丁實(shí)，趙學(xué)榮，李寶群，趙亮，周健，畢紅東，龐沖，郭娜娜

(1.承德醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，承德 067000)

缺血性腦卒中屬于常見(jiàn)的腦血管疾病，占腦血管疾病的60%以上，近年來(lái)發(fā)病率逐漸升高，給患者的家庭和生活質(zhì)量帶來(lái)了嚴(yán)重的影響[1]?；颊吣X缺血后引起的炎癥反應(yīng)、自噬、細(xì)胞壞死、鈣超載等多種原因進(jìn)而導(dǎo)致腦損傷，加重病情并影響患者的預(yù)后[2]。腦缺血過(guò)程中自噬具有雙重作用，適度自噬清除受損、衰老細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞主要起保護(hù)作用，過(guò)度自噬則導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加，加重腦損傷[3]。Beclin是一種特異性的自噬調(diào)節(jié)基因，可與配體結(jié)合激活自噬活性[4]。研究報(bào)道自噬與凋亡兩種細(xì)胞死亡方式存在相互調(diào)節(jié)作用，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)等凋亡蛋白可結(jié)合beclin蛋白激活自噬活性，調(diào)控細(xì)胞的自噬[5]。黃連素(berberine，Ber)是從黃柏等植物中提取出來(lái)的生物堿，具有抗菌、抗心律失常、抗腫瘤等多種作用，對(duì)腦缺血、老年癡呆、焦慮等神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[6]。然而關(guān)于黃連素對(duì)腦損傷中細(xì)胞自噬的作用尚不清楚，本研究通過(guò)制備大鼠腦缺血再灌注模型，觀察黃連素對(duì)大鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及對(duì)細(xì)胞自噬的影響，以期探究黃連素的可能保護(hù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠108只，8周齡，體重200 ～ 260 g，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供【SCXK證號(hào)2017-0002】，在承德醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均嚴(yán)格按照動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，本研究中經(jīng)河北省承德市動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，批號(hào)為IACUC-01(20180917)。

1.1.2 主要試劑及儀器

黃連素原粉(哈爾濱三精制藥廠，中國(guó))；尼莫地平(Nimodipine，NMDP)注射液(山東新華制藥股份有限公司，規(guī)格：10 mL/2mg，中國(guó))；2,3,5-苯氯化四氮銼(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC)溶液(Amresco公司，美國(guó))；Bcl-2、Bax、caspase-3兔抗鼠單抗(R&D Systems公司，美國(guó))；Beclin單抗(Abcam生物公司，英國(guó))；羊抗鼠IgG二抗(北京博奧森公司，中國(guó))；蘇木素、伊紅染液(Sigma公司，美國(guó))；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程公司，中國(guó))；BCA試劑盒(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，中國(guó))；尼康SMZ745光學(xué)顯微鏡(尼康株式會(huì)社，日本)；蛋白電泳儀1659001、CFX96 PCR儀(Bio-Rad公司，美國(guó))；GIS-500凝膠成像儀(杭州米歐儀器有限公司，中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥

1.2.2 藥物的配置和使用

0.5% Tween80溶解黃連素，配置成10 mg/mL的混懸溶液；于再灌注后30 min腹腔注射給藥。

1.2.3 腦缺血再灌注損傷模型大鼠制備

大鼠分組后禁食12 h，10%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)腹腔麻醉，參照馬賢德等[7]制備方法制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，大鼠仰臥位固定，頸正中部位消毒、切口，暴露右側(cè)頸總，頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，在殘端插入0.24 mm單絲尼龍魚線，插入栓線約18 ～ 20 mm，縫合皮膚，固定尼龍魚線尾部于皮膚上，大鼠缺血2 h后小心抽出栓線8 mm左右，即形成MCAO模型。

1.2.4 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分

參照Longa等[8]的分級(jí)法對(duì)蘇醒后大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，分別在大鼠清醒后6、24、48 h進(jìn)行評(píng)分：無(wú)神經(jīng)功能缺損記0分，提尾時(shí)大鼠雙上肢可伸展；1分，對(duì)側(cè)前肢不能完全伸展；2分，行走出現(xiàn)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；3分，行走出現(xiàn)向?qū)?cè)傾倒；4分，意識(shí)喪失，不能自發(fā)行走；5分，死亡。得分為1 ～ 3分即造模成功。造模完成后，大鼠隨機(jī)分組。

