巨敏瑩，王艷杰，劉東霞，張 斌，韓 宇，烏吉斯古楞，宋慶慶，關(guān)平原

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.金宇保靈生物藥品有限公司，獸用疫苗國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020）

犬腺病毒（canine adenovirus，CAV）又稱犬傳染性肝炎病毒，其基因組為雙股DNA。犬腺病毒病是對(duì)包括犬在內(nèi)多種哺乳動(dòng)物的一種致病性強(qiáng)、感染范圍廣、高度接觸性傳染病[1-2]。CAV 有兩個(gè)血清型：CAV-I 型和CAV-II 型。CAV-I 型是傳染性犬肝炎的病原體，引起的特征性病癥為肝小葉壞死、肝實(shí)質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞核包涵體[3-4]，以急性壞死性肝炎為特征，恢復(fù)期病犬角膜由渾濁逐漸變?yōu)樗{(lán)白色，因此又稱犬的“藍(lán)眼病”[5]。CAV-II 型是傳染性氣管支氣管炎的病因之一，可引起犬輕度急性上呼吸道疾病，患病率很高[6]。在感染細(xì)胞的核內(nèi)，CAV-II 排列緊密，呈典型的結(jié)晶狀；而CAV-I排列相對(duì)疏松，有時(shí)也能呈現(xiàn)緊湊排列，但其所形成的結(jié)晶不如CAV-II 明顯[7]。

CAV-I 和CAV-II 型的共感染頻率較高，在同一份病料中經(jīng)?？蓹z測(cè)到兩種CAV 病毒。但因兩種病毒之間存在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致血清學(xué)方法在診斷中的應(yīng)用有限[8]，因此需要建立一種特異性強(qiáng)、敏感性高的CAV-I 型和CAV-II 型鑒別檢測(cè)方法。本試驗(yàn)建立了用于鑒別檢測(cè)CAV-I 和CAV-II 的TaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR。該方法操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源和主要試劑

CAV-I 型、CAV-II 型病毒以及犬瘟熱病毒（CDV）、犬副流感病毒（CPIV）、犬細(xì)小病毒（CPV）、犬冠狀病毒（CCV），均由金宇保靈生物藥品有限公司獸用疫苗國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室提供。

Axyprep 體液病毒DNA/RNA 提取試劑盒，購(gòu) 于AxyGen 公 司；AceQ?QPCR Probe Master Mix 試劑（批號(hào)L/N7E241E8），購(gòu)于Vazyme 公司；E.COLI JM109 感受態(tài)細(xì)胞、SOC Medium、MiniBEST Agarose GelDNA Extration Kit Ver 4.0（批號(hào)AI10973A），購(gòu)自Takara 公司；TOPO TA Clong? kit for sequencing PCR?4-TOPO? vector，購(gòu) 自invitrogen 公 司；Scientific Gene JET Plasmid Miniprep kit ck0502（批 號(hào)00532991），購(gòu) 自Thermo 公司。

1.2 引物和探針設(shè)計(jì)

依據(jù)GenBank 中已登錄的CAV I 型和II 型基因序列（CAV-I 型GenBank 號(hào)KP840549.1，CAVII 型GenBank 號(hào)EU717145.1），利用DNAstar 軟件中的MegAlign 模塊進(jìn)行序列分析并設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)1 對(duì)符合兩種病毒的通用引物，以及2 條標(biāo)記不同發(fā)光基團(tuán)能夠區(qū)分兩種基因型的探針（表1）。引物探針由上海生工有限公司合成。

表1 CAV-I 和CAV-II TaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 引物和探針

1.3 病毒核酸提取

參照Axyprep 體液病毒DNA/RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取CAV-I、CAV-II、CDV、CPIV、CPV、CCV 的病毒DNA 或RNA，將提取的核酸樣品置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

