黃愷，孫鑫，趙志敏，彭淵，陶艷艷，劉成海,*

(1. 上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203； 2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 肝病研究所，上海 201203)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種嗜肝性DNA病毒，可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化與肝癌[1-2]。建立穩(wěn)定的HBV誘導(dǎo)的慢性肝炎肝纖維化動(dòng)物模型對(duì)于乙肝肝纖維化病理機(jī)制及其藥物評(píng)價(jià)具有重要意義。本研究采用C57BL/6 N-Tg(1.28HBV)/Vst乙肝病毒轉(zhuǎn)基因(HBV-Tg)與rAAV8-1.3HBV腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染(rAAV)小鼠，聯(lián)合CCl4腹腔注射，誘導(dǎo)慢性乙肝肝纖維化發(fā)生。觀(guān)察比較兩種模型的病毒學(xué)及纖維化病理特點(diǎn)，為研究時(shí)選擇相關(guān)動(dòng)物模型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6野生型小鼠20只，C57BL/6 N-Tg (1.28 HBV)/Vst乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠10只，購(gòu)自并飼養(yǎng)于北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2014-0001】【SYXK(京)2014-0015】，體重(20 ± 5)g，自由飲食飲水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

rAAV8-1.3HBV 重組腺相關(guān)病毒，購(gòu)自北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司。四氯化碳(Carbon tetrachloride，CCl4)，化學(xué)純；橄欖油，化學(xué)純，均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；血清HBsAg、HBeAg檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法，ELISA)，HBV-DNA定量檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?，購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)測(cè)試盒(貨號(hào)：C009-1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)測(cè)試盒(貨號(hào)：C010-1)、堿性磷酸酶(AKP)測(cè)試盒(貨號(hào)：A059-1)、蘇木精-伊紅染液(貨號(hào)：D006)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗HBcAg多克隆抗體(貨號(hào)：ab140243)、小鼠抗HBsAg單克隆抗體(貨號(hào)：ab859)、兔鼠通用HRP/DAB二抗顯色試劑盒(貨號(hào)：ab64264)，均購(gòu)自Abcam公司；羥脯氨酸(Hyp)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司。Bio-Tek Power Wave XS微孔板分光光度計(jì)，購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司；石蠟脫水機(jī)、病理切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；高倍顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物造模與分組

將C57BL/6N野生型小鼠隨機(jī)分為野生型對(duì)照組(WT)、rAAV8-1.3HBV轉(zhuǎn)染組(rAAV)、CCl4組(CCl4)、rAAV8-1.3HBV轉(zhuǎn)染復(fù)合CCl4組(rAAV+CCl4)，將同周齡C57BL/6 N-Tg(1.28HBV)/Vst乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為HBV轉(zhuǎn)基因組(Tg)、HBV轉(zhuǎn)基因復(fù)合CCl4組(Tg+CCl4)。每組小鼠各設(shè)5只。rAAV8-1.3HBV轉(zhuǎn)染采用尾靜脈注射方式，實(shí)驗(yàn)首日注射1次，每只小鼠尾靜脈注射病毒載量為1E+10v.g.；CCl4以橄欖油稀釋至10%濃度，按照2 mL/kg小鼠體重腹腔注射造模，隔天1次。造模12周后麻醉處死小鼠，留取血清與肝組織。

1.2.2 血清HBV病毒學(xué)指標(biāo)測(cè)定

血清HBsAg、HBeAg采用ELISA試劑盒檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作；血清HBV-DNA采用熒光探針PCR試劑盒檢測(cè)，UNG酶反應(yīng)50℃ 2 min，預(yù)變性94℃ 2 min， 變性94℃ 10 s 循環(huán)60次，退火、延伸及檢測(cè)熒光60℃ 30 s檢測(cè)通道：530 nm(FAM)。

1.2.3 血清肝功能測(cè)定

血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，采用賴(lài)氏比色法試劑盒檢測(cè)；血清堿性磷酸酶(AKP)，采用金氏法試劑盒檢測(cè)，均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作。

