卷葉貝母異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶基因(IDI)的克隆與分析

楊千葉 黃可佳 張陽 李銳

摘要：旨在克隆卷葉貝母（Fritillaria cirrhosa D. Don）生物堿合成過程中的關(guān)鍵酶——異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶（isopentenyl diphosphate isomerase，簡(jiǎn)稱IDI），并運(yùn)用生物信息學(xué)和熒光定量方法對(duì)其功能進(jìn)行分析，為卷葉貝母甾類生物堿合成途徑及其調(diào)控機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。以卷葉貝母再生鱗莖為試驗(yàn)材料，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，通過PCR技術(shù)克隆川貝母IDI基因（FcIDI）的開放閱讀框（open reading frame，簡(jiǎn)稱ORF）序列，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，并通過熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)FcIDI基因在卷葉貝母根、莖、葉、野生鱗莖、再生鱗莖及愈傷組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，F(xiàn)cIDI的ORF片段為885 bp，編碼294個(gè)氨基酸，與大豆（Glycine max）、杜仲（Eucommia ulmoides）、番薯（Ipomoea）、廣藿香（Pogostemon cablin）等植物IDI蛋白的相似性達(dá)85%以上;FcIDI蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，α-螺旋及不規(guī)則卷曲是其整體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的主要組成結(jié)構(gòu)元件;qRT-PCR試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)cIDI在野生鱗莖中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于根、莖、葉等其他植物組織，再生鱗莖的IDI表達(dá)量高于野生鱗莖，在愈傷組織中的表達(dá)量最高。生物信息學(xué)分析和不同植物組織部位及組培誘導(dǎo)物的IDI相對(duì)表達(dá)量差異結(jié)果顯示，F(xiàn)cIDI是1個(gè)生物堿合成途徑中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，并受激素組合誘導(dǎo)表達(dá)，研究結(jié)果為提高卷葉貝母中的生物堿含量及深入研究植物IDI的功能奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：卷葉貝母;異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶;克隆;生物信息學(xué);基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： Q943.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）16-0067-04

收稿日期：2018-04-27

基金項(xiàng)目：四川省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：17ZA0078）;成都大學(xué)2017年校青年基金（編號(hào)：2017XJZ04）。

作者簡(jiǎn)介：楊千葉（1994—），女，河南沈丘人，碩士，主要從事藥用植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究。

通信作者：李 銳，博士，講師，主要從事藥用植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究。

卷葉貝母（Fritillaria cirrhosa D. Don）又稱川貝母，為百合科多年生草本植物，是一種主產(chǎn)于四川的高原瀕危藥材。干燥鱗莖作為其主要藥用部位，含有生物堿、有機(jī)酸、皂苷、氨基酸等13種化學(xué)物質(zhì)[1]。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上，卷葉貝母主要用于治療肺熱燥咳、痰多胸悶、咯痰帶血等癥[2]。近期研究表明，川貝母的干燥鱗莖富含川貝堿、西貝堿、貝母素乙和貝母素甲等甾類生物堿[3]，此外還具有十分廣泛的生物學(xué)活性，如降壓、抗菌、消炎、抗腫瘤等[4-7]。目前，卷葉貝母的市場(chǎng)需求量大但產(chǎn)量低，供需矛盾日益突出，并且其野生資源遭受大肆采挖[8]。面對(duì)卷葉貝母資源日益匱乏的現(xiàn)狀，要從根本上解決卷葉貝母資源問題，就要對(duì)其藥效成分的生物合成機(jī)制進(jìn)行研究，以便運(yùn)用基因工程手段進(jìn)行分子育種，進(jìn)而提高藥效成分含量。

甾類生物堿的生物合成很復(fù)雜，許多研究表明，其生物合成途徑與三萜類化合物相似，目前植物萜類合成的上游途徑已基本明確，異戊烯基焦磷酸（IPP）是所有萜類化合物合成的中心前體，在植物中有2條合成途徑，即2-甲基-D-赤鮮糖醇-4-磷酸（MEP）途徑和甲羥戊酸（MVA）途徑[9]，在這2種途徑中均存在異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶（IDI）催化異戊烯焦磷酸（IPP）異構(gòu)化形成二甲丙烯焦磷酸（DMADP）的過程。IDI作為萜類生物合成過程中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，其過量表達(dá)有利于促進(jìn)下游產(chǎn)物的生物合成[10]。研究表明，在大腸桿菌中過表達(dá)番茄SlIDI基因、酵母ScIDI基因、靈芝GlIDI基因和喜樹CaIDI基因，均能導(dǎo)致類胡蘿卜素的生物合成和累積[11-14]。在杜仲中，過表達(dá)EuIDI基因能增加反式聚異戊二烯的生物合成[15]。目前已有許多植物中的IDI基因被克隆，如喜樹、山榛、柴胡和丹參等[11，16-22]。然而迄今，關(guān)于卷葉貝母異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶基因（FcIDI）的克隆卻鮮有報(bào)道。