1.2.5 TTC染色觀察大鼠腦梗死面積

治療24 h后，每組隨機(jī)選取6只大鼠取腦，冰生理鹽水沖洗，切除額極、枕極，沿冠狀切面切為5片，迅速置于2%TTC磷酸鹽緩沖液中，37℃恒溫水浴鍋中避光孵育30 min，每5 min翻動(dòng)一次，染色均勻后，放置于4%多聚甲醛中固定，24 h后拍照，采用Image pro軟件進(jìn)行分析，計(jì)算大鼠腦梗死面積百分比。計(jì)算公式：腦梗死面積=全腦梗死面積/全腦片面積 × 100%。

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)以率（%）表示，兩組比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.6 HE染色觀察大鼠腦組織病理學(xué)變化

治療24 h后，每組隨機(jī)選取6只大鼠，取腦組織后4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片；常規(guī)二甲苯，乙醇低度脫水，蒸餾水沖洗；蘇木精染色10 min，流水沖洗； 0.7% 鹽酸乙醇5 s，流水沖洗；伊紅染色復(fù)染5 min，梯度乙醇脫水2 min，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察切片。

1.2.7 RT-PCR法檢測(cè)腦組織中Bcl-2、caspase-3、Bax mRNA的表達(dá)

治療24 h后，每組隨機(jī)選取6只大鼠處死，取大鼠缺血側(cè)腦組織，根據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)體系為20 μL： 2× SYBR Mix 10 μL，引物各0.5 μL，10× cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：95℃ 5 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s，72℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。引物序列見(jiàn)下表1。以β-actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算Bcl-2、caspase-3、Bax mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequences

1.2.8 Western blot檢測(cè)腦皮質(zhì)中 Bcl-2、caspase-3、Bax、Beclin-1蛋白表達(dá)

采用Western blot檢測(cè)腦組織中Bcl-2、caspase-3、Bax、Beclin-1蛋白表達(dá)量，RIPA 裂解液裂解組織，勻漿腦組織樣品，提取總蛋白；BCA法測(cè)定蛋白濃度；配制10%分離膠、5%濃縮膠，等量蛋白樣品(50 μg/孔)上樣；濃縮膠設(shè)置電壓80 V，分離膠設(shè)置電壓120 V，電泳后將目的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，TBST清洗；5%脫脂奶封閉1 h，一抗(Bcl-2、caspase-3、Bax、Beclin-1)1∶500稀釋后4℃孵育過(guò)夜，TBST清洗3次/5 min；二抗1∶5000稀釋后室溫孵育1 h，TBST清洗3次/5 min，滴加ECL顯影液，凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行灰度值比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦缺血模型的鑒定

所有大鼠缺血前生命體征正常，處于清醒狀態(tài)。模型大鼠缺血后四肢僵直，角弓反張，活動(dòng)能力消失，眼球顏色由鮮紅色轉(zhuǎn)為灰白色；再灌注后，眼球顏色恢復(fù)，瞳孔活動(dòng)，灌注約1 h后可自主活動(dòng)，表明造模成功。

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

在大鼠缺血再灌注后Sham組無(wú)行為學(xué)改變，MCAO大鼠在24 h出現(xiàn)不同程度的腦缺血損傷表現(xiàn)，再灌注6、24、48 h分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能Longa評(píng)分，Sham組無(wú)神經(jīng)功能缺損，I/R組6、24、48 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能評(píng)分均顯著高于Sham組，24 h的神經(jīng)功能評(píng)分最高；與模型組比較，BBR處理組和NMDP組24 h、48 h的神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低(P< 0.05)，且NMDP組作用效果更顯著(P< 0.05)。見(jiàn)表2。

表2 腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的比較Table 2 Comparison of neurological function scores of the rats with cerebral ischemia-reperfusion

注：與Sham組比較，*P< 0.05；與I/R組比較，△P< 0.05；與BBR-L組比較，#P< 0.05。

Note. Compared with the sham group,*P< 0.05. Compared with the I/R group,△P< 0.05. Compared with the BBR-L group,#P< 0.05.

2.3 TTC染色觀察黃連素對(duì)各組大鼠腦組織梗死面積的影響

Longa評(píng)分顯示，24 h神經(jīng)功能評(píng)分最高，對(duì)24 h的各組大鼠進(jìn)行TTC染色檢測(cè)腦組織梗死面積，均一紅色為正常腦組織，大小不等、蒼白色為梗死灶；Sham組無(wú)肉眼可見(jiàn)梗死組織；與Sham組比較，I/R組梗死面積百分比為(36.45 ± 4.44)顯著升高(P< 0.05)，與I/R組比較，BBR-L組、BBR-M組、BBR-H組和NMDP組梗死面積分別為(20.50 ± 3.34)、(15.28 ± 0.28)、(12.34 ± 0.25)、(8.23 ± 0.19)顯著減少(P< 0.05)。見(jiàn)圖1。

