李秋瑩，張東棟，王司雯，鐘克利,2，徐永霞，李穎暢，孫 彤,*，勵(lì)建榮,*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.渤海大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，遼寧 錦州 121013）

隨著消費(fèi)者對(duì)食品包裝材料和添加劑安全性的要求越來越高，在食品保鮮過程中，應(yīng)用安全、無毒的天然化合物已成為趨勢(shì)。基于天然大分子物質(zhì)制備的可食性涂膜因其安全、高效、易降解等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于改善各類食品的貯藏，成為食品保鮮方法中的研究熱點(diǎn)[1]。殼聚糖作為具有良好生物相容性、抑菌性等優(yōu)良特性的天然多糖，常用于制備可食性涂膜[2]。普魯蘭多糖作為一種水溶性的微生物多糖，可食無毒、易降解、成膜性佳，也被廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜涂膜保鮮[3]。但是，單一殼聚糖涂膜存在透濕性大、膜機(jī)械性能差等不足[4]；單一普魯蘭多糖涂膜雖有良好的阻氣性，但柔軟性差，涂膜既脆又硬，且成本較高[3]。研究表明通過幾種多糖共混制備復(fù)合涂膜能有效彌補(bǔ)單一多糖涂膜存在的不足。吳佳[3]的研究發(fā)現(xiàn)，將普魯蘭多糖和殼聚糖共混制備的復(fù)合涂膜有效改善了普魯蘭多糖的機(jī)械性能及阻氧性，其拉伸強(qiáng)度比普魯蘭多糖膜提高了29.2%。

可食性涂膜可整合不同的活性物質(zhì)，如天然抗氧化劑和抗菌劑等，提高涂膜的功能特性[1]。王思?jí)舻萚5]研究殼聚糖涂膜、殼聚糖和茶多酚復(fù)合涂膜對(duì)葡萄的保鮮效果，發(fā)現(xiàn)復(fù)合涂膜保鮮效果顯著優(yōu)于殼聚糖涂膜。溶菌酶是一種天然抗菌蛋白，常用于食品防腐，其可攻擊細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖層N-乙?；禾前坊鶊F(tuán)之間的β-1,4-糖苷鍵，從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡，對(duì)革蘭氏陽性菌抑菌效果較好[6]。ε-聚賴氨酸鹽酸鹽是一種營(yíng)養(yǎng)型抑菌劑，其安全性高，對(duì)革蘭氏陰性菌抑制效果較好[7]。溶菌酶和ε-聚賴氨酸鹽酸鹽均為在我國(guó)被批準(zhǔn)使用的食品添加劑。目前，在涂膜中整合這兩種天然抑菌劑而提高復(fù)合涂膜理化性能和抑菌性能的研究較少。

本研究制備殼聚糖和普魯蘭多糖復(fù)合涂膜，并添加溶菌酶和ε-聚賴氨酸鹽酸鹽兩種天然抗菌劑，以改善復(fù)合涂膜的理化特性和抑菌特性。比較分析不同添加量的溶菌酶和ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)涂膜性能的影響，確定溶菌酶和ε-聚賴氨酸鹽酸鹽最佳添加量。分析復(fù)合涂膜的透光性（透光度）、透水性（水蒸氣透過率）、透氣性（氧氣透過率、二氧化碳透過率）及力學(xué)性能（拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率）等指標(biāo)。以水產(chǎn)優(yōu)勢(shì)腐敗菌熒光假單胞菌為對(duì)象，結(jié)合細(xì)菌微觀形態(tài)研究復(fù)合涂膜的抑菌作用及機(jī)理，為其進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熒光假單胞菌為實(shí)驗(yàn)室分離的菌株，于-80 ℃保藏。殼聚糖（脫乙酰度大于95%）、普魯蘭多糖上海阿拉丁生化科技股份有限公司；溶菌酶 美國(guó)Sigma Aldrich公司；ε-聚賴氨酸鹽酸鹽 浙江新銀象生物工程有限公司；LB營(yíng)養(yǎng)肉湯、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）相關(guān)試劑 北京索萊寶科技有限公司；冰乙酸、丙三醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3030CH立式高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱 上海恒科技有限公司；THZ-D臺(tái)式恒溫振蕩箱 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；ZD-9556脫色搖床 常州市凱航儀器有限公司；CS 150 GX3超速離心機(jī)、S-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司；Victor X3酶標(biāo)儀 新加坡珀金埃爾默儀器有限公司；GS-800拍照系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；FA2104C電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；SCIENTA-IID超聲波細(xì)胞粉碎器寧波新芝生物科技股份有限公司；TA.XT Plus型質(zhì)構(gòu)儀英國(guó)Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 涂膜的制備

