H1 亞型豬流感病毒微滴數(shù)字RT-PCR定量檢測(cè)方法的建立

譚建錫，禹思宇，唐連飛，胡憶文，白 雪，侯義宏

（1.長(zhǎng)沙海關(guān)技術(shù)中心，湖南長(zhǎng)沙 410004；2.岳陽海關(guān)，湖南岳陽 414000；3.常德海關(guān)，湖南常德 415000）

豬流感（swine influenza，SI）是一種嚴(yán)重的呼吸道傳染病，由豬流感病毒（swine influenza virus，SIV）引起，具有急性、高度接觸性、群發(fā)性等特點(diǎn)，臨床主要表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、發(fā)熱，不同年齡、性別和品種的豬均能感染，是普遍存在于規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)中的群發(fā)性疾病[1]。豬體內(nèi)混合有禽流感病毒和人流感病毒的受體，較易產(chǎn)生新型的重配病毒。SIV 在豬群中以H1 和H3 為主要流行亞型，因此如何快速有效檢測(cè)H1亞型SIV 越來越受到關(guān)注。目前，流感病毒的快速檢測(cè)主要利用基于分子技術(shù)的普通RT-PCR 和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 等方法[2]。熒光定量RT-PCR法具有較高特異性和靈敏度，應(yīng)用較為廣泛，但其定量測(cè)定需要用標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，因而操作耗時(shí)費(fèi)力。

微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）作為一種新興起的核酸絕對(duì)定量技術(shù)，可從溶液中直接獲得樣本拷貝數(shù)，而不需要依賴于標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線。其原理是通過極度稀釋，在一定數(shù)目的微滴中分布1 個(gè)或0 個(gè)拷貝，進(jìn)行PCR 單分子擴(kuò)增后，讀取樣本熒光信號(hào)，再通過泊松（poisson）分布和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來計(jì)算核酸拷貝數(shù)。由于不依賴建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，且對(duì)低濃度核酸樣品也可進(jìn)行高靈敏度的絕對(duì)定量，使得ddPCR 技術(shù)在核酸絕對(duì)定量領(lǐng)域有極大的應(yīng)用前景[4]。已有文獻(xiàn)[6]報(bào)道，將該技術(shù)應(yīng)用于偽狂犬病病毒[5]和H7N9 流感病毒的定量研究，但未對(duì)ddPCR 退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，也未見將ddPCR 技術(shù)應(yīng)用于H1 亞型SIV 絕對(duì)定量檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。

本研究將ddPCR 技術(shù)應(yīng)用于H1 亞型SIV 檢測(cè)，并對(duì)其最佳退火溫度、檢出限以及檢測(cè)準(zhǔn)確度等方面進(jìn)行研究，建立了H1 亞型SIV ddRT-PCR絕對(duì)定量檢測(cè)方法，為我國H1 亞型SIV 的實(shí)時(shí)監(jiān)控提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

H1、H3、H5、H7 亞型SIV，以及豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）均為滅活病毒，由長(zhǎng)沙海關(guān)技術(shù)中心動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑和儀器

One-step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes、ddPCR droplet generation oil for Probes、Droplet Reader Oil：購自美國伯樂公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit：購自QIAGEN 公司；一步法qRTPCR 試劑（EvoScript RNA Probes Master）：購自瑞士羅氏公司；PX1 熱封儀、微滴式數(shù)字PCR 儀：QX200伯樂；梯度PCR擴(kuò)增儀：LabCycler 96，德國；熒光PCR 儀：LC480 羅氏。

1.3 引物設(shè)計(jì)

將GenBank 數(shù)據(jù)庫中的H1 亞型SIV HA 基因序列進(jìn)行生物學(xué)信息分析，選出高度保守且特異的區(qū)域（1 536～1 692 bp），利用Oligo 及Primer Premier 軟件，設(shè)計(jì)并合成特異性引物和TaqMan熒光探針。試驗(yàn)中用到的引物及探針序列見表1，所有引物及探針均由Invitrogen 公司合成。

表1 H1 亞型SIV ddRT-PCR 引物和探針序列

1.4 RNA 提取

按照QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒說明書，提取H1、H3、H5 和H7 亞型流感病毒以及PRRSV、CSFV 等病毒的基因組RNA，并將提取好的RNA 保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.5 ddPCR 反應(yīng)方法構(gòu)建