2.4 HE染色觀察黃連素對(duì)大鼠腦組織病理學(xué)的影響

HE染色顯示Sham組大鼠神經(jīng)細(xì)胞呈層狀排列，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核圓且核仁明顯；I/R組大鼠神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，排列紊亂，細(xì)胞核固縮，多數(shù)細(xì)胞壞死；BBR治療組大鼠神經(jīng)細(xì)胞也有減少，少部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，隨著B(niǎo)BR濃度的增加壞死細(xì)胞數(shù)量減少；NMDP組神經(jīng)細(xì)胞排列較整齊，壞死細(xì)胞較BBR治療組減少。見(jiàn)圖2。

圖1 各組大鼠梗死面積TTC染色圖Figure 1 TTC staining of the infarct size of rats in each group

圖2 各組大鼠腦組織的病理學(xué)改變(HE染色)Figure 2 Histopathological changes in the brain tissues of rats in each group(HE staining)

2.5 qRT-PCR檢測(cè)黃連素對(duì)各組大鼠腦組織凋亡相關(guān)基因mRNA水平的影響

與Sham組比較，I/R組Bcl-2、caspase-3、Bax mRNA水平均顯著升高(P<0.05)；與I/R組比較，BBR治療組和NMDP組Bcl-2 mRNA水平均顯著升高，caspase-3、Bax mRNA水平均顯著降低(P< 0.05)，呈劑量依賴性；與Sham組比較，I/R組Bcl-2/Bax比值顯著降低(P< 0.05)；與I/R組比較，各治療組Bcl-2/Bax比值均顯著上升(P< 0.05)，且呈劑量依賴性，BBR-H組與NMDP組無(wú)顯著差異(P> 0.05)。見(jiàn)表3。

表3 黃連素對(duì)各組大鼠腦組織凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Table 3 Effects of berberine on expression of apoptosis-related genes in brain tissues of the rats in different n=6)

注：與Sham組比較，*P< 0.05；與I/R組比較，△P< 0.05；與BBR-L組比較，#P< 0.05；與BBR-M組比較，&P< 0.05。

Note. Compared with the sham group,*P< 0.05. Compared with the I/R group,△P< 0.05. Compared with the BBR-L group,#P< 0.05. Compared with the BBR-M group,&P< 0.05.

2.6 Western blot檢測(cè)黃連素對(duì)各組大鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組Bcl-2、caspase-3、Bax蛋白水平均顯著升高；與I/R組比較，BBR治療組和NMDP組Bcl-2蛋白水平顯著升高(P< 0.05)，BBR-H組與NMDP組無(wú)顯著差異(P> 0.05)；caspase-3、Bax蛋白水平顯著降低(P< 0.05)。見(jiàn)圖3。

注：與Sham組比較，aP< 0.05；與I/R組比較，bP< 0.05；與BBR-L組比較，cP< 0.05；與BBR-M組比較，dP< 0.05。(下圖同)圖3 各組大鼠凋亡蛋白表達(dá)比較Note. Compared with the sham group, aP< 0.05. Compared with the I/R group, bP< 0.05. Compared with the BBR-L group, cP< 0.05. Compared with the BBR-M group, dP< 0.05.(The same in the following figure)Figure 3 Comparison of the expression of apoptotic proteins in the rats of each group

2.7 Western blot檢測(cè)黃連素對(duì)各組大鼠腦組織自噬蛋白Beclin-1及Bcl-2/Beclin-1比值的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Sham 組比較，I/R組Beclin-1蛋白水平升高(P< 0.05)；與I/R組比較，BBR組和NMDP組Beclin-1蛋白水平顯著升高(P< 0.05)。Bcl-2/Beclin-1比值顯示，與Sham組比較，I/R組Bcl-2/Beclin-1蛋白水平升高(P< 0.05)；與I/R組比較，BBR組和NMDP組Bcl-2/Beclin-1比值均降低，且BBR-M組、BBR-H組、NMDP組Bcl-2/Beclin-1無(wú)顯著差異(P> 0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠Beclin-1蛋白及Bcl-2/Beclin-1比值比較Figure 4 Comparison of Beclin-1 protein and Bcl-2/Beclin-1 ratio in the rats of different groups