將一定量的殼聚糖溶解于體積分?jǐn)?shù)1%冰醋酸，使其終質(zhì)量濃度達(dá)到15 g/L，55 ℃下置于磁力攪拌器中，待殼聚糖充分溶解后，向溶液中加入普魯蘭多糖，使其終質(zhì)量濃度為20 g/L，充分溶解，得到殼聚糖-普魯蘭多糖（CS-PUL）涂膜溶液。在CS-PUL溶液中添加0.6 mg/mL ε-聚賴氨酸鹽酸鹽和不同量溶菌酶（約70 000 U/mg）（0、1、3、5、7、9 mg/mL），以及在CS-PUL溶液中添加3 mg/mL溶菌酶和不同量ε-聚賴氨酸鹽酸鹽（0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 mg/mL），得到不同的含抑菌劑的CS-PUL復(fù)合涂膜液（CS-PUL-A）。在涂膜液中添加體積分?jǐn)?shù)0.3%甘油以提高成膜性。攪拌均勻后將上述溶液于224 W超聲脫氣15 min，靜置備用。

分別取40 mL涂膜液在20 cm×20 cm亞克力板上流延成膜，放置于30 ℃鼓風(fēng)干燥箱干燥12 h，揭膜得到CS-PUL膜和一系列CS-PUL-A膜。

1.3.2 涂膜理化性能測(cè)定

1.3.2.1 水蒸氣透過率

參考郝晗[8]的方法，測(cè)定涂膜的水蒸氣透過率。

1.3.2.2 力學(xué)性能的測(cè)定

參考郝晗[8]的方法，選用TA.XT Plus型質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行涂膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率的測(cè)定。

1.3.2.3 透光性的測(cè)定

參考郝晗[8]的方法，將涂膜均修剪為比色皿大小，貼于比色皿器壁上，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定涂膜的透光率，并記錄數(shù)據(jù)。透光性為透光率和膜厚度的乘積。

1.3.2.4 透氣性測(cè)定

參考郝晗[8]的方法，進(jìn)行涂膜氧氣透過率和二氧化碳透過率的測(cè)定。

1.3.3 涂膜抑菌性能研究

1.3.3.1 涂膜抑菌活性測(cè)定

參考Son[9]和Huang Weijuan[10]等的方法，采用搖瓶法測(cè)定復(fù)合膜對(duì)熒光假單胞菌的抑制活性。將膜隨機(jī)切割成直徑為6 mm的圓片，并在紫外線照射下滅菌30 min。將已培養(yǎng)的熒光假單胞菌的菌懸液經(jīng)LB肉湯培養(yǎng)基稀釋至約106～107CFU/mL。隨后，隨機(jī)選取一圓片浸入2 mL菌懸液中，然后置于28 ℃振蕩培養(yǎng)（161 r/min）。另外，未加膜片的空白組2 mL菌懸液在相同的條件下培養(yǎng)。在培養(yǎng)至0、12、24、36 h和48 h分別取樣進(jìn)行活菌菌落計(jì)數(shù)。菌落計(jì)數(shù)通過平板計(jì)數(shù)法[11]測(cè)定。

