孫海偉，史馨瑾，陳艷艷，鐘秋萍，張萌，呂璐，王俊，陳鴻軍

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

A型流感病毒(influenza A virus，IAV)屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)甲型流感病毒屬，由8條負(fù)鏈RNA片段組成和編碼流感病毒蛋白，具有囊膜，除少數(shù)流感病毒呈絲狀，一般呈球形，直徑約為80～120 nm。IAV根據(jù)血凝素(hemagglutinin, HA)與神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA)的抗原性，可以將其分為不同亞型。迄今，HA共有18種(H1 ～ H18)，NA共有11種(N1 ～ N11)[1]。

流感病毒感染的宿主廣泛，包括人、禽、豬等[2-5]。其中，H9N2因其高度接觸傳染性及分布廣泛性，且為H5N1、H7N9及H10N8等提供了部分內(nèi)部基因，造成了其他流感病毒的基因重排，進(jìn)而產(chǎn)生新的病毒亞型或基因型[2,6-8]，所以H9N2危害十分嚴(yán)重[9-13]。H1N1病毒能引起家禽發(fā)生嚴(yán)重的疾病并可能導(dǎo)致疫情或人類(lèi)流感大面積傳播[14-15]，如1918年的“西班牙大流行”的流感病毒(H1N1)就造成了近5000萬(wàn)人的死亡[16]，2009年的H1N1大流行造成了近1.7萬(wàn)人的死亡[17-18]。因此，本文將本實(shí)驗(yàn)保存的A/swine/Jiangsu/C1/08 (H9N2) (H9C1)、A/swine/Shandong/731/2009 (H1N1) (SD731)和A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (PR8)毒株作為模式病毒進(jìn)行致病機(jī)制研究。

高致病性流感病毒致使動(dòng)物或者人死亡的一個(gè)重要原因是其引起細(xì)胞因子風(fēng)暴以及肺損傷[19-20]。此外，研究指出流感病毒感染宿主后，IL-6和TNF-α等炎癥因子招募巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞到病毒感染的肺部，引起肺部發(fā)生急性炎癥反應(yīng)，從而造成肺部急性損傷，增強(qiáng)疾病程度，甚至引起宿主死亡[21-23]。然而，流感病毒致炎的具體的分子機(jī)制至今尚不清楚，建立合適的流感病毒感染動(dòng)物模型成為闡明其致病機(jī)制并開(kāi)發(fā)出有效疫苗和藥物的重要工作。本文將對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行H9N2及H1N1致病性實(shí)驗(yàn)，建立BALB/c小鼠炎癥動(dòng)物模型以分析流感病毒的致病性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠44只，體重15 ～ 20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)【SCXK(滬)2016-0002】。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在上海獸醫(yī)研究所進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)許可號(hào)【SYXK(滬)2016-0010】，并通過(guò)了研究所實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的審查，批準(zhǔn)號(hào)：SHVRI-SZ-20131102-02。

1.1.2 毒株

A/swine/Jiangsu/C1/08 (H9N2) (H9C1)、A/swine/Shandong/731/2009 (H1N1) (SD731)和A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (PR8)流感毒株由本實(shí)驗(yàn)室保存，三株流感毒株均在9 ～ 11日齡SPF雞胚上繁殖擴(kuò)增，將擴(kuò)增的病毒分裝至1.5 mL離心管中，每管500 μL，凍存于-80℃。

1.1.3 儀器和試劑

多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Mouse IL-6 及TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自BD Ebiosicience公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

小鼠按照體重隨機(jī)分成PBS對(duì)照組、H9C1、SD731和PR8流感病毒感染組，共4組，每組11只。

1.2.2 攻毒

小鼠用干冰進(jìn)行麻醉，將1×106TCID50/50 μL的流感病毒液用移液器滴入小鼠鼻腔；對(duì)照組小鼠滴入50 μL PBS。接毒后的小鼠正常飼養(yǎng)，供給飼料為標(biāo)準(zhǔn)日糧，飲高壓滅菌水，足量供給[24]。攻毒開(kāi)始前標(biāo)記為0 d，攻毒后每天觀察記錄1次，連續(xù)觀察14 d，小鼠體重低于接毒前初始體重的25%即判定為死亡，并給予安樂(lè)死處理。在攻毒后的第1、3天，每組3只經(jīng)CO2麻醉靜脈放血處以安樂(lè)死，采集小鼠肺組織用于檢測(cè)肺組織的病毒載量和IL-6、TNF-α的水平。

