX的消減效果評價

1.3.3.1 免疫學分析法

磁性免疫層析試紙條能夠?qū)TX進行快速定性檢測。取120 μL樣品滴加于試紙條的樣品墊上，室溫放置10 min后觀察結果[18]。其原理為競爭模式，對于陰性樣品，T線區(qū)域有明顯的顏色反應，陽性反之。以磁性納米微球偶聯(lián)TTX單克隆抗體作為探針來捕捉TTX，以實現(xiàn)對TTX的快速檢測。

競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）根據(jù)Kamath等[19]的方法略有改動。完全抗原TTX-牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）用50 mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋至8 μg/mL，4 ℃包被過夜，PBST溶液洗滌。用質(zhì)量分數(shù)5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，洗滌。將經(jīng)活化與熱滅活處理的鼠李糖乳桿菌脫除TTX后的樣品與特異性單克隆抗體等體積混合，37 ℃孵育1.5 h后加入酶標板孵育1 h，洗滌。加入辣根過氧化物酶-羊抗小鼠單克隆抗體（用抗體稀釋液稀釋2 500 倍體積）37 ℃孵育1 h，洗滌。然后加入鄰苯二胺底物顯色液，室溫反應15 min，最后加入2 mol/L硫酸終止反應，并立即用酶標儀測定490 nm波長處的OD值。以50 mmol/L包被液作為陰性對照，以抗體稀釋液稀釋的特異性單克隆抗體作為陽性對照，每個樣品做4 個平行。樣品中TTX的抑制率與消減率分別按照式（1）、（2）計算。

1.3.3.2 小鼠生物法評價

根據(jù)GB 5009.206—2016《食品安全國家標準 水產(chǎn)品中河豚毒素的測定》中方法，對小鼠注射1.3.2節(jié)用鼠李糖乳桿菌脫除TTX后的樣品，觀察其致死時間。每只小鼠的注射量為1 mL，每個樣品分別注射6 只小鼠，除去因個體差異而未死亡的小鼠，以平均死亡時間作為該樣品的致死時間。每個樣品做3 次平行。

根據(jù)小鼠的死亡時間，參考GB 5009.206—2016，得出每克肝臟中的毒素含量。參考日本谷氏對河豚毒性強弱的分類標準[20]判定毒性。

1.3.4 河豚肝臟中EPA、DHA含量的測定

1.3.4.1 河豚肝臟中EPA與DHA的提取

取80 mg河豚肝臟加入到15 mL離心管中，加入100 μL十九烷酸甲酯內(nèi)標和2 mL 2%（體積分數(shù)，下同）氫氧化鈉-甲醇溶液，85 ℃水浴鍋中水浴30 min，加入3 mL 14%三氟化硼甲醇溶液，于85 ℃水浴鍋中水浴30 min。水浴完成后，待溫度降到室溫，在離心管中加入1 mL正己烷，振蕩萃取2 min，靜置1 h，等待分層。取上層清液100 μL，用正己烷定容到1 mL。用0.45 μm濾膜過濾。

1.3.4.2 EPA與DHA含量的氣相色譜-質(zhì)譜檢測

參考GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定河豚》中方法。肝臟中DHA與EPA含量檢測采用Trace1310 ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；不分流進樣，開閥時間1 min；進樣口溫度：290 ℃；載氣：氦氣，流速：1.2 mL/min；采取程序升溫方式：80 ℃保持1 min，以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃，繼續(xù)以5 ℃/min的速率升溫至250 ℃，最后以2 ℃/min的速率升到270 ℃，保持3 min。質(zhì)譜條件：離子源溫度：280 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；溶劑延遲時間：5.00 min；掃描范圍：30～400 u；電子轟擊電離源能量：70 eV。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗結果采用平均值±標準偏差表示，由SPSS 17.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 免疫層析分析

2.1.1 河豚肝臟組織中TTX的定性分析結果

圖1 試紙條定性檢測TTX消減效果Fig. 1 Qualitative detection of TTX reduction using test strip

為了能夠快速檢測鼠李糖乳桿菌是否具有消減TTX的能力，采用磁性試紙條進行測定，其可在10～15 min內(nèi)快速判斷出TTX是否得到消減。如圖1所示，鼠李糖乳桿菌對TTX具有明顯的脫除作用，且熱滅活處理的鼠李糖乳桿菌效果明顯優(yōu)于活化的鼠李糖乳桿菌。7～9號試紙條的T線較為清晰，而10～12號試紙條的T線模糊。因試紙條以TTX-BSA完全抗原為T線，因此根據(jù)免疫層析間接競爭原理可知，T線顏色越深表明樣品中的TTX越少。7～9號試紙條的T線顏色明顯深于10～12號試紙條，表明7～9號樣品中含有的TTX質(zhì)量濃度低于10～12號樣品。4～6號試紙條為鼠李糖乳桿菌發(fā)酵后的肝臟樣品，試紙條的T線很清晰，與3號試紙條（陰性樣品）很接近，說明鼠李糖乳桿菌對肝臟短期的發(fā)酵處理可以明顯去除TTX。

2.1.2 河豚肝臟組織中TTX的定量分析結果

表1 ELISA方法檢測鼠李糖乳桿菌對TTX的消減效果Table 1 TTX reduction of Lactobacillus rhamnosus detected by ELISA

如表1所示，采用活化后的鼠李糖乳桿菌處理TTX標準品1 h，其TTX消減率為70.05%，而熱滅活處理的鼠李糖乳桿菌在相同條件下TTX的消減率為82.16%，表明熱滅活處理后的鼠李糖乳桿菌對TTX的消減效果更佳。而經(jīng)鼠李糖乳桿菌發(fā)酵處理后的野生河豚肝臟提取液發(fā)酵7 d后TTX消減了93%左右。