1.3.3.2 細(xì)胞膜完整性測(cè)定

取一定量已培養(yǎng)的熒光假單胞菌的菌懸液，3 000 r/min離心10 min，棄上清液。用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）清洗菌體2 次，再用PBS稀釋，使菌懸液OD260nm為0.5。向10 mL稀釋后的菌懸液中加入5 片切割好的1.3.3.1節(jié)膜圓片，置于28 ℃振蕩培養(yǎng)（161 r/min）。未加膜的空白組菌懸液在相同條件下培養(yǎng)。每30 min取一定量的菌懸液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定濾液在260 nm波長(zhǎng)處OD值，至出現(xiàn)平衡值為止。

1.3.3.3 菌懸液電導(dǎo)率測(cè)定

樣品的處理同1.3.3.2節(jié)。各組樣品相同條件下培養(yǎng)后，每間隔10 min采用電導(dǎo)率儀測(cè)定電導(dǎo)率，直至達(dá)到平衡值。

1.3.3.4 細(xì)菌AKP活力測(cè)定

樣品的處理同1.3.3.1節(jié)。在28 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后，于3 000 r/min下離心10 min，用無菌生理鹽水沖洗菌體兩次，后用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液濃度為106～107CFU/mL。然后將菌懸液置于超聲粉碎器中在200 W條件下進(jìn)行超聲處理，每次5 s，處理2 min，備用。用考馬斯亮藍(lán)顯色試劑盒測(cè)定菌懸液的蛋白質(zhì)量濃度。AKP活力測(cè)定按AKP測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3.5 SDS-PAGE分析

細(xì)菌蛋白質(zhì)的SDS-PAGE按照Li Yingqiu等[12]的方法進(jìn)行，并稍作修改。樣品的處理同1.3.3.1節(jié)。在28 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h后，在4 ℃下5 000 r/min離心10 min，用0.1 mol/L PBS（pH 7.4）清洗菌體2 次，收集菌體重懸于PBS（pH 7.4）中，將細(xì)菌懸液與樣品稀釋緩沖液按體積比1∶1混合，沸水煮5～10 min，冷卻至室溫，離心數(shù)秒后，混勻，再離心30 s，取上清液上樣，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%濃縮膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE。凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色5 h，脫色2 h。采用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.3.3.6 細(xì)菌微觀形態(tài)觀察

參考Kockro[13]和Bajpai[14]等的方法進(jìn)行SEM觀察。樣品的處理同1.3.3.2節(jié)，28 ℃振蕩培養(yǎng)殺菌12 h。3 000 r/min離心10 min，去上清液，加入無菌水離心清洗2 次。取10 mL戊二醛（體積分?jǐn)?shù)2.5%），與菌體混勻，固定處理2 h。用無菌水離心清洗2 次后，然后使細(xì)胞在梯度乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)分別為50%、70%、80%、90%、100%）中脫水。取適量菌懸液于蓋玻片，37 ℃干燥72 h。將菌體噴金處理，采用S-4800型場(chǎng)發(fā)射SEM對(duì)菌體微觀形貌進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均為重復(fù)3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所得數(shù)值的平均值。用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并應(yīng)用Duncan’s多范圍測(cè)試。使用Origin 8.5軟件作圖，并使用回歸分析確定5%置信區(qū)間的顯著差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶菌酶和ε-聚賴氨酸鹽酸鹽添加量對(duì)復(fù)合涂膜理化性能的影響

