楊 穎，楊志芳，才 層，張瑞麗，路鵬霏，賈春麗，李志鵬，毛 睿，張 華，包永星

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，新疆 烏魯木齊 830011

肝細(xì)胞肝癌是一種常見的惡性腫瘤，在全球范圍發(fā)病率居第五位，死亡率居第三位［1］，近年來發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康。肝癌起病隱匿，發(fā)展迅速，大多數(shù)患者確診時已到中晚期［2］，化療是目前中晚期患者主要治療手段。在臨床上順鉑（cisplatin，DDP）是肝癌的化療藥物之一，但由于肝癌細(xì)胞對化療藥物常出現(xiàn)敏感性下降，甚至產(chǎn)生多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）的情況，從而導(dǎo)致治療效果不佳。因此，尋找增強肝癌化療敏感性的方法是一種提高肝癌治療效果的有效途徑。

MicroRNA（miRNA，miR）是一類長約22 nt的單鏈非編碼RNA，可通過調(diào)節(jié)與修飾不同靶點，在腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性方面發(fā)揮重要作用［3-4］。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a-3p在肺鱗癌、結(jié)直腸癌和肝癌等多種腫瘤中低表達(dá)［5-7］，與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。但是，miR-27a-3p的表達(dá)水平與肝癌化療敏感性相關(guān)的報道尚不多見，本研究旨在探索其表達(dá)對肝癌細(xì)胞DDP敏感性的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及細(xì)胞系

人肝癌細(xì)胞系HepG2、PLC購自中國科學(xué)院典藏培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；胎牛血清、OPTI-MEM、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA消化液購自美國Gibco公司；二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自美國Sigma公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；miR-27a-3p相關(guān)質(zhì)粒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PE-AnnexinV凋亡檢測試劑盒、PI/RNase染色液購自美國BD Pharmingen公司；蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測試劑盒購自瑞士Roche公司；PI3K、p-AKT、C-caspase-3和β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)分析

我們使用公開可訪問的TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行TCGA數(shù)據(jù)分析（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）。收集并分析372例肝細(xì)胞肝癌患者的臨床資料，包括年齡、性別、種族、TNM分期、和miR-27a-3p表達(dá)等。通過TCGA數(shù)據(jù)庫對miR-27a-3p進(jìn)行表達(dá)定量。根據(jù)TCGA規(guī)范化協(xié)議，值為上四分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

上述細(xì)胞系均接種于含有10%胎牛血清的高糖DMEM，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中溫育，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染方法，將miR-27a-3p過表達(dá)質(zhì)粒（miR-27a）與陰性對照質(zhì)粒（miR-control）轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG2；將miRinhibitor-27a-3p敲低質(zhì)粒（miR-inhibitor-27a）與陰性對照質(zhì)粒（miR-inhibitor-control）轉(zhuǎn)染PLC細(xì)胞；實驗設(shè)立6組：HepG2過表達(dá)細(xì)胞miR-27a+DDP組，miR-control+DDP組，空白對照組+DDP組；PLC敲低細(xì)胞，miR-inhibitor-27a+DDP組，miR-inhibitor-control+DDP組，空白對照組+DDP組。

1.4 四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測細(xì)胞增殖

將肝癌細(xì)胞HepG2、PLC以4×104個/孔的密度接種到96孔板培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h后加入藥物。實驗組：為不同濃度DDP組（0、3、6、9和12 μg/mL），另設(shè)加藥對照組和空白組，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。加藥后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，于實驗終止前4 h每孔加入10 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀測定各孔波長490 nm處的光密度值（D），計算并繪制藥物劑量-存活率曲線，利用GraphPad PRISM 6.0軟件計算IC50，實驗重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將肝癌細(xì)胞HepG2、PLC以4×104個/孔的密度接種到96孔板培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h后加入DDP（3 μg/mL）。依據(jù)凋亡試劑盒說明書操作，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。實驗重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測

收集細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebuffered saline，PBS）浸洗各組細(xì)胞2次后，于冰上加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解45 min，每隔15 min震蕩1次，后加入一定量的上樣緩沖液。加入一定量的蛋白樣品與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），濕轉(zhuǎn)法移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫溫育封閉2 h，溫育一抗，4 ℃過夜，PBS洗滌3遍，每次15 min。加入對應(yīng)的二抗溫育1 h，再次洗膜后加入熒光發(fā)光液檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-27a-3p在肝癌組織中低表達(dá)