3 討論

缺血性腦卒中是我國(guó)居民死亡率和致殘率最高的腦血管疾病，以往治療腦缺血主要采用溶栓的方法，但易引發(fā)缺血再灌注損傷，加重病情的發(fā)展，因此探究缺血再灌注損傷的病理機(jī)制，尋找更有效的治療方法是目前的首要任務(wù)。研究報(bào)道，腦缺血再灌注損傷涉及多種病理過(guò)程，如細(xì)胞自噬、凋亡、炎癥反應(yīng)等[9]。缺血再灌注損傷中Beclin、Bcl-2在細(xì)胞凋亡和自噬過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但關(guān)于黃連素對(duì)腦缺血再灌注的保護(hù)作用是否涉及Beclin、Bcl-2的研究較少，故本研究分析黃連素對(duì)腦缺血再灌注大鼠模型基于Bcl-2/Beclin的保護(hù)作用，以期為腦缺血再灌注損傷的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種，主要是清除體內(nèi)損傷細(xì)胞，維持機(jī)體存活。腦缺血再灌注后可同時(shí)激活體內(nèi)凋亡與抗凋亡過(guò)程，其中caspase-3、Bax發(fā)揮促凋亡作用，Bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用[10]。caspase-3在正常組織中以無(wú)活性的形式存在，在腦組織損傷時(shí)去磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腸aspase-3，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[11]。Bcl-2可通過(guò)減少凋亡誘導(dǎo)因子、與促凋亡因子Bax結(jié)合、拮抗凋亡蛋白酶等發(fā)揮抑制凋亡作用。研究報(bào)道，Bcl-2可通過(guò)抑制caspase的激活阻止細(xì)胞的凋亡[12]。Bcl-2、Bax均屬Bcl-2家族，研究顯示Bcl-2/Bax比值對(duì)凋亡有決定作用，Bax降低、Bcl-2增強(qiáng)，Bcl-2/Bax比值增加，可抑制大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡[13]。本研究顯示黃連素治療組Bcl-2表達(dá)增加，caspase-3和Bax的表達(dá)降低，Bcl-2/Bax比值增加，提示黃連素可減少細(xì)胞的凋亡，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。張童等[14]報(bào)道，黃連素預(yù)處理可減輕心肌損傷大鼠的心肌梗死面積，使心肌損傷得到明顯改善。本研究中黃連素治療后，大鼠腦梗死面積顯著減少，神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少，提示黃連素對(duì)缺血再灌注腦組織具有保護(hù)作用，高濃度黃連素效果與尼莫地平效果相似。

細(xì)胞損傷過(guò)程可同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡與自噬過(guò)程，細(xì)胞自噬的發(fā)生可延遲或者對(duì)抗細(xì)胞凋亡。Beclin-1也稱為自噬相關(guān)蛋白-6(autophagy-related gene-6，ATG-6)，可以引導(dǎo)自噬蛋白定位于自噬小體[15]。研究表明，缺血條件下，Bcl-2、Bcl-xL等也可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，Bcl-2/Bax比值增加，促進(jìn)自噬的激活[16]。抗凋亡蛋白Bcl-2在調(diào)控Beclin-1中發(fā)揮重要作用，Beclin-1存在BH3結(jié)構(gòu)域，Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等能夠與Beclin-1蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合抑制Beclin-1誘導(dǎo)的過(guò)度自噬作用[17]。研究報(bào)道，大鼠心肌缺血時(shí)可激活自噬，再灌注階段過(guò)度自噬會(huì)損傷心肌，適當(dāng)抑制自噬可保護(hù)心肌，因此可通過(guò)調(diào)節(jié)自噬水平發(fā)揮心肌保護(hù)作用[18]。研究報(bào)道，自噬與凋亡具有密切聯(lián)系，Bcl-2與Beclin-1之間的平衡對(duì)細(xì)胞的存亡具有重要作用，Bcl-2/Beclin-1復(fù)合體是評(píng)價(jià)自噬的重要指標(biāo)，可通過(guò)維持適當(dāng)?shù)淖允伤?，阻滯因自噬引起的?xì)胞死亡[19]。研究報(bào)道，Bcl-2/Beclin-1復(fù)合體水平減低可對(duì)腦梗死大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用[20]。本研究顯示應(yīng)用黃連素治療后，Beclin-1表達(dá)量升高，提示黃連素可增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞自噬蛋白的表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，BBR-H組和NMDP組的Beclin-1水平處于一定范圍，使得自噬作用維持一定范圍，以免過(guò)度自噬引起細(xì)胞死亡，且治療組Bcl-2/Beclin-1比值降低，提示黃連素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究結(jié)果提示姜黃素可激活缺血再灌注大鼠的神經(jīng)細(xì)胞自噬作用，且可維持Bcl-2/Beclin-1水平，減輕過(guò)度自噬對(duì)細(xì)胞的損傷，為臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)，但本研究也存在一定的不足之處，未對(duì)自噬的具體作用機(jī)制進(jìn)行研究，還有待進(jìn)一步深入研究。