牛種布魯氏菌clpP 基因缺失株的毒力和免疫保護力評價

彭小薇，吳方達，劉郁夫，董 浩，孫永健，畢一鳴，張存瑞，劉林青，韓 燾

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 102618；2.寧德市動物疫病預防控制中心，福建寧德 352000；3.中國動物疫病預防控制中心，北京 102618；4.農業(yè)農村部畜牧獸醫(yī)局，北京 100125）

布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q布病）是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的須通報動物疫病，目前在全球160 多個國家和地區(qū)流行[1]。近年來，由于我國牛羊養(yǎng)殖量快速增長，地區(qū)間牛羊無序調運，畜間和人間布病疫情有加重趨勢。2014 年全國共報告人感染病例57 222 例，到達歷年峰值[2]。

疫苗免疫是防控動物布病的主要手段之一。目前，在國內使用的弱毒活疫苗，包括豬種S2 株、牛種A19 株和羊種M5 株，其在防控布病流行中發(fā)揮了重要作用。然而這些疫苗株仍存在局限性，如引起懷孕動物流產、毒力返強以及對人有感染性和干擾臨床血清學檢測等[3]。

ClpP 蛋白是一種保守的肽酶，可以與不同亞基組成Clp 蛋白酶復合體。在多種病原菌中，ClpP 蛋白與細菌致病性密切相關[4-5]。目前，該蛋白的功能及其與細菌毒力的關系尚沒有相關研究。本研究構建了牛種布魯氏菌clpP基因缺失株，測定了該缺失株在巨噬細胞感染模型和小鼠感染模型中的毒力，并評價了用clpP基因缺失株免疫小鼠后產生的免疫保護力，從而為揭示布魯氏菌的致病機制和布病疫苗候選株的篩選提供了一定的數據支持。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒與實驗動物

牛種布魯氏菌2308 株[6]，由國家動物布魯氏菌病參考實驗室保存；大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，購于天根生化科技有限公司；同源重組質粒pBluscript ⅡKS（+）和廣宿主基因克隆質粒pBBR1MCS，由國家動物布魯氏菌病參考實驗室保存。SPF 級4～6 周齡雌性BALB/c 小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。所有涉及布魯氏菌的實驗操作，均在中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生物安全3 級實驗室完成。

1.2 主要試劑

細菌基因組DNA 提取試劑盒，購于天根生化科技有限公司；質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒，購于OMEGA 公司；Premix ExTaq聚合酶，KpnI、BamHI 限制性內切酶，購自TaKaRa 公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯（TSB），購于BD 公司；胰蛋白胨、酵母浸出膏，購于Sigma 公司。

1.3 同源重組質粒和回補質粒的構建

以提取的牛種布魯氏菌2308 株基因組DNA為模板，使用引物DclpP-UF/UR 和DclpP-DF/DR，分別擴增clpP基因的上下游同源臂片段；以回收的上下游同源臂片段為模板，使用引物DclpP-UF 和DclpP-DR 進行連接PCR 擴增；回收連接PCR 產物并經過BamHI 和KpnI 雙酶切后，插入同樣經雙酶切的pBluscript ⅡKS（+）質粒中，獲得質粒pBluscript-clpP 載體；最后，使用卡那霉素抗性基因擴增引物（Kan-F/R）進行PCR 擴增，并將擴增的卡那霉素抗性基因片段，經XhoI 單酶切插入pBluscript-clpP 質粒中，獲得同源重組質粒pBlue-clpP::Kan。

以提取的牛種布魯氏菌2308 株基因組DNA為模板，應用引物對CclpP-F/R 進行PCR 擴增（擴增片段包括clpP基因的ORF 及上下游啟動子序列）；膠回收PCR 產物，使用KpnI 和BamHI 對DNA 片段和pBBR1MCS 質粒進行雙酶切；過夜連接后轉化DH5α，用含氯霉素的LB 平板進行篩選，經PCR 和測序鑒定陽性質粒，將其命名為pBBRCclpP。

構建同源重組和互補質粒的引物，參照牛種布魯氏菌2308 株clpP基因片段（BAB1_1132）進行設計，并由中美泰和有限公司合成。引物詳細信息見表1，相關測序試驗由中美泰和有限公司完成。

1.4 clpP 基因缺失株和回補株的構建

將牛種布魯氏菌2308 株單菌落接種于10 mL的TSB 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下，震蕩培養(yǎng)至生長對數期；將細菌在4 ℃低溫條件下離心，去除培養(yǎng)基上清，然后經4 ℃預冷的無菌去離子水洗滌3 次；取78 μL 洗滌后的牛種布魯氏菌2308株菌液和5 μL pBlue-clpP::Kan 質粒，混勻后加入電擊杯，使用“Agr”的電轉參數進行電轉化；將電擊后的細菌加入500 μL TSB 液體培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)6 h 后，取200 μL 涂布在卡那霉素抗性的TSA 平板培養(yǎng)基上，并置于37 ℃溫箱靜置培養(yǎng)3～7 d；待長出單菌落后，分別經氨芐青霉素和卡那霉素抗性的平板培養(yǎng)基篩選，并采用PCR 鑒定是否為clpP基因缺失株（ΔclpP）。