涂膜中添加一定量的抑菌劑能有效提高抑菌性能，但也會(huì)影響涂膜的理化性能。由表1可知，隨著溶菌酶添加量的增多，復(fù)合涂膜的透光性、透氣性及斷裂伸長(zhǎng)率均降低，拉伸強(qiáng)度增加。溶菌酶結(jié)構(gòu)中的胺基[15]可能與殼聚糖、普魯蘭多糖分子中的羥基分子間存在氫鍵相互作用形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使膜內(nèi)分子結(jié)合更加緊密，增強(qiáng)復(fù)合涂膜機(jī)械性能和阻氣性能；透光性是兩種物質(zhì)相容性優(yōu)劣的體現(xiàn)[16]，可能隨著溶菌酶含量的增加，溶菌酶分子不能充分地與多糖基質(zhì)之間形成分子間作用力，分子相容性變差，造成復(fù)合涂膜透光性降低。阻隔性（阻氣性和阻水性）是指能夠延緩食品與外界環(huán)境的氣體交換和水分轉(zhuǎn)移的能力，涂膜擁有較強(qiáng)的阻隔性，可以有效防止食品氧化及腐敗變質(zhì)[17]。溶菌酶添加量為3 mg/mL時(shí)涂膜透水性最小，同時(shí)具有相對(duì)較低的氧氣和二氧化碳透過性，說明添加3 mg/mL溶菌酶可有效提高復(fù)合涂膜的阻隔性。拉伸強(qiáng)度是反映膜強(qiáng)度的指標(biāo)，斷裂伸長(zhǎng)率是反映膜韌性的指標(biāo)[18]。溶菌酶添加量為0～3 mg/mL時(shí)，隨著添加量的增加，涂膜拉伸強(qiáng)度呈顯著上升趨勢(shì)；而斷裂伸長(zhǎng)率呈下降趨勢(shì)，且各溶菌酶添加量差異不顯著。添加量增加到3～9 mg/mL時(shí)，溶菌酶的增加對(duì)涂膜拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率的影響無明顯差異。因此，當(dāng)溶菌酶添加量為3 mg/mL時(shí)，涂膜有較好的機(jī)械性能。

表1 溶菌酶添加量對(duì)復(fù)合涂膜理化性能的影響Table 1 Effect of lysozyme addition on physicochemical properties of composite coatings

表2 ε-聚賴氨酸鹽酸鹽添加量對(duì)復(fù)合涂膜理化性能的影響Table 2 Effect of ε-polylysine hydrochloride addition on physicochemical properties of composite coatings

由表2可知，隨著ε-聚賴氨酸鹽酸鹽添加量的增加，以添加量1.2 mg/mL為轉(zhuǎn)折點(diǎn)，復(fù)合涂膜的透水性、透氣性、透光性和拉伸強(qiáng)度均為先上升后下降的趨勢(shì)，而斷裂伸長(zhǎng)率呈相反趨勢(shì)。ε-聚賴氨酸鹽酸鹽添加量為1.2 mg/mL時(shí)，復(fù)合涂膜拉伸強(qiáng)度最大，但其具有最大透氣性、透水性和透光性，涂膜性能較差。添加量達(dá)到1.8 mg/mL時(shí)，涂膜透水性最低，透氣性較低，阻隔性較好，且具有相對(duì)較高的拉伸強(qiáng)度，各項(xiàng)性能都比較優(yōu)良。因此，綜合分析各項(xiàng)性能指標(biāo)，在復(fù)合涂膜中溶菌酶、ε-聚賴氨酸鹽酸鹽的添加量分別以3 mg/mL和1.8 mg/mL為宜。