分別以CAV-I 和CAV-II 型病毒為模板，參照如下反應(yīng)體系（表2，總體積25 μL）和循環(huán)條件（表3）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以獲得目的片段。將PCR 目的片段膠回收純化克隆至TOPO 載體中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliJM109 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液鑒定和測(cè)序，篩選陽(yáng)性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒；將提取的質(zhì)粒用Qubit 3.0 進(jìn)行質(zhì)粒濃度測(cè)定，并根據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算公式計(jì)算拷貝數(shù)，然后進(jìn)行10 倍梯度稀釋，獲得8 個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)品（108～101copies/μL）。CAV-I 型 和CAV-II 型 各個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)品按照1:1 比例混勻，制備CAV-I 和CAV-II 混合標(biāo)準(zhǔn)品。

表2 CAV-I 和CAV-II 標(biāo)準(zhǔn)品制備PCR 反應(yīng)體系

表3 CAV-I 和CAV-II 標(biāo)準(zhǔn)品制備PCR 反應(yīng)程序

1.5 方法建立及條件優(yōu)化

采用25 μL 反應(yīng)體系，利用方陣法，對(duì)CAV-I 型和CAV-II 型TaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR方法的引物濃度（100～500 nm），探針濃度（100～500 nm），模板加入量（1～5 μL）、退火溫度（52、54、56、58、60 ℃）等進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳反應(yīng)體系和循環(huán)條件。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及敏感性試驗(yàn)

將CAV-I 和CAV-II 混勻重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（108～101copies/μL），采用本研究建立的TaqMan雙重?zé)晒舛縋CR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)Bio-Rad CFX 96 熒光定量PCR 儀及軟件生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)該方法進(jìn)行敏感度檢測(cè)。

1.7 特異性試驗(yàn)

采用建立的TaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 方法，對(duì)CAV-I、CAV-II、CDV、CPIV、CPV、CCV 等病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，判定該方法的特異性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

3 人配3 組體系，采用本研究建立的TaqMan雙重?zé)晒舛縋CR 方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，計(jì)算組內(nèi)和組間變異系數(shù)，分析方法的重復(fù)性。

1.9 臨床樣品檢測(cè)

將收集的41 份通過(guò)人工攻毒取得犬組織和拭子樣品進(jìn)行基因組DNA/RNA 提取，以待檢樣品為模板，采用建立的TaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 檢測(cè)方法和普通PCR 檢測(cè)方法進(jìn)行樣品檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行符合率分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

以CAV-I 和CAV-II DNA 為模板，利用設(shè)計(jì)好的引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，獲得預(yù)期大小的目的片段。目的片段進(jìn)行切膠回收純化后克隆于TOPO 載體，構(gòu)建的CAV-I 重組質(zhì)粒濃度為76.5 ng/μL（1.7×1010copies/μL），CAV-II重組質(zhì)粒濃度為66 ng/μL（1.4×1010copies/μL）。以I 型和II 型稀釋后的等比例體積混合模板作為雙重?zé)晒舛縋CR 的標(biāo)準(zhǔn)品模板。

2.2 反應(yīng)體系和條件優(yōu)化

優(yōu)化后的反應(yīng)體系如表4 所示（總體積25 μL），循環(huán)條件如表5 所示。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

采用已建立的CAV-I 和CAV-IITaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 的反應(yīng)體系和循環(huán)條件進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)。結(jié)果（圖1 和圖2）顯示：CAV-I 和CAV-II 相關(guān)系數(shù)分別為0.998 和0.999，效率分別為101.2 和100.0，均在 90%～110%之間，具有良好的線性關(guān)系；CAV-I 和CAV-II 的回歸方程分別為y=-3.293x+42.809 和y=-3.321x+41.490。因此，可以根據(jù)所檢測(cè)臨床樣品的Cq 值，并參照標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。

表4 反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

表5 循環(huán)條件優(yōu)化結(jié)果

圖1 CAV-I 和CAV-II TaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 曲線

圖2 CAV-I 和CAV-II TaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 敏感性試驗(yàn)