從公開可訪問的TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)miR-27a-3p的表達(dá)量在肝癌組織中明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。提示miR-27a-3p可能是一種抑癌miR。

圖1 miR-27a-3p在肝癌組織與癌旁組織中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of miR-27a-3p in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues

2.2 miR-27a-3p可增強肝癌細(xì)胞對DDP的敏感性

采用MTT 實驗檢測各組細(xì)胞活性，在不同濃度DDP（0、3、6、9和12 μg/mL）作用48 h 后，HepG2 過表達(dá)細(xì)胞中，實驗組miR-27a+DDP 細(xì)胞對DDP 的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（1.02±0.03）μg/mL，明顯低于對照組的I C50（1.27±0.08）μg/m L與空白組的I C50（1.73±0.08）μg/m L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在PLC 敲低細(xì)胞中，實驗組miR-inhibitor-27a+DDP的IC50［（3.87±0.08）μg/m L］較對照組［（2.97±0.08）μg/m L］和空白組［（1.02±0.03）μg/mL］均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），以上空白組與對照組結(jié)果均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示miR-27a-3p可增強肝癌細(xì)胞對DDP的敏感性（圖2）。

圖2 不同濃度順鉑對2株肝癌細(xì)胞活性的抑制率Fig.2 Inhibitory rate of different concentrations of cisplatin on cell activity of hepatocellular carcinoma

2.3 miR-27a-3p可增強DDP促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率，經(jīng)3 μg/mLDDP作用48 h后，在HepG2過表達(dá)細(xì)胞中，實驗組miR-27a+DDP細(xì)胞凋亡率為（31.03±0.20）%，較對照組的（18.51±2.96）%與空白組的（8.73±1.58）%顯著升高（P＜0.05）；在PLC敲低細(xì)胞中，實驗組miRinhibitor-27a+DDP凋亡率（5.57±0.26）%較對照組的（13.58±1.50）%和空白組（12.52±0.70）%均明顯降低（P＜0.05），提示miR-27a-3p可明顯增強DDP促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用（圖3）。

圖3 順鉑對2株肝癌細(xì)胞凋亡率的影響Fig.3 Effect of cisplatin on apoptotic rate of hepatocellular carcinoma cells

2.4 miR-27a-3p可促進(jìn)PI3K/AKT信號通路激活，增強肝癌細(xì)胞化療敏感性

Western blot檢測結(jié)果顯示，3 μg/L DDP作用48 h后，HepG2過表達(dá)細(xì)胞中，PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)量在miR-control組高于miR-27a組，DDP組高于miR-27a+DDP組，而miR-27a組C-caspase-3表達(dá)量較miR-control組升高，miR-27a+DDP組較DDP組升高（P＜0.05）；在PLC敲低細(xì)胞中，PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)量在DDP組中低于miR-inhibitor-27a+DDP組，在miR-inhibitorcontrol組低于miR-inhibitor-27a組（P＜0.05），而C-caspase-3表達(dá)量在DDP組較miR-inhibitor-27a+DDP組升高，在miR-inhibitor-control組較miR-inhibitor-27a組升高（P＜0.05）。這說明DDP作用于肝癌細(xì)胞后，PI3K/AKT/caspase-3通路處于激活狀態(tài)，可提高細(xì)胞凋亡率，而miR-27a-3p可增強這種效果（圖4）。

圖4 Western blot檢測順鉑作用后2株肝癌細(xì)胞PI3K/AKT信號通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of proteins involved in PI3K/AKT signaling pathway of hepatocellular carcinoma cells treated with cisplatin detected by Western blot