2.2 復(fù)合涂膜理化性能比較

表3比較了CS-PUL涂膜與CS-PUL-A涂膜（溶菌酶添加量3 mg/mL、ε-聚賴氨酸鹽酸鹽添加量1.8 mg/mL）的理化性能。CS-PUL涂膜與添加了抑菌劑的CS-PUL-A涂膜拉伸強(qiáng)度無顯著性差異，而CS-PUL-A涂膜斷裂伸長(zhǎng)率幾乎為CS-PUL涂膜的2 倍，表明添加抑菌劑增加了復(fù)合涂膜的韌性?？赡苁且?yàn)槿芫负挺?聚賴氨酸鹽酸鹽溶液中的胺基與多糖分子之間存在相互作用形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使膜內(nèi)分子結(jié)合更加緊密。CS-PUL-A涂膜氧氣透過率顯著低于CS-PUL涂膜（P＜0.05），而二氧化碳透過率差異不顯著，表明添加抑菌劑后涂膜的阻氣性能有所提高，這可能是因?yàn)榉肿又g的相互作用使得復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)比較緊密，從而降低了氧氣的透過率。水蒸氣透過率是反映透濕性能的指標(biāo)，水蒸氣透過率越小則阻水性越強(qiáng)[18]。CS-PUL-A涂膜的水蒸氣透過率顯著低于CS-PUL涂膜，擁有更強(qiáng)的阻水能力。兩種涂膜的透光率無顯著性差異。綜合各指標(biāo)來看，加入3 mg/mL溶菌酶和1.8 mg/mL ε-聚賴氨酸鹽酸鹽能有效地改善殼聚糖和普魯蘭多糖復(fù)合涂膜的理化性能。Li Xiang等[19]通過將溶菌酶-累托石加入殼聚糖膜中，分析溶菌酶對(duì)殼聚糖涂膜的理化性能的影響，結(jié)果表明溶菌酶的加入可有效改善殼聚糖涂膜的理化性能。湯秋冶等[20]將ε-聚賴氨酸加入海藻酸鈉涂膜中，發(fā)現(xiàn)復(fù)合膜分子之間形成了強(qiáng)烈的相互作用，其力學(xué)性能得到明顯改善。

表3 復(fù)合涂膜的理化性能Table 3 Physicochemical properties of composite coatings

2.3 復(fù)合涂膜抑菌性能分析結(jié)果

2.3.1 復(fù)合涂膜對(duì)熒光假單胞菌的抑制作用

為研究復(fù)合涂膜對(duì)熒光假單胞菌的抑制作用，比較了空白組、CS-PUL和CS-PUL-A處理組熒光假單胞菌隨時(shí)間變化生長(zhǎng)情況。由圖1可以看出，整個(gè)培養(yǎng)期，空白組和CS-PUL處理組的熒光假單胞菌數(shù)呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)，但CS-PUL處理組細(xì)菌數(shù)量增長(zhǎng)更緩慢并且顯著低于空白組?？赡苁菤ぞ厶堑恼姾膳c細(xì)胞表面大分子帶負(fù)電荷的殘基反應(yīng)，改變了細(xì)胞膜的滲透性，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡所致[21]。CS-PUL-A處理組細(xì)菌數(shù)量呈先降低后增長(zhǎng)的趨勢(shì)。在12 h，僅有CS-PUL-A處理組比0 h初始細(xì)菌數(shù)量低，表明在此階段CS-PUL-A涂膜的處理導(dǎo)致熒光假單胞菌死亡。在12 h之后，雖然CS-PUL-A處理組細(xì)菌數(shù)量逐漸增加，但一直顯著低于空白組和CS-PUL處理組，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制熒光假單胞菌生長(zhǎng)的能力。研究結(jié)果表明ε-聚賴氨酸鹽酸鹽和溶菌酶的加入顯著增強(qiáng)了涂膜抑菌性能。ε-聚賴氨酸鹽酸鹽是陽離子表面活性物質(zhì)，分子中的氨基在溶液中帶正電[20]，ε-聚賴氨酸鹽酸鹽的加入可能與殼聚糖產(chǎn)生協(xié)同抑菌作用，增加了涂膜的抑菌性。Park等[22]的研究表明在殼聚糖膜基質(zhì)中加入溶菌酶可以提高殼聚糖的抑菌活性。當(dāng)細(xì)菌的外膜被殼聚糖破壞時(shí)，溶菌酶可有效對(duì)抗革蘭氏陰性細(xì)菌。

圖1 復(fù)合涂膜處理對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effect of composite coatings on growth of Pseudomonas fluorescens

2.3.2 涂膜處理對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞膜完整性的影響

圖2 復(fù)合涂膜處理的熒光假單胞菌的核酸釋放Fig. 2 Release of nucleic acids from Pseudomonas fluorescens treated with composite coatings