表1 引物序列

回補菌株構建方法與clpP基因缺失株構建方法類似，同樣采用電轉化方法，將構建的pBBRCclpP 質粒導入clpP基因缺失株，通過氯霉素抗性的平板培養(yǎng)基進行陽性克隆篩選，并采用PCR 方法進一步鑒定是否為回補菌株（CclpP）。

1.5 細胞感染試驗

用TSB 培養(yǎng)基，將2308、ΔclpP和CclpP菌株培養(yǎng)至穩(wěn)定期，進行細菌平板計數后放至4 ℃冰箱暫存。用3% FBS 的DMEM，將小鼠RAW264.7巨噬細胞懸液稀釋至5×105cell/mL；將0.5 mL細胞懸液加到24 孔細胞板中，即每孔細胞數為2.5×105個。根據細菌計數結果，將布魯氏菌以MOI=100:1 的劑量接種RAW264.7 細胞，500×g離心5 min，然后置于37 ℃孵育1 h；感染結束后，換成含50 μg/mL 慶大霉素的細胞維持液處理1 h，殺滅胞外細菌，最后換成含20 μg/mL 慶大霉素的維持培養(yǎng)液；取感染后1、12、24、48、72 h 5 個時間點，統計胞內細菌存活數，做3 個復孔。試驗重復2 次。

1.6 小鼠感染試驗

用TSB 培養(yǎng)基將布魯氏菌2308、ΔclpP、CclP菌株培養(yǎng)至穩(wěn)定期，進行細菌計數后置于4 ℃冰箱暫存。根據細菌計數結果，用生理鹽水將細菌稀釋至1×106CFU/mL，并以0.1 mL 的劑量腹腔注射4～6 周齡SPF 級BALB/c 小鼠（1×105CFU/只）。

分別于攻毒后1 周和4 周處死小鼠，無菌采集小鼠脾臟，加1 mL 生理鹽水研磨脾臟組織；10倍倍比稀釋后，涂布TSA 平板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，計算脾臟細菌載量。

1.7 小鼠體內持續(xù)存活期評價

在小鼠模型中，評價clpP缺失株在小鼠模型中的脾臟殘余毒力，同時設置A19 疫苗株對照組和2308 強毒株對照組。具體試驗步驟同1.6。

1.8 clpP 基因缺失株免疫保護力測定

試驗步驟參照OIE《陸生動物診斷試驗與疫苗手冊》（2004 版）中關于布魯氏菌疫苗評價的內容進行。將36 只4～6 周齡BALB/c 小鼠分成3組：clpP基因缺失株免疫組、A19 疫苗對照組和PBS 陰性對照組，每組12 只；分別以1×105CFU/只的劑量腹腔接種小鼠；免疫8 周后，每個免疫組分別以牛種布魯氏菌強毒2308 株和羊種布魯氏菌強毒M28 株腹腔接種小鼠，攻毒劑量均為2×105CFU/只；攻毒2 周后剖殺小鼠，無菌采集小鼠脾臟，統計脾臟質量和載菌量，計算免疫保護單位，以此來評價ΔclpP和A19 菌株的免疫保護效果。免疫保護單位為PBS 注射組與免疫組小鼠平均脾臟載菌量取10 的對數的差值。

2 結果

2.1 clpP 基因缺失株和回補菌株的構建

將同源重組質粒pBlue-clpP::Kan 電轉至2308株后，經氨芐青霉素和卡那霉素平板篩選，得到具有卡那霉素抗性且對氨芐青霉素敏感的布魯氏菌clpP基因缺失株。使用DclpP-UF/DR 引物進一步進行PCR 驗證，結果發(fā)現親本株2308 可擴增出約1 400 bp 大小的片段，而突變株可以擴增出約2 400 bp 大小的片段（圖1），證明基因缺失株ΔclpP構建成功。

將回補質粒PBBR-CclpP 電轉至基因缺失株ΔclpP后，經氯霉素平板篩選和進一步PCR 驗證，證明clpP基因缺失回補菌株（CclpP）構建成功。

圖1 親本株與基因缺失株的PCR 鑒定結果

2.2 細胞感染試驗

為評價2308、ΔclpP和CclpP等菌株在巨噬細胞內的增殖能力，在體外進行RAW264.7 小鼠巨噬細胞系感染試驗。結果如圖2 所示：在相同感染劑量下（MOI=100:1），感染1 h 和12 h 后，感染細胞內2308、ΔclpP及CclpP的細菌數無顯著差異；感染24、48 和72 h 后，ΔclpP菌株感染的巨噬細胞胞內細菌數顯著低于親本株2308 和回補株CclpP，說明clpP基因缺失可顯著降低布魯氏菌在巨噬細胞感染模型中的胞內增殖能力。