3 討 論

肝癌已成為我國惡性腫瘤中的第二號殺手［8］，因其早期缺乏特異性癥狀和有效的篩查方法，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，錯過了外科手術(shù)的最佳時機，而相關(guān)輔助治療的效果也十分有限［9-10］。雖然近年來肝癌的治療方案不斷更新和改進(jìn)，但由于在腫瘤治療過程中化療藥物的耐藥性在臨床上普遍存在，導(dǎo)致化療效果欠佳。近年來，隨著生物分子機制的研究不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)miR作為一類長19～22 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，可以通過與靶基因特定區(qū)域互補配對結(jié)合，干預(yù)靶基因在轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［11］。也有研究報道，miR作為一種重要的靶基因修飾因子，對調(diào)節(jié)腫瘤的生長、侵襲和化療耐藥性有不可或缺的作用［12］。因此，探討miR對增強肝癌化療敏感性的作用和調(diào)節(jié)機制，為提高肝癌化療效果奠定了一定實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

DDP屬于細(xì)胞周期的非特異性藥物，可抑制癌細(xì)胞DNA復(fù)制過程，并損傷其細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)，是一類較強的廣譜抗癌藥物，但在臨床治療中常容易發(fā)生腫瘤耐藥，從而降低療效［13］。Chen等［14］發(fā)現(xiàn)，miR-27a可以作為一種新的調(diào)節(jié)因子，通過抑制FZD7/β-catenin信號通路來逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞中的獲得性多藥耐藥。Zhang等［15］發(fā)現(xiàn)miR-27a通過促進(jìn)Apaf-1-caspase-9復(fù)合體的形成，增強大腸癌干細(xì)胞對腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）的敏感性，從而改善大腸癌干細(xì)胞對TRAIL的化療抵抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a-3p在肝癌組織中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織，這與Li等［16］的研究報道一致。MTT結(jié)果顯示，在HepG2過表達(dá)細(xì)胞中，不同濃度DDP作用48 h后，與對照組和空白組相比，實驗組miR-27a+DDP細(xì)胞對DDP的半數(shù)抑制濃度（IC50）明顯降低，而PLC敲低細(xì)胞的結(jié)果相反，表明miR-27a-3p可增強DDP抑制肝癌細(xì)胞增殖的能力。值得關(guān)注的是，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，HepG2過表達(dá)細(xì)胞經(jīng)3 μg/mLDDP作用48 h后，實驗組miR-27a+DDP細(xì)胞凋亡率明顯升高，而將PLC敲低凋亡率卻降低，結(jié)果表明miR-27a-3p可增強DDP促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡作用。上述結(jié)果與Chen等［14］的研究發(fā)現(xiàn)相似，即miR-27a-3p可能逆轉(zhuǎn)化療的多藥耐藥性，改善肝癌的化療敏感性，提高化療效果。以上結(jié)果提示，miR-27a-3p可能改善肝癌細(xì)胞株對DDP的敏感性。

PI3K/AKT信號級聯(lián)放大反應(yīng)是非常重要的細(xì)胞內(nèi)通路，經(jīng)常在多種腫瘤中激活［17］，最近的研究表明，PI3K/AKT通路在化療耐藥產(chǎn)生過程中起著重要的作用［18］。Zhang等［19］發(fā)現(xiàn)使用PI3K抑制劑LY294002阻斷PI3K/AKT信號通路可以逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的EMT及耐藥，說明在肝癌化療耐藥機制中，PI3K/AKT通路激活是獲得性耐藥的重要途徑。而caspase-3是一種影響細(xì)胞凋亡的蛋白，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。為探究miR-27a-3p是否可通過激活PI3K/AKT信號通路影響肝癌細(xì)胞凋亡。我們采用Western blot檢測各組細(xì)胞PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白及凋亡蛋白C-caspase-3的表達(dá)量。結(jié)果顯示，經(jīng)3 μg/mL DDP作用48 h后，在HepG2過表達(dá)細(xì)胞中，PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)量在miR-control組、miR-27a組、DDP組和miR-27a+DDP組細(xì)胞中依次降低，而C-caspase-3表達(dá)量則依次升高，在PLC敲低細(xì)胞中趨勢完全相反，表明miR-27a-3p有通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡進(jìn)而改善DDP化療敏感性的可能性。

綜上所述，本研究證明miR-27a-3p可調(diào)控PI3K/AKT通路介導(dǎo)在DDP化療敏感性中的作用，這將為增強DDP化療敏感性提供新的思路。