1.2.4 肝組織Hyp含量測(cè)定

參照J(rèn)amall’s鹽酸水解法[3]，稱(chēng)取100 mg肝組織放入50%鹽酸中105℃水解過(guò)夜。后取三層濾紙過(guò)濾水解液并吸取100 μL烘干處理。取Hyp標(biāo)準(zhǔn)品0.2 ～ 1.6 μg設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，經(jīng)氯胺T溶液0.2 mL，含25%對(duì)二甲基氨基苯甲醛和27.3%高氯酸的異丙醇溶液反應(yīng)，50℃水浴1 h， 558 nm測(cè)定吸收值。

1.2.5 肝組織病理

小鼠肝組織 4%甲醛浸泡固定、脫水后石蠟包埋切片；進(jìn)行HE染色后封片，顯微鏡(×200倍)觀(guān)察。天狼猩紅采用飽和苦味酸配制，顯微鏡(×100倍)觀(guān)察，利用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)膠原面積作半定量分析。

1.2.6 肝組織免疫組織化學(xué)染色

肝組織脫蠟逐級(jí)復(fù)水，檸檬酸鹽緩沖液高壓熱修復(fù)，3%雙氧水去酶處理內(nèi)源性酶。5% BSA室溫30 min，滴加一抗4℃過(guò)夜。洗去一抗滴加二抗37℃ 1 h，洗去后滴加SABC鏈霉素10 min。DAB顯色后蘇木素染核封片。陽(yáng)性區(qū)域總面積半定量分析采用Image-Pro Plus 6.0軟件。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩種復(fù)合模型小鼠血清病毒學(xué)指標(biāo)比較

結(jié)果顯示：除WT組、CCl4組外，其余組血清HBsAg、HBeAg均為陽(yáng)性，兩種復(fù)合模型組相比，Tg+CCl4組血清HBsAg和HBeAg水平高于rAAV+CCl4組(P< 0.01、P< 0.05)(圖1A、1B)。PCR結(jié)果顯示，除WT組、CCl4組外，其余組別血清HBV-DNA載量均高于1.0×104IU/mL， rAAV組與rAAV+CCl4組HBV-DNA載量高于Tg組與Tg+CCl4組(P< 0.01、P< 0.05)(圖1C)。

注：**P< 0.01 vs WT;ΔΔP< 0.01 vs rAAV;▲P< 0.05，▲▲P< 0.01 vs rAAV+CCl4;n=5。圖1 小鼠血清乙肝病毒學(xué)檢測(cè)結(jié)果Note. **P<0.01 vs WT.ΔΔP<0.01 vs rAAV.▲P< 0.05，▲▲P< 0.01 vs rAAV+CCl4.n=5.Figure 1 Virological detection of HBV in the mouse serum

2.2 兩種復(fù)合模型小鼠肝組織免疫組化染色指標(biāo)比較

肝組織石蠟切片免疫組化結(jié)果顯示，WT組、CCl4組均未見(jiàn)HBsAg、HBcAg陽(yáng)性表達(dá)，其余組別小鼠肝組織中HBsAg和HBcAg均可見(jiàn)不同程度陽(yáng)性表達(dá)(圖2A)；通過(guò)圖片半定量分析后發(fā)現(xiàn)，rAAV組較Tg組HBsAg陽(yáng)性表達(dá)面積明顯減少(P< 0.01)，而rAAV組較Tg組肝細(xì)胞核HBcAg陽(yáng)性數(shù)量明顯增多(P< 0.01)；兩種復(fù)合模型組相比，HBsAg在肝組織中的表達(dá)未見(jiàn)明顯差異(P> 0.05)，但rAAV+CCl4組肝細(xì)胞核HBcAg陽(yáng)性數(shù)量顯著高于Tg+CCl4組(P< 0.01)(圖2B、2C)。

注：**P< 0.01 vs WT，ΔΔP< 0.01 vs rAAV，▲▲P< 0.01 vs rAAV+CCl4，n=5。圖2 小鼠肝組織HBsAg、HBeAg免疫組化染色與半定量分析Note. **P< 0.01 vs WT，ΔΔP< 0.01 vs rAAV，▲▲P< 0.01 vs rAAV+CCl4，n=5.Figure 2 Immunohistochemical staining(A) and semi-quantitative analysis of HBsAg(B) and HBeAg(C) in the mouse liver tissues