圖2 牛種布魯氏菌2308、ΔclpP 和Cclp在RAW264.7 細胞中的胞內增殖情況

2.3 小鼠感染試驗

將 親 本 株2308 以 及ΔclpP和CclpP株，以1×105CFU/只的劑量腹腔注射4～6 周齡SPF 級雌性BALB/c 小鼠（每組5 只），并分別在感染后1周和4 周剖殺小鼠，通過脾臟質量和脾臟載菌量評價細菌毒力。結果如圖3 所示：在感染后1 周和4周，ΔclpP株感染組小鼠脾臟質量和載菌量顯著低于2308 株感染組；在感染后4 周，80%（4/5）的ΔclpP株感染組小鼠已經在體內清除細菌，而親本株2308 和回補菌株CclpP感染組的脾臟載菌量仍維持在高位。

2.4 clpP 基因缺失株持續(xù)期評價

為評價clpP基因缺失株的安全性，首先在BLAB/c 小鼠模型中，檢測clpP基因缺失株在小鼠脾臟中的持續(xù)期，以親本菌株2308 為強毒對照、疫苗株A19 為疫苗株對照，分別在感染后不同時間點剖殺小鼠，以小鼠脾臟質量、脾臟載菌量為指標進行評價。結果顯示（圖4）：clpP基因缺失株的殘余毒力顯著低于2308 株和疫苗株A19；clpP基因缺失株可在感染后6 周完全從小鼠脾臟中被清除；與2308 株、A19 疫苗株相比，clpP基因缺失株感染小鼠后并不引起明顯的脾臟腫脹。

圖3 牛種布魯氏菌2308、ΔclpP 和CclpP 感染后小鼠的脾臟質量及載菌量

圖4 2308、ΔclpP 和A19 株感染小鼠3～49 d 后在脾臟中的殘余毒力

2.5 clpP 基因缺失株免疫保護力評價

為評價clpP基因缺失株免疫動物后產生的抵抗同源和異源攻毒的免疫保護力，在小鼠模型中進行了免疫保護力測定。結果如表2 所示：疫苗株A19 可為同源和異源攻毒提供良好的免疫保護力，抵抗同源（牛種2308 強毒）攻毒的脾臟免疫保護單位為2.41，抵抗異源（羊種M28 強毒）攻毒的脾臟免疫保護單位為4.23；而clpP基因缺失株僅能提供微弱免疫保護力，免疫保護單位分別為0.67（P〈0.05）和0.46（P〈0.001），免疫保護效果明顯低于疫苗株A19。

3 討論

在病原菌感染過程中，蛋白酶水解作用與細菌的毒力密切相關。在細胞質中，Lon 和Clp 是發(fā)揮蛋白水解作用的主要蛋白酶，可通過降解毒力調控因子直接參與調控毒力，也可調控細菌在不利環(huán)境中的耐受能力，從而間接影響毒力。在布魯氏菌中，研究表明，Lon 蛋白酶與布魯氏菌抵御多種應激環(huán)境密切相關。除此之外，Lon 蛋白酶功能的缺失還會影響布魯氏菌對小鼠的早期感染[7-8]。然而，在布魯氏菌中，ClpP 蛋白酶的功能一直是未知的。本研究首次構建了牛種布魯氏菌clpP基因缺失菌株，并通過巨噬細胞感染試驗和小鼠模型感染試驗，證明了ClpP 蛋白酶與布魯氏菌毒力密切相關。

表2 clpP 基因缺失株免疫保護力測定結果

疫苗免疫是防控家畜布病的重要手段。但是目前國內使用的布魯氏菌疫苗均存在對人有感染風險、干擾血清學鑒別診斷等缺點。因此，研究人員利用分子生物學技術，嘗試對疫苗株進行改造，在不影響疫苗株免疫原性的前提下，提高其安全性，并使其具有成為分子標記從而進行鑒別診斷的潛力。本研究發(fā)現，clpP基因缺失株的毒力顯著低于親本菌株2308，并且在小鼠體內存活時間也短于A19 疫苗株，并且不引起小鼠脾臟腫脹，說明相比A19 疫苗株，clpP基因缺失株的安全性得到顯著提升，但是clpP基因缺失株免疫小鼠后抵抗同源和異源攻毒能力卻明顯低于A19 疫苗株。

布魯氏菌是一種胞內寄生菌，宿主在抗布魯氏菌感染的過程中，細胞免疫發(fā)揮了主要作用，體液免疫發(fā)揮次要作用[9]。因此，一種優(yōu)秀的布魯氏菌疫苗除了不形成持續(xù)性感染，還應能在宿主體內存活一定時間，從而充分激活機體的細胞免疫反應[10]。clpP基因缺失株很可能是由于過快地被宿主清除，無法激發(fā)機體產生足夠的細胞免疫反應，所以無法保護小鼠抵御布魯氏菌同源菌株和異源菌株的感染。