細(xì)胞膜的完整性是細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的關(guān)鍵因素之一，若細(xì)胞膜完整性被破壞，胞內(nèi)核酸等大分子物質(zhì)會(huì)發(fā)生流失。檢測(cè)菌懸液在260 nm的OD值變化可反映從細(xì)胞質(zhì)中釋放出來的核苷酸量，進(jìn)而評(píng)價(jià)細(xì)胞膜的完整性[23-24]。圖2顯示了不同處理組菌懸液在260 nm波長(zhǎng)處的OD值隨時(shí)間的變化情況。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組的OD260nm逐漸增加。其中，涂膜處理組OD260nm明顯大于空白組，表明涂膜處理使熒光假單胞菌的核酸泄漏到胞外環(huán)境中，推測(cè)涂膜處理可能破壞了熒光假單胞菌細(xì)胞膜的完整性。并且，CS-PUL-A處理組的OD260nm一直大于CS-PUL處理組，表明添加抑菌劑增加了涂膜對(duì)細(xì)胞膜完整性的破壞。這與藍(lán)蔚青等[25]的研究結(jié)果比較一致，其基于殼聚糖、溶菌酶和茶多酚制備復(fù)合保鮮劑，觀察到復(fù)合保鮮劑處理組OD260nm明顯大于空白組。

2.3.3 涂膜處理對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞膜通透性的影響

細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜是K+、Ca2+、Na+等小分子離子的滲透屏障，這是由膜的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成來維持和控制的[26]。維持離子穩(wěn)態(tài)對(duì)于維持細(xì)胞的能量狀態(tài)非常重要，因此，即使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)有相對(duì)較小的變化也會(huì)影響細(xì)胞代謝并導(dǎo)致細(xì)菌死亡[27]。通過測(cè)定熒光假單胞菌的電導(dǎo)率可分析涂膜處理對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響。圖3顯示了不同處理組熒光假單胞菌電導(dǎo)率隨其培養(yǎng)時(shí)間的變化情況。在0～90 min期間，CS-PUL-A、CS-PUL處理組熒光假單胞菌菌懸液電導(dǎo)率從21.5 mS/cm分別迅速增至24.0、23.7 mS/cm，而空白組電導(dǎo)率增加較少，維持在22.4～22.7 mS/cm，90 min后，各組樣品導(dǎo)電率趨于穩(wěn)定。涂膜組電導(dǎo)率增加意味著涂膜處理影響了細(xì)菌細(xì)胞膜滲透屏障作用，使細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)泄漏，而過多電解質(zhì)的流失最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。溶菌酶、ε-聚賴氨酸鹽酸鹽添加至涂膜后電導(dǎo)率增加更為顯著，表明抑菌物質(zhì)的添加加速了胞內(nèi)電解質(zhì)的流失[26]，而這可能是由于抑菌劑增強(qiáng)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)外膜的破壞造成的。

圖3 復(fù)合涂膜處理的熒光假單胞菌懸液的電導(dǎo)率Fig. 3 Electric conductivity of Pseudomonas fluorescens suspension treated with composite coatings

2.3.4 涂膜處理對(duì)熒光假單胞菌AKP活性的影響

圖4 復(fù)合涂膜處理的熒光假單胞菌的AKP活力Fig. 4 Alkaline phosphatase activity of Pseudomonas fluorescens suspension treated with composite coatings

AKP通過對(duì)底物的去磷酸化作用廣泛參與細(xì)胞的代謝，是細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的關(guān)鍵因素之一[28-29]。圖4比較了不同處理組熒光假單胞菌培養(yǎng)12 h后AKP活力，涂膜處理12 h時(shí)，熒光假單胞菌的AKP活力顯著低于空白組，表明涂膜處理可能抑制了AKP的活性。而添加抑菌劑的CS-PUL-A組AKP活力最低，表明抑菌劑增加了涂膜對(duì)AKP的活性抑制作用。可能是因?yàn)槿芫负挺?聚賴氨酸鹽酸鹽增大對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破壞后，影響了位于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上的AKP活性。這與儀淑敏[30]的研究結(jié)果比較一致，其發(fā)現(xiàn)茶多酚可以使銅綠假單胞菌細(xì)胞膜通透性增加、AKP活性降低。