2.3 兩種復(fù)合模型小鼠肝組織炎癥與纖維化生化學(xué)指標(biāo)的比較

血清生化檢測(cè)結(jié)果顯示(表1)，與WT組比較，CCl4復(fù)合造模12周后，CCl4組、Tg+CCl4組與rAAV+CCl4組血清ALT與AST水平均明顯上升(P< 0.01)，Tg組與rAAV組對(duì)比WT組沒(méi)有明顯變化(P> 0.05)。Tg組與rAAV組ALT水平具有差異(P< 0.01)。兩種復(fù)合模型組相比；Tg+CCl4組與rAAV+CCl4組ALT、AST水平均未見(jiàn)顯著差異(P> 0.05)；各組AKP水平均未見(jiàn)明顯差異(P> 0.05)。肝組織Hyp含量檢測(cè)結(jié)果顯示，與WT組比較，CCl4復(fù)合造模12周后，CCl4組、Tg+CCl4組與rAAV+CCl4組肝組織中Hyp含量均顯著升高(P< 0.01)，兩種復(fù)合模型組相比，Tg+CCl4組對(duì)比rAAV+CCl4組肝內(nèi)Hyp含量具有明顯差異(P< 0.01)。

表1 小鼠血清肝功能及肝組織羥脯胺酸含量的測(cè)定Table 1 Serum ALT, AST, AKP levels and Hyp levels in the mouse liver tissues

注：*P< 0.05，**P< 0.01vsWT，ΔΔP< 0.01vsrAAV，▲▲P< 0.01vsrAAV+CCl4，n=5。

Note.*P< 0.05，**P< 0.01vsWT，ΔΔP< 0.01vsrAAV，▲▲P< 0.01vsrAAV+CCl4，n=5.

2.4 兩種復(fù)合模型小鼠肝組織炎癥與纖維化病理特點(diǎn)的比較

HE染色結(jié)果顯示，WT組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝細(xì)胞呈條索狀排列整齊，在中央靜脈周?chē)史派錉罘植?，Tg組與rAAV組肝小葉排列整齊，僅可觀(guān)察到肝細(xì)胞核增大，其中rAAV組存在少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，CCl4組、rAAV+CCl4組、Tg+CCl4組均出現(xiàn)大量肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死，正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)明顯氣球樣變和脂肪變，匯管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。天狼猩紅染色結(jié)果顯示，WT組肝組織未見(jiàn)明顯膠原沉積，Tg組和rAAV組匯管區(qū)及小葉間出現(xiàn)少量膠原沉積，呈細(xì)線(xiàn)狀，未見(jiàn)明顯的橋接和假小葉，CCl4組、rAAV+CCl4組、Tg+CCl4組肝組織出現(xiàn)明顯膠原纖維沉積，由匯管區(qū)向周?chē)由?，形成纖維間隔，其中Tg+CCl4組可見(jiàn)到明顯的假小葉形成(圖3A)。通過(guò)膠原半定量分析后發(fā)現(xiàn)；Tg+CCl4組膠原含量高于rAAV+CCl4組(P< 0.01)(圖3B)。

注：**P< 0.01 vs WT，▲▲P< 0.01 vs rAAV+CCl4，n=5。圖3 肝組織病理HE、天狼猩紅染色與膠原半定量分析Note. **P< 0.01 vs WT，▲▲P< 0.01 vs rAAV+CCl4 ,n=5.Figure 3 Pathological changes (A) and semi-quantitative analysis of collagen content (B) in the mouse liver tissues