為了探究卷葉貝母IDI基因是否參與萜類合成、甾類生物堿合成等代謝過程，為甾類、三萜類化合物代謝途徑提供優(yōu)質(zhì)基因資源，本研究基于筆者前期研究得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆卷葉貝母的IDI基因，并對(duì)其進(jìn)行序列分析和組織特異性表達(dá)分析，以期為闡明卷葉貝母的甾類生物堿合成途徑及其調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

卷葉貝母野生材料來自四川省康定折多山川貝母野生撫育基地，愈傷組織、再生鱗莖由筆者所在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)組織培養(yǎng)獲得。基因克隆所用材料為卷葉貝母的再生鱗莖，基因組織特異性表達(dá)分析所用野生材料為3年生卷葉貝母的根、莖、葉，采樣日期為2016年7月12日。

大腸桿菌菌株，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存;總RNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;熒光定量試劑盒（SsoFasttm EvaGreen?Sapermix），購(gòu)自BIO-RAD公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime-Script RT reagent Kit）、Pfu高保真酶、pMD19-T載體，購(gòu)自TaKaRa公司;引物合成及基因測(cè)序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成 使用植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取卷葉貝母再生鱗莖總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）說明書合成cDNA第1鏈，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-80 ℃，用于后續(xù)基因克隆試驗(yàn)。

1.2.2 FcIDI基因的克隆與生物信息學(xué)分析 根據(jù)筆者所在實(shí)驗(yàn)室得到的卷葉貝母轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫，用primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)FcIDI基因的特異性引物，并命名為FcIDIF和FcIDIR（表1）。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離并切膠回收后克隆到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）Top10感受態(tài)細(xì)胞。菌落經(jīng)PCR驗(yàn)證后，挑取陽性克隆送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，獲得重組質(zhì)粒pMD19-FcIDI。

將克隆的FcIDI基因編碼區(qū)翻譯成氨基酸序列，用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡(jiǎn)稱NCBI）網(wǎng)站的BLASTp工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性搜索;用DNAMAN 6.0軟件對(duì)目前已經(jīng)克隆IDI的代表性植物進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì);用MEGA 5.1軟件構(gòu)建分子進(jìn)化樹;用ExPASy在線服務(wù)器的ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)FcIDI蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析;分別采用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODE（http：//swissmodel.expasy.org/）在線分析軟件對(duì)FcIDI蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.2.3 卷葉貝母IDI基因表達(dá)量分析 分別取3年生卷葉貝母的根、莖、葉、鱗莖以及由筆者所在實(shí)驗(yàn)室通過組織培養(yǎng)獲得的愈傷組織和再生鱗莖，提取總RNA。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，合成cDNA第1鏈，以卷葉貝母18S基因（AY616727.1）為內(nèi)參，利用primer primier 5.0軟件設(shè)計(jì) qRT-PCR擴(kuò)增引物，分別命名為qFcIDIF和qFcIDIR，序列見表1;將合成的各樣品cDNA稀釋50倍后作為模板，用SsoFasttm EvaGreen?Sapermix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，每組樣品設(shè)3個(gè)平行重復(fù)，并進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)。反應(yīng)在ABI7000熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線、溶解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線由軟件自動(dòng)生成。所得數(shù)據(jù)用內(nèi)參基因校準(zhǔn)后使用CT（2-ΔΔCT）法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 FcIDI基因的克隆與生物信息學(xué)分析