2.3.5 涂膜處理對(duì)熒光假單胞菌蛋白表達(dá)模式的影響

圖5為涂膜處理組和空白組的熒光假單胞菌培養(yǎng)24 h后的蛋白質(zhì)SDS-PAGE譜圖，泳道1～4分別為蛋白Marker、空白組、CS-PUL組、CS-PUL-A組。涂膜處理組，特別是CS-PUL-A組與空白組的蛋白譜圖存在明顯差異?？瞻捉M蛋白條帶更加清晰，泳道中有15 條條帶，其中9 條較清晰（R1、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R15）。CS-PUL處理組在31.0～15.0 kDa處條帶消失。CS-PUL-A處理組的條帶中僅有R1、R3、R7（分別約為99.0、70.0、42.0 kDa）3 條較清晰的條帶。研究結(jié)果表明涂膜對(duì)熒光假單胞菌蛋白質(zhì)有顯著的影響，特別是分子質(zhì)量小于42.0 kDa的蛋白質(zhì)，而抑菌劑添加后也影響了大分子質(zhì)量蛋白。在Ye Ruosong等[31]的研究中發(fā)現(xiàn)，ε-聚賴氨酸可與DNA結(jié)合，進(jìn)而會(huì)影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。類似的，Li Yingqiu等[12]發(fā)現(xiàn)經(jīng)ε-聚賴氨酸處理的金黃色葡萄球菌蛋白譜圖在約10.5、14.4 kDa處條帶消失。蛋白質(zhì)條帶消失的原因可能是細(xì)菌蛋白質(zhì)受到破壞或其合成受到干擾。

圖5 復(fù)合涂膜處理的熒光假單胞菌蛋白SDS-PAGE圖譜Fig. 5 SDS-PAGE of proteins from Pseudomonas fluorescens treated with composite coatings

2.3.6 涂膜處理對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞微觀形貌的影響

如圖6所示，未經(jīng)處理的熒光假單胞菌細(xì)胞顯示典型的桿狀形態(tài)，菌體飽滿、完整，形狀規(guī)則，鞭毛清晰可見；CS-PUL處理后，細(xì)菌細(xì)胞表現(xiàn)出不規(guī)則的變形、皺縮，菌體表面變得粗糙，部分細(xì)胞破裂；CS-PUL-A涂膜處理的細(xì)菌顯示出更嚴(yán)重的變形及細(xì)胞破裂，這可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏，造成菌體死亡。抑菌劑的添加能明顯增強(qiáng)復(fù)合涂膜對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞的破壞。通過SEM觀察所得結(jié)果與上述復(fù)合涂膜對(duì)熒光假單胞菌的抑制作用及對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜完整性影響的結(jié)果一致。藍(lán)蔚青等[21]用復(fù)合生物保鮮劑處理熒光假單胞菌，得到與本研究類似的結(jié)果。

圖6 復(fù)合涂膜處理的熒光假單胞菌細(xì)胞微觀形貌的變化Fig. 6 Changes in micromorphology of Pseudomonas fluorescens treated with composite coatings

3 結(jié) 論

溶菌酶與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽的添加影響了殼聚糖-普魯蘭多糖復(fù)合涂膜的理化性質(zhì)。根據(jù)各項(xiàng)性能指標(biāo)綜合分析，復(fù)合涂膜中溶菌酶、ε-聚賴氨酸鹽酸鹽的添加量分別為3 mg/mL和1.8 mg/mL時(shí)得到的復(fù)合涂膜較未添加抑菌劑的涂膜具有更優(yōu)的理化性能，以及更強(qiáng)的抑菌性能。溶菌酶與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽的添加提高了殼聚糖-普魯蘭多糖涂膜對(duì)熒光假單胞菌的抑制，并且通過增強(qiáng)對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞膜完整性的破壞，使細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)核酸、離子等成分泄漏，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)合成的破壞或抑制作用，最終抑制熒光假單胞菌的生長(zhǎng)。