3 討論

目前乙肝動(dòng)物模型主要為：麻鴨乙型肝炎模型、轉(zhuǎn)基因小鼠模型、樹(shù)鼩模型等[4-5]。其中以小鼠乙肝模型為主流[6-7]。小鼠乙肝模型又可分為轉(zhuǎn)基因型、高壓水動(dòng)力注射型與腺病毒轉(zhuǎn)染[8]三種。其中利用肝衰竭小鼠移植人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells)的人源化模型可有效模擬人體乙肝肝硬化發(fā)病過(guò)程[9]，但是此類(lèi)方法實(shí)驗(yàn)難度較高且成本較為昂貴。近年來(lái)，有研究者使用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠復(fù)合CCl4模型觀(guān)察慢性乙肝肝纖維化過(guò)程中自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cells，NKT cells)的變化[10]。構(gòu)建慢性乙肝肝纖維化動(dòng)物模型需具備兩個(gè)基本要素：首先是HBV基因的高水平表達(dá)，其次具有長(zhǎng)期性的HBV感染及相應(yīng)的纖維化的病理特征。rAAV采用攜帶1.3拷貝HBV基因組的重組8型腺相關(guān)病毒，依其對(duì)于肝親嗜性特點(diǎn)，將HBV基因組高效導(dǎo)入肝細(xì)胞中[11]。HBV-Tg轉(zhuǎn)基因小鼠則是1.28拷貝HBV病毒基因片段或全基因組導(dǎo)入小鼠單細(xì)胞受精卵的雄原核，再植入母體使其發(fā)育[12]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明[13]，單純HBV-Tg小鼠在36周以上才會(huì)出現(xiàn)較為明顯的自發(fā)性病理炎癥和轉(zhuǎn)氨酶升高。通過(guò)CCl4復(fù)合造?？梢赃M(jìn)一步縮短成模時(shí)間。CCl4模型在與肝纖維化發(fā)展相關(guān)的組織學(xué)、生化學(xué)、細(xì)胞和分子變化方面具有明顯特點(diǎn)，通過(guò)誘導(dǎo)肝內(nèi)III區(qū)壞死和肝細(xì)胞凋亡，使肝星狀細(xì)胞活化導(dǎo)致纖維化產(chǎn)生[14-15]。

合理地選用小鼠慢性乙肝模型可以有效解決HBV在病毒感染、復(fù)制、免疫應(yīng)答和藥物評(píng)價(jià)方面的難題。本研究發(fā)現(xiàn)：Tg組與rAAV組在聯(lián)合CCl4染毒12周后能夠穩(wěn)定成模。兩者血清生化學(xué)差異并不明顯，其差異主要體現(xiàn)在病毒學(xué)標(biāo)志物方面。HBV-DNA結(jié)果可以看到：由于rAAV本身具有劇烈嗜肝性，注射機(jī)體后破壞肝細(xì)胞使大量HBV-DNA釋放入血，并且肝組織中HBcAg大面積表達(dá)是其典型特征。而HBV-Tg病毒主要依靠小鼠不斷表達(dá)HBV蛋白并且在肝中產(chǎn)生病毒顆粒[16]，HBV-DNA的復(fù)制則相對(duì)緩慢。rAAV8注射后，機(jī)體自身免疫應(yīng)答升高，血清中出現(xiàn)Anti-HBs，血清學(xué)轉(zhuǎn)換發(fā)生，部分HBsAg被清除[17-18]，導(dǎo)致血清與肝組織中HBsAg和HBeAg水平較HBV-Tg組偏低。纖維化進(jìn)展方面；Tg+CCl4組則更為明顯，其原因和自然殺傷T細(xì)胞加速并釋放細(xì)胞因子IL-4和IL-13導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活化有關(guān)[19]。

綜上所述，rAAV與HBV-Tg在建立慢性乙肝模型上具有一定優(yōu)勢(shì)，但是同時(shí)也存在一些局限性。首先兩者無(wú)法有效在體內(nèi)合成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)。并且由于CCl4造成的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷后部分肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生壞死，導(dǎo)致HBV的復(fù)制存在一定抑制[20]，但rAAV+CCl4組與Tg+CCl4組病毒學(xué)指標(biāo)仍要高于WT組。本次實(shí)驗(yàn)rAAV注射劑量為每只1E+10v.g.，增加病毒載量至5E+12v.g.時(shí)成模效率可能更高，并且rAAV由于其存在嗜肝性，需要一定的尾靜脈注射技巧，處理不當(dāng)可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)人員發(fā)生感染風(fēng)險(xiǎn)。而HBV-Tg相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)性較小并且價(jià)格相對(duì)低廉。綜上所述，本研究?jī)煞N模型可以給慢性乙肝纖維化的藥物評(píng)價(jià)提供一定思路和借鑒。如需探討乙肝纖維化免疫機(jī)制等其他問(wèn)題，則有待進(jìn)一步研究挖掘。