1.2.3 小鼠肺組織病毒載量測(cè)定

小鼠肺組織病毒載量用TCID50進(jìn)行標(biāo)定，步驟如下：首先稱量小鼠肺的重量并記錄，加入1 mL體積的含1000單位雙抗的PBS緩沖液，進(jìn)行無(wú)菌研磨。將組織勻漿液5000 r/min離心15 min，收獲上清。取100 μL上清液用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基連續(xù)10倍倍比稀釋?zhuān)瑢⑵浣臃N到MDCK細(xì)胞板上進(jìn)行TCID50的測(cè)定，以確定流感病毒在肺中的病毒含量。

1.2.4 ELISA kit檢測(cè)小鼠肺組織的IL-6、TNF-α水平：

(1)將Capture抗體用100 μL coating buffer稀釋后加入到96孔板中，并4°C進(jìn)行過(guò)夜包被；

(2)棄掉96孔板中的coating buffer，并用250 μL的PBST洗滌3次；

(3)每個(gè)孔中加入200 μL 1× ELISA稀釋液室溫封閉1 h；

(4)用1×ELISA稀釋液倍比稀釋細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品及待檢樣品，稀釋之后每孔加入100 μL，4°C孵育過(guò)夜或常溫孵育2 h；

(5)250 μL PBST洗滌3 ～ 5次，每孔加入100 μL 1× ELISA稀釋液的細(xì)胞因子檢測(cè)抗體，室溫孵育1 h；

(6)250 μL PBST洗滌3 ～ 5次，每孔加入100 μL 1× ELISA稀釋液稀釋的Avidin-HRP抗體，室溫孵育30 min；

(7)250 μL PBST洗滌5 ～ 7次，每孔加入100 μL 1× TMB溶液，室溫孵育15 min，孵育后加入50 μL 2 M硫酸溶液終止反應(yīng)；

(8)多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下的OD值；

(9)根據(jù)測(cè)出的OD繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算目的樣品的細(xì)胞因子含量。

1.2.5 HI實(shí)驗(yàn)

(1)96孔血凝板中加入生理鹽水，再加入25 μL收集的血清，進(jìn)行連續(xù)2倍倍比稀釋?zhuān)?/p>

(2)每孔中加入25 μL/4個(gè)凝集單位的H9N2各抗原；

(3)混勻，室溫孵育30 min，觀察血凝結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用GraphPad 7.0軟件(GraphPad軟件公司，San Diego，CA，美國(guó))。兩兩比較使用t檢驗(yàn)。多重比較分析采用雙向方差分析(Two-ways ANOVA)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A型流感病毒感染BALB/c小鼠的癥狀和體征

為了研究三株A型流感毒株對(duì)BALB/c小鼠的致病性差異，本研究選用1×106TCID50的接毒劑量感染5周齡BALB/c小鼠，連續(xù)觀察14 d，每天記錄體重變化及死亡情況，體重變化曲線及死亡曲線分別見(jiàn)圖1A、圖1B。結(jié)果顯示：BALB/c小鼠在接種SD731和PR8病毒的第2天體重開(kāi)始明顯減輕，至第3天開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀，主要表現(xiàn)為精神不振，弓背，蜷縮，豎毛，顫抖、反應(yīng)差、活動(dòng)少、扎堆。PR8攻毒組小鼠在攻毒第4天出現(xiàn)死亡，小鼠體重持續(xù)下降，至第6天全部死亡。SD731攻毒組在第5天和第7天各死亡1只，第9天死亡2只，至14 d，死亡4只，死亡率達(dá)到80%。H9C1攻毒組小鼠體重在第2天開(kāi)始下降，至第4天降至最低為93%，此后小鼠體重逐漸恢復(fù)，H9C1感染期間小鼠臨床癥狀不明顯，無(wú)小鼠死亡。

注：A. 小鼠滴鼻感染流感病毒后體重變化；B. 小鼠滴鼻感染H9N2病毒后存活率。圖1 小鼠體重變化曲線及死亡曲線Note. A. Body weight changes of the mice inoculated with influenza A virus. B. Survival rate of the mice inoculated with H9N2 virus.Figure 1 Body weight changes and survival rate of the mice after virus inoculation

2.2 肺的病毒載量及抗體滴度

為了分析這三株A型流感毒株在BALB/c小鼠的致病性的不同，本研究在BALB/c感染IAV后的第1、3天，隨機(jī)處死3只小鼠，解剖收集肺組織研磨后檢測(cè)其病毒。結(jié)果顯示：H9C1、SD731和PR8三株A型流感病毒在小鼠肺內(nèi)均能良好的復(fù)制，感染后的第1、3天后小鼠肺的病毒載量均超過(guò)9×103TCID50/mL，其中PR8的復(fù)制能力最好，第1天肺病毒載量是105.3TCID50/mL，第3天為106.3TCID50/mL；其次是SD731，第1天肺病毒載量是104.4TCID50/mL，第3天為105.4TCID50/mL；H9C1病毒感染的第1天肺病毒載量是103.9TCID50/mL，第3天為105.5TCID50/mL(圖2A)。感染14 d后，將剩余的BALB/c小鼠經(jīng)安樂(lè)致死，采集并分離血清，測(cè)定HI效價(jià)。結(jié)果顯示：H9C1和SD731感染組HI效價(jià)均在210以上(圖2B)，表明經(jīng)滴鼻途徑使BALB/c小鼠成功感染流感病毒，PR8組小鼠全部死亡，故不列入此次統(tǒng)計(jì)。