反應(yīng)體系（20 μL）：4×Supermix 5 μL，上、下游引物終濃度均為900 nmol/L，探針終濃度為250 nmol/L，以及300 nmol/L DTT 1 μL、RNA 模板2 μL，用ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。

微滴生成：將20 μL 反應(yīng)液和70 μL 微滴生成油，分別加入到微滴生成卡DG8 的中間和最后一排的各孔中，用專用膠墊覆蓋后，放置于微滴生成儀上，自動(dòng)生成微滴于第1 排；吸取40 μL 油滴加入96 孔板內(nèi)。

封膜及擴(kuò)增：將96 孔板放置于PX1 熱封儀上，設(shè)置程序180 ℃ 10 s 進(jìn)行封膜；之后，將封好膜的96 孔板放入梯度PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃15 s，最佳退火溫度1 min，40 個(gè)循環(huán)。

數(shù)據(jù)讀取及分析：將96 孔板放入QX200 微滴式數(shù)字PCR 儀中讀取信號(hào)，獲得試驗(yàn)數(shù)據(jù)并分析。陰性對(duì)照中的模板用水代替。

1.6 退火溫度條件優(yōu)化

在PCR 儀上設(shè)置擴(kuò)增溫度梯度，退火梯度范圍為55～61 ℃，溫度間隔1 ℃，共7 個(gè)溫度梯度。按照1.5 中的操作，對(duì)應(yīng)設(shè)置PCR 擴(kuò)增溫度后進(jìn)行反應(yīng)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；用RNA 核酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3 次，求平均值，確定最佳退火溫度。

1.7 靈敏性及重復(fù)性試驗(yàn)

將H1 亞型SIV 核酸進(jìn)行10 倍梯度稀釋，并以此為模板，取2 μL 用已建立的ddRT-PCR 方法，測(cè)定最低檢出限，并繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照1.5 和1.6 篩選出的最佳條件設(shè)置。試驗(yàn)操作重復(fù)3 次，計(jì)算變異系數(shù)，進(jìn)行重復(fù)性評(píng)估。

1.8 特異性試驗(yàn)

以H1、H3、H5 和H7 亞型SIV，以及PRRSV、CSFV 核酸為模板進(jìn)行特異性檢測(cè)。

1.9 臨床應(yīng)用

將從湖南省規(guī)?；i場(chǎng)收集到的30 份豬鼻拭子樣品提取核酸后，分別用本試驗(yàn)建立的ddRTPCR 方法和qRT-PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果的一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ddRT-PCR 方法建立

根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)和試驗(yàn)指南，制備ddPCR 反應(yīng)體系，對(duì)體系退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，建立了H1亞型SIV ddRT-PCR 檢測(cè)方法。結(jié)果（圖1）顯示，退火溫度55～61 ℃范圍內(nèi)均有熒光信號(hào)被檢出，陰陽性微滴有明顯分界，且在57～58 ℃時(shí)出現(xiàn)最大擴(kuò)增振幅；當(dāng)溫度為55 ℃時(shí)，陰陽性微滴中間略微存在彌散；當(dāng)退火溫度為56～61℃時(shí)，陰陽性微滴中間彌散較少，可能因溫度太低引起的擴(kuò)增特異性略有降低。綜合考慮，選擇58 ℃作為反應(yīng)最佳退火溫度。

圖1 H1 亞型SIV ddPCR 退火溫度優(yōu)化結(jié)果

隨著樣本核酸濃度依次降低，由左到右（A03—H03），反應(yīng)體系中陽性微滴數(shù)量（藍(lán)色點(diǎn)）逐漸減少；相對(duì)應(yīng)的，同體系中陰性反應(yīng)的微滴數(shù)目（黑色點(diǎn)）則逐漸增加，顏色不斷變深（圖2）。直方圖（圖3）顯示，陽性微滴峰的熒光強(qiáng)度普遍較高，而陰性微滴峰的熒光強(qiáng)度較低，且兩者之間存在明顯區(qū)分，無雜峰。以上結(jié)果說明，建立的H1 亞型SIV ddRT-PCR 方法有較高的可靠性。

圖2 不同濃度下的H1 亞型SIV ddRT-PCR 散點(diǎn)圖

圖3 不同濃度下的H1 亞型SIV ddRT-PCR 直方圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測(cè)限

