張慧儉，劉佃溫，周曉麗，劉永剛，李 敏，劉世舉

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院肛腸外科，河南 鄭州450000；3.河南省腫瘤醫(yī)院普外科，河南 鄭州 450000

目前結(jié)直腸癌在中國(guó)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，每年新發(fā)病例為37.5萬，死亡病例為19.1萬［1］。近年來，結(jié)直腸癌靶向治療領(lǐng)域進(jìn)展迅速，不同作用靶點(diǎn)的藥物給結(jié)直腸癌患者帶來了不同的治療選擇。在抗表皮生長(zhǎng)因子受體方面，西妥昔單抗顯著降低患者進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)［2］。在抗血管新生方面，貝伐珠單抗和瑞戈非尼的上市為患者帶了進(jìn)一步的生存獲益［3］。在免疫治療方面，派姆單抗為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定的患者帶來新的治療選擇［4］。在輔助化療方面，基于對(duì)IDEA研究的結(jié)果，低危的Ⅲ期結(jié)腸癌推薦3個(gè)月的XELOX輔助化療方案［5］。這些不同的靶向藥物和治療模式都為患者帶來了顯著的生存獲益。

卡培他濱為基礎(chǔ)的輔助化療方案經(jīng)過研究證實(shí)可顯著降低結(jié)直腸癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［6］。然而，尚有很多影響該方案療效的因素。近年來免疫檢查點(diǎn)抑制劑成為腫瘤領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，尤其是2018年，納武單抗在中國(guó)的上市給晚期非小細(xì)胞肺癌患者帶來新的治療希望［7］。程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）是近年來最熱門的分子，已成為目前免疫治療藥物的重要靶點(diǎn)［8］。該基因編碼的蛋白主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面，通過和激活的T細(xì)胞表面的PD-L1的結(jié)合后，抑制T細(xì)胞活性，引起T細(xì)胞凋亡，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸［9］。先前的研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞中PD-L1均高表達(dá)，但是PD-L1的表達(dá)和患者的預(yù)后關(guān)系目前結(jié)論尚不統(tǒng)一［10］。

PD-L1基因位于染色體9p24.1，包含8個(gè)外顯子。作為程序性死亡配體家族中的一員，PD-L1在不同腫瘤患者中的表達(dá)也會(huì)呈現(xiàn)較大的個(gè)體差異［11］。Xie等［12］的研究探討了在肝癌患者當(dāng)中，PD-L1基因遺傳變異位點(diǎn)rs2297136的臨床意義。研究結(jié)果提示，在肝癌患者中PD-L1基因的多態(tài)性位點(diǎn)與肝癌的易感性及預(yù)后均顯著相關(guān)。然而，目前在結(jié)直腸癌輔助化療領(lǐng)域，尚未見PD-L1基因遺傳變異和預(yù)后的關(guān)聯(lián)研究。

因此，本研究旨在評(píng)估PD-L1基因rs2297136位點(diǎn)對(duì)接受卡培他濱為基礎(chǔ)輔助化療的結(jié)直腸癌患者的無病生存期（disease-free survival，DFS）和總生存期（overall survival，OS）的影響，并探討該位點(diǎn)對(duì)結(jié)直腸癌組織中PD-L1基因mRNA表達(dá)水平的影響。

1 資料和方法

1.1 研究設(shè)計(jì)及入組患者基線臨床資料

研究設(shè)計(jì)為回顧性分析，納入2010年1月—2017年12月在河南省腫瘤醫(yī)院普外科和河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院肛腸外科納入接受手術(shù)切除治療的結(jié)直腸癌患者。具體的入組標(biāo)準(zhǔn)包括：①年齡：18～80歲，美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Oncology Cooperative Group，ECOG）評(píng)分在0～2分，心功能正常（左心室射血分?jǐn)?shù)＞50%），腎功能正常（肌酐≤1.5×ULN），骨髓功能正常（中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)≥1.5×109/L，血小板計(jì)數(shù)≥100×109/L，血紅蛋白≥9 g/dL）；②病理學(xué)診斷為結(jié)直腸癌患者且接受了手術(shù)切除治療；③預(yù)期壽命至少3個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)為：①?zèng)]有接受卡培他濱為基礎(chǔ)輔助化療的患者；②沒有合適標(biāo)本檢測(cè)PD-L1基因遺傳變異的患者；③家族性腺瘤性息肉病，其他遺傳性結(jié)直腸癌綜合征；④直腸癌患者后期接受放療的患者；⑤失訪的患者。最終，符合入排標(biāo)準(zhǔn)并納入本研究的患者為213例。

接受卡培他濱為基礎(chǔ)的輔助化療，具體用法用量為：術(shù)后3～4周，卡培他濱，1 000 mg/m2，每天2次，第1～14天，每21 d為1個(gè)周期。奧沙利鉑，130 mg/m2，靜脈滴注，第1天。輔助化療結(jié)合患者情況6～8個(gè)周期。根據(jù)治療過程中出現(xiàn)的血液學(xué)或非血液學(xué)毒性調(diào)整相應(yīng)的給藥劑量，一旦發(fā)生可能威脅生命的毒性反應(yīng)時(shí)治療中止。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 血液樣本收集DNA提取及基因分型