注：A. 在感染病毒的第1、3天，采取感染小鼠肺組織(n=3)進(jìn)行病毒載量的測(cè)定。B. 流感病毒感染14 d后，小鼠血清HI測(cè)定。C. 小鼠肺組織炎癥因子IL-6。D. 小鼠肺組織炎癥因子TNF-α。流感病毒感染組與PBS對(duì)照組相比較，顯著性為*P < 0.05或者**P< 0.01。圖2 A型流感病毒感染BALB/c小鼠Note. A. Viral titers in the mouse lung tissues at 1 dpi and 3 dpi after inoculation. B. HI titers of rest mice at 14 dpi. C. IL-6 levels in the mouse lung tissues. D. TNF-α levels in the mouse lung tissues. Significance is shown as *P < 0.05 or **P < 0.01.Figure 2 BALB/c mice infected with influenza A virus

2.3 肺炎癥因子IL-6、TNF-α的測(cè)定

為了評(píng)估小鼠感染IAV后，小鼠肺組織的IL-6、TNF-α的水平將用評(píng)估小鼠感染流感病毒的炎癥水平。ELISA結(jié)果顯示：對(duì)比PBS陰性對(duì)照，H9C1病毒感染第1 ～ 3天，IL-6和TNF-α的蛋白水平分別升高4.21 ～ 22.66倍和0.98 ～ 1.32倍；SD731病毒感染第1 ～ 3天，IL-6和TNF-α的蛋白水平分別升高41.74 ～ 47.24倍和2.85 ～ 6.78倍；PR8病毒感染第1 ～ 3天，IL-6和TNF-α的蛋白水平分別升高242.11 ～ 354.42倍和7.46 ～ 16.82倍(圖2C、D)。因此，BALB/c小鼠致病性實(shí)驗(yàn)中，SD731和PR8病毒引起的炎癥反應(yīng)水平顯著高于H9C1。

3 討論

3.1 建立IAV感染動(dòng)物炎癥模型動(dòng)物的選擇

鑒于目前流感病毒高變異性，新型抗流感病毒藥物及疫苗的研發(fā)都需要合適的動(dòng)物模型進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。因此，合適的動(dòng)物模型是將理論成果轉(zhuǎn)化到實(shí)際應(yīng)用的必不可少的技術(shù)支撐。BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用于流感病毒的致病性研究有著獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：① BALB/c小鼠對(duì)流感病毒敏感，有明顯的癥狀和體征[25]；② BALB/c小鼠的生長(zhǎng)周期短，遺傳背景明確，倫理問(wèn)題少，便于操作[26]。

3.2 建立IAV感染動(dòng)物炎癥模型方法的選擇

現(xiàn)已確認(rèn)的促炎細(xì)胞因子主要有IL-6和TNF-α等[27-28]，這些炎癥因子在生物損傷和病毒感染的發(fā)生、發(fā)展的病理過(guò)程中扮演重要的角色。因此，本次研究中我們選用IL-6和TNF-α的水平來(lái)評(píng)估小鼠感染流感病毒后的炎癥反應(yīng)。本文中，我們以1×106TCID50的H9C1、SD731和PR8經(jīng)滴鼻方式感染BALB/c小鼠，通過(guò)連續(xù)觀察小鼠體重變化及死亡情況，感染第1、3天小鼠肺組織病毒載量及炎癥因子的水平來(lái)跟蹤流感病毒感染對(duì)小鼠的致病性。本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果顯示：SD731和PR8的致病性要顯著高于H9C1，SD731致死率達(dá)到80%，PR8致死率達(dá)到100%，而H9C1感染不致死小鼠；同時(shí)，SD731和PR8病毒引起的肺組織的炎癥反應(yīng)水平顯著高于H9C1。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了流感病毒的致病性強(qiáng)弱與炎癥反應(yīng)以及病毒的復(fù)制呈正相關(guān)。

3.3 建立IAV感染動(dòng)物炎癥模型方法的意義

本研究建立的小鼠炎癥模型，在臨床表現(xiàn)、體重變化、死亡率、病毒復(fù)制及炎性反應(yīng)等指標(biāo)方面都能達(dá)到A型流感病毒疾病模型的造模要求。此模型的建立對(duì)研究A型流感病毒的致病機(jī)制、評(píng)價(jià)藥物和疫苗治療效果等具有一定的參考意義。