采用已建立的CAV-I 和CAV-IITaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 的反應(yīng)體系和循環(huán)條件進(jìn)行靈敏度驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)CAV-I 和CAV-II 最小檢測(cè)量分別為100 copies/μL 和10 copies/μL（圖3），表明所建立方法的敏感性高。

2.5 特異性試驗(yàn)

圖3 CAV-I 和CAV-II TaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 探針敏感度檢測(cè)結(jié)果曲線

采用已建立的CAV-I 和CAV-IITaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 反應(yīng)體系和循環(huán)條件進(jìn)行相關(guān)病毒核酸檢測(cè)，每個(gè)樣品做2 個(gè)重復(fù)，并設(shè)立陰性對(duì)照和CAV I 和II 型陽(yáng)性對(duì)照（每個(gè)樣品2 個(gè)重復(fù)）。特異性結(jié)果顯示，僅CAV-I 和CAV-II 核酸出現(xiàn)典型的“S”擴(kuò)增曲線，且CT 值均小于35，而其他病毒核酸樣品和陰性對(duì)照均沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線（圖4），表明所建立方法具有較好的特異性。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

采用已建立的CAV-I 和CAV-IITaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 反應(yīng)體系和循環(huán)條件進(jìn)行方法重復(fù)性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于5%（表6），表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.7 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

圖4 CAV-I 和CAV-II TaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 特異性檢測(cè)結(jié)果

表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

采用已建立的CAV-I 和CAV-IITaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 反應(yīng)體系和循環(huán)條件，對(duì)從人工模型攻毒犬采集到的41 份樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用普通方法進(jìn)行符合率分析。結(jié)果（表7）顯示：普通方法檢出25 份陽(yáng)性，其中CAV-I 型19 份（陽(yáng)性率46.3%），CAV-II 型 6 份（陽(yáng)性率14.6%）；本研究建立方法檢出27 份陽(yáng)性，其中CAV-I 型20 份（陽(yáng)性率48.7 %），CAV-II 型7 份（陽(yáng)性率17.1 %）。兩種方法總符合率為95.12%。

表7 兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

隨著人們生活水平的提高，犬與人類的接觸變得更加頻繁和密切，因此犬健康也得到人們極大重視。CAV 除可感染犬和狐外，還可感染狼、黑熊、臭鼬、豚鼠、大熊貓、銀狐、北銀狐以及虎等[9-11]。普通人群中的CAV 感染抗體陽(yáng)性率較高（35%），獸醫(yī)人員更高（49%）；人感染此病雖不表現(xiàn)癥狀，但存在隱性感染的風(fēng)險(xiǎn)[12]。病犬和帶毒犬是本病主要的傳染源，通常痊愈犬排毒期長(zhǎng)達(dá)180～270 d。本病既可間接傳播，也可垂直傳播，給犬業(yè)發(fā)展以及其他動(dòng)物養(yǎng)殖造成巨大損失。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，我國(guó)研究者已經(jīng)對(duì)犬CAV-I 和CAV-II 病毒進(jìn)行了分離鑒定，并且能夠通過(guò)普通PCR 方法對(duì)該病毒進(jìn)行檢測(cè)，但本研究建立TaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 方法可實(shí)現(xiàn)快速定量檢測(cè)。

臨床樣本檢測(cè)中，TaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，與已知病毒類型相符合，表明建立的TaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 方法可靠性高。與薛向紅等[13]建立的CAV-I 型SYBR Green 方法相比較，二重?zé)晒舛糠椒芡瑫r(shí)檢測(cè)到CAV 的兩種基因型，因而節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間；與Balboni Andrea 等[14]建 立 的CAV I 型 和II 型SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量方法相比較，本試驗(yàn)建立方法更加直觀具體。與普通PCR 方法相比較，本試驗(yàn)建立的TaqMan 雙重?zé)晒舛縋CR 方法不僅省時(shí)、省力，而且可以同時(shí)快速區(qū)分I 型和II 型，這為CAV 感染的檢測(cè)以及流行病學(xué)調(diào)查提供了便捷快速的方法。