分別用核酸稀釋度和陽性拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），發(fā)現(xiàn)線性方程為y=-1.068 2x+5.855 6，線性關(guān)系R2值為0.994，最低檢測(cè)限為4.7 copies/μL，表明此方法具有較好的線性關(guān)系。

圖4 H1 亞型SIV ddRT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 ddPCR 重復(fù)性分析

利用建立的ddPCR 方法，對(duì)同一核酸模板進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)變異系數(shù)均〈5%，證明所建立的ddPCR 檢測(cè)方法重復(fù)性良好，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、可靠（表2）。

表2 微滴式ddRT-PCR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 ddPCR 特異性試驗(yàn)

以H1、H3、H5 和H7 亞型SIV 以及PRRSV和CSFV 的基因組RNA 為模板進(jìn)行ddRT-PCR 擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)各孔微滴的生成量比較均衡，能夠滿足試驗(yàn)成立條件。由圖5 可知，僅H1 亞型SIV 檢測(cè)孔出現(xiàn)陽性微滴，H3、H5、H7 亞型SIV，以及PRRSV、CSFV 和陰性對(duì)照孔中，均未檢測(cè)到陽性微滴信號(hào)，即與其他病毒均無交叉反應(yīng)，表明該方法檢測(cè)H1 亞型SIV 核酸具有良好的特異性。

圖5 H1 亞型SIV ddPCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 臨床樣品驗(yàn)證

將30 份豬鼻拭子樣品提取RNA 后，分別用本試驗(yàn)建立的ddRT-PCR 方法以及qRT-PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2 份樣品均檢測(cè)為陽性，其余28份樣品均檢測(cè)為陰性，表明兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致，符合率為100%。

3 討論

H1 亞型動(dòng)物流感一直威脅著畜禽業(yè)的發(fā)展，同時(shí)也威脅著人類健康[7]。傳統(tǒng)的熒光RT-PCR 方法被廣泛用于流感病毒的定性檢測(cè)，但其定量檢測(cè)需要依賴外標(biāo)對(duì)樣品初始拷貝數(shù)定量后再進(jìn)行測(cè)定，操作過程耗時(shí)費(fèi)力[8]。隨著新技術(shù)的發(fā)展，也有其他新方法被用于流感病毒的定量檢測(cè)。王瀟等[9]利用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RT-RPA）對(duì)H1 亞型動(dòng)物流感進(jìn)行檢測(cè)，最低可檢測(cè)到的病毒核酸濃度為0.96×10-2g/mL。劉文俊等[10]建立動(dòng)物H1 亞型流感病毒（IV）的重組酶聚合酶擴(kuò)增-側(cè)流層析試紙條（RPA-LFD）檢測(cè)方法，可檢測(cè)到最低濃度為10 copies/μL 的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。ddPCR 的最高檢測(cè)拷貝數(shù)約為2×104copies/μL，初始濃度過高時(shí)，不符合泊松分布，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)陽性微滴數(shù)的檢測(cè)[5]。

數(shù)字微滴PCR 技術(shù)具有對(duì)反應(yīng)條件要求較低、抑制劑對(duì)反應(yīng)影響較小[11]、可檢測(cè)到單個(gè)拷貝、不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線等優(yōu)點(diǎn)，使其在病毒定量檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用。本研究通過ddPCR 技術(shù)，建立了H1 亞型SIV 絕對(duì)定量方法，確定了最佳退火溫度、核酸濃度范圍及最低檢出限，實(shí)現(xiàn)了直接得出樣品中病毒核酸拷貝數(shù)的絕對(duì)定量和高靈敏度檢測(cè)，為病毒的定量檢測(cè)提供了一種新思路。ddRTPCR 也有其不足之處，目前微流控微滴芯片單次生成量較低，大量樣品需多次操作，大多數(shù)儀器僅配置1～2 重?zé)晒庑盘?hào)通道，因此多重?zé)晒鈾z測(cè)方面還需加強(qiáng)。隨著未來技術(shù)的進(jìn)步，高通量微流控微滴生成芯片的研制及高重?zé)晒庑盘?hào)通道的出現(xiàn)，會(huì)大大提高ddPCR 技術(shù)的檢測(cè)效率，將會(huì)推動(dòng)其在更大領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。