2.2 小鼠生物法檢測TTX脫除效果

由于小鼠生物法具有直觀、快速、癥狀典型、易操作等特點，被國際上廣泛用于河豚體內(nèi)TTX的檢測。以TTX標準品質(zhì)量濃度為自變量，小鼠致死時間倒數(shù)為因變量作圖，得到TTX標準品質(zhì)量濃度與小鼠致死時間倒數(shù)的線性關系（圖2）。

圖2 TTX標準品質(zhì)量濃度-小鼠致死時間倒數(shù)關系曲線Fig. 2 Curve for TTX dosage against mean death time of Kunming mice

如表2所示，活化的與熱滅活處理的鼠李糖乳桿菌對TTX的脫除較明顯。對小鼠注射經(jīng)活化的鼠李糖乳桿菌處理過的TTX標準品，小鼠的致死時間推遲約6 min，而經(jīng)熱滅活處理的鼠李糖乳桿菌處理的TTX使小鼠出現(xiàn)虛弱現(xiàn)象，但30 min內(nèi)未死亡。根據(jù)TTX標準品質(zhì)量濃度-小鼠致死時間倒數(shù)關系曲線計算得出，經(jīng)活化的與熱滅活處理的鼠李糖乳桿菌脫除后的TTX標準品質(zhì)量濃度分別為0.70 μg/mL和0.16 μg/mL。對小鼠注射經(jīng)鼠李糖乳桿菌發(fā)酵7 d后的河豚肝臟提取液，小鼠未死亡，并與正常小鼠生理狀態(tài)相似，表明經(jīng)鼠李糖乳桿菌發(fā)酵7 d后河豚肝臟內(nèi)的TTX大部分能被除去。

Mari等[9]發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌對不同的海洋毒素消減效果不同，且消減效果與毒素自身所帶的電荷數(shù)成正比，鼠李糖乳桿菌對石房哈毒素（saxitoxin，STX）和neo-STX消減率大約在77.0%～97.2%之間。Rafaat等[21]分別用乳酸菌和雙歧桿菌兩種菌株消減牛奶中的黃曲霉毒素，僅加入乳酸菌發(fā)酵1 d后的牛奶黃曲霉毒素消減率為31.5%～87.8%，而加入雙歧桿菌的牛奶發(fā)酵1 d后消減率為27.8%～72.8%。經(jīng)活化與熱滅活處理的乳酸菌均能消減毒素，表明其通過結合作用與毒素結合，而不是新陳代謝作用，這與先前特定菌株通過結合去除一系列霉菌毒素和其他底物的報道[22-23]一致。

2.3 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵處理對河豚肝臟中EPA、DHA含量的影響

表3 發(fā)酵不同時間后河豚魚肝臟中EPA、DHA含量Table 3 EPA and DHA contents in the liver of puffer fish after different fermentation times

如表3所示，經(jīng)鼠李糖乳桿菌發(fā)酵3 d后，河豚肝臟提取液中的EPA與DHA含量分別下降了3.8%和14.4%，發(fā)酵7 d后分別下降了11.93%和22.50%，其下降率與發(fā)酵的時間成正比。經(jīng)鼠李糖乳桿菌發(fā)酵7 d后河豚肝臟提取液內(nèi)的毒素含量約為2.7 MU/g，根據(jù)日本谷氏對河豚毒性強弱的分類標準[20]，肝臟中毒素含量大于10 MU/g為弱毒水平，食用后會危害人類的身體健康。因此，經(jīng)過鼠李糖乳桿菌發(fā)酵7 d的野生河豚肝臟已經(jīng)達到無毒水平，而EPA和DHA含量依然為常見淡水魚EPA與DHA含量的兩倍左右[16]，表明鼠李糖乳桿菌發(fā)酵處理后河豚肝臟中的EPA、DHA仍有開發(fā)價值。

EPA、DHA主要存在于深海魚體內(nèi)，具有降低血脂水平和預防心血管疾病等特殊生理功效[24-25]。張風雷等[26]發(fā)現(xiàn)河豚肝臟中均含有EPA和DHA，其中以東方鲀屬中含量最為豐富，但是河豚體內(nèi)的毒素主要存在于肝臟和卵巢中，導致其內(nèi)臟被丟棄，造成了資源浪費。喬菊[27]、賈晉斌[28]等分別發(fā)現(xiàn)酒醅與酒曲可以降解TTX，但是降解效果不顯著；Ali等[29]利用雙氧水和光催化劑的協(xié)同作用對TTX標準品進行降解，效果較好，脫除率達到85%。但是這種方法不適用于對毒素消減后河豚肝臟的再利用。日本居民曾用米糠對河豚魚的卵巢進行腌漬，歷經(jīng)長達兩年的時間才可達到食用的水平[30]。本研究用鼠李糖乳桿菌對河豚魚肝臟進行發(fā)酵處理7 d后，毒素消減率為93.27%，發(fā)酵后的肝臟已經(jīng)無毒性。

3 結 論

通過研究活化與熱處理滅活的鼠李糖乳桿菌對野生河豚魚肝臟中TTX的消減作用，發(fā)現(xiàn)加熱滅活后的鼠李糖乳桿菌對TTX的消減率高于活化的鼠李糖乳桿菌；此外，經(jīng)活化的鼠李糖乳桿菌發(fā)酵處理7 d后的野生河豚肝臟消減到無毒水平，但是其EPA和DHA含量為常見淡水魚中EPA與DHA的兩倍左右。本研究結果可為今后河豚魚內(nèi)臟組織中TTX的毒性消減技術開發(fā)以及河豚肝臟組織內(nèi)EPA與DHA的開發(fā)與利用提供依據(jù)。