以卷葉貝母再生鱗莖cDNA為模板，使用表1的FcIDI基因特異性引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增得到約900 bp的片段（圖1），經(jīng)測(cè)序鑒定結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得出，F(xiàn)cIDI基因的開放閱讀框（ORF）序列長(zhǎng)885 bp，編碼蛋白含有294個(gè)氨基酸殘基，其基本理化性質(zhì)如下：總原子數(shù)為4 721個(gè)，原分子組成為C1 500H2 370N406O435S10，帶負(fù)電的氨基酸有45個(gè)[天冬氨酸（Asp）+谷氨酸（Glu）]，帶正電的氨基酸有36個(gè)[精氨酸（Arg）+賴氨酸（Lys）]，其理論分子量為33.3 ku，理論等電點(diǎn)（pI值）為 5.61，不穩(wěn)定指數(shù)為37.85，屬于穩(wěn)定蛋白;脂肪指數(shù)為99.83，總平均疏水性（GRAVY）為-0.198，為親水蛋白。將由FcIDI基因推測(cè)的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行BLASTp檢索發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cIDI推測(cè)蛋白與大豆（Glycine max）、杜仲（Eucommia ulmoides）、番薯肯尼亞屬（Ipomoea Kenyan）、廣藿香（Pogostemon cablin）等植物IDI蛋白的相似性達(dá)85%以上。

用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行同源比對(duì)，從圖2可以看出，F(xiàn)cIDI蛋白具有植物IDI蛋白的高度保守性。在BLASTp分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)8種植物IDI基因的氨基酸序列同源性，使用MEGA 5.1軟件作出系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由圖3可見，F(xiàn)cIDI與同屬于單子葉的中國(guó)蓮的NnIDI蛋白處于同一進(jìn)化枝，表明二者的親緣關(guān)系較近。

分別采用SOPMA和SWISS-MODE在線分析軟件對(duì)FcIDI氨基酸序列的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。圖4結(jié)果表明，F(xiàn)cIDI蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋（H）占45.24%，無規(guī)則卷曲（C）占41.25%，延伸帶（E）占13.27%。表明α-螺旋及不規(guī)則卷曲是其整體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的主要結(jié)構(gòu)組成元件;此外，β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。通過SWISS-MODE進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的同源建模，找到FcIDI的同源模型PDB：2i6k.1.A，其三維結(jié)構(gòu)通過X射線（X-ray）被測(cè)定出來。經(jīng)過比對(duì)，F(xiàn)cIDI和2i6k.1.A的氨基酸序列一致性高達(dá)52.42%。

2.2 FcIDI基因表達(dá)量的變化分析

以2016年7月12日采集的卷葉貝母根、莖、葉、鱗莖及由該鱗莖培養(yǎng)誘導(dǎo)的愈傷組織和再生鱗莖為材料，采用熒光定量PCR方法檢測(cè)FcIDI基因在不同組織中的表達(dá)差異水平。如圖5所示，F(xiàn)cIDI基因在所檢測(cè)的組織中均有表達(dá)，在愈傷組織中的表達(dá)量最高，達(dá)到根的15.9倍，其次為再生鱗莖中，根中的表達(dá)量最低，葉、莖中的表達(dá)量較高，分別是根的3.3、3.7倍。

3 討論

FcIDI基因克隆是以卷葉貝母再生鱗莖為材料、以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果為基礎(chǔ)，通過PCR技術(shù)克隆獲得其ORF序列。經(jīng)生物信息學(xué)結(jié)構(gòu)分析表明，卷葉貝母IDI蛋白與其他植物的IDI蛋白具有較高的同源性，IDI為卷葉貝母生物堿合成途徑中的關(guān)鍵酶，F(xiàn)cIDI的表達(dá)為下游卷葉貝母總生物堿的合成提供了前體物質(zhì)，因此FcIDI的研究尤為重要。

本研究通過檢測(cè)卷葉貝母不同植物組織部位IDI的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的愈傷組織和再生鱗莖中IDI的相對(duì)表達(dá)量較野生貝母各組織的高，進(jìn)一步證實(shí)，通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的貝母愈傷組織和再生鱗莖能夠有效提高其生物堿含量[23-24]。因此，本研究推測(cè)，組織培養(yǎng)物中可能存在生物堿高效積累的機(jī)制。

本研究為卷葉貝母的分子生物學(xué)研究提供了基因資源，并為后續(xù)FcIDI的研究奠定了基礎(chǔ)。筆者所在課題組后續(xù)將對(duì)FcIDI蛋白進(jìn)行純化和酶活性檢測(cè)分析，進(jìn)一步研究FcIDI基因的功能，從而為卷葉貝母甾類生物堿合成途徑的闡明奠定基礎(chǔ)。

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