每位入組研究的患者在接受輔助化療之前收集患者的外周血樣本大約4 mL，用苯酚氯仿法提取基因組DNA，之后于-20 ℃保存。設(shè)計(jì)rs2297136位點(diǎn)的上下游PCR引物，對(duì)該位點(diǎn)及附近的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物為：5’-GCTCCCTGTTTGACTCCATC-3’，下游引物為：5’-TTTTTCCCCAGACCACTTCC-3’，產(chǎn)物片段為274 bp，用TaqⅠ內(nèi)切酶通過限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。通過條帶大小判斷該位點(diǎn)的基因型。TT型1條條帶：1條274 bp條帶。TC型3條條帶：1條274 bp條帶，1條105 bp條帶，1條169 bp條帶。CC型2條條帶：1條105 bp條帶，1條169 bp條帶。部分樣本的分型結(jié)果通過直接測(cè)序的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 組織樣本收集及PD-L1基因mRNA表達(dá)分析

納入研究的部分患者在手術(shù)過程中收集每個(gè)患者被切除的結(jié)直腸癌癌組織標(biāo)本，最終納入79例癌組織標(biāo)本，液氮保存。之后用TRIzol試劑進(jìn)行RNA提取，采用羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司real-time PCR儀進(jìn)行PD-L1基因mRNA表達(dá)分析，PD-L1基因的上游引物為：5’-CTTCCCGAGGCTCCGCACCA-3’，下游引物為：5’-GCCCCGATGAACCCCTAAAC-3’。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）反應(yīng)體系如下：SYBN Premix Ex Tag 溶液10 μL，PD-L1基因上游引物（20 μmol/L）0.2 μL，PD-L1基因下游引物（20 μmol/L）0.2 μL，ddH2O 7.6 μL，cDNA2 μL，反應(yīng)體系總計(jì)20 μL，GAPDH mRNA 表達(dá)用作內(nèi)參。PD-L1基因mRNA 用相對(duì)定量法2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究當(dāng)中所有的變量均采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行（19.0版本）相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析。χ2檢驗(yàn)分析多態(tài)性位點(diǎn)基因分型是否符合哈迪溫伯格平衡。在基線臨床資料當(dāng)中，離散型的變量和rs2297136位點(diǎn)不同基因型的分布采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)數(shù)據(jù)較少時(shí)用Fisher精確檢驗(yàn)。連續(xù)型的變量和rs2297136位點(diǎn)不同基因型的分析采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。

通過Stata繪制Kaplan-Meier曲線比較不同基因型患者DFS和OS的差異，曲線間的差異用對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。DFS為從手術(shù)日至疾病進(jìn)展或任何原因?qū)е碌乃劳觯ㄒ韵劝l(fā)生的計(jì)算），OS為從手術(shù)日至任何原因?qū)е碌乃劳?，未出現(xiàn)進(jìn)展死亡的，截至末次隨訪記錄。多變量分析時(shí)，對(duì)DFS構(gòu)建采用COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組患者基線臨床資料

本研究入組的213例結(jié)直腸癌患者的基線臨床資料如表1所示，納入研究患者的中位年齡49歲，范圍為18～80歲。男性患者122例（57.28%）。ECOG評(píng)分中0分患者151例（70.89%）。結(jié)腸癌和直腸癌分別130和83例。腫瘤分化方面，高中低分化患者分別為45、145和16例。腫瘤分期上，Ⅱ期患者45例，Ⅲ期患者168例。錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）基因狀態(tài)上，錯(cuò)配修復(fù)基因缺失（deficient mismatch repair，dMMR）患者12例，錯(cuò)配修復(fù)基因存在（proficient mismatch repair，pMMR）患者135例，無法評(píng)價(jià)患者66例。輔助化療方面，接受卡培他濱單藥輔助化療患者52例，接受卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑輔助化療患者161例。

表1 213例結(jié)直腸癌患者的基線臨床資料及rs2297136位點(diǎn)基因型分布比較Tab.1 Comparison of baseline characteristics of 213 colorectal cancer patients according to rs2297136 genotype status

Rs2297136位點(diǎn)的基因分型結(jié)果為：野生TT型148例（69.48%），TC型59例（27.70%），CC型6例（2.82%），最小等位基因頻率為0.17，3種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.967）。后期分析中把TC和CC基因型患者合并。該位點(diǎn)不同基因型患者在基線臨床資料中的分布基本均衡（表2）。

表2 構(gòu)建的影響總生存期的基線臨床資料和多態(tài)性位點(diǎn)的單因素分析Tab.2 Univariate analysis for OS according to other characteristics and polymorphism

2.2 PD-L1基因rs2297136位點(diǎn)對(duì)預(yù)后的影響

本研究最后一次隨訪時(shí)間為2018年6月，所有患者從納入研究到最后一次隨訪的中位隨訪時(shí)間為65.4個(gè)月（隨訪時(shí)間7.2～90.0個(gè)月）。

納入研究的213例患者均按時(shí)復(fù)查評(píng)估，整體人群的中位DFS為4.6年（95% CI:3.83～5.35），中位OS為6.5年（95% CI：5.74～7.27）。

將TC和CC基因型患者合并后，共計(jì)65例。在針對(duì)DFS的單變量分析中，野生型TT基因型患者和TC/CC基因型患者在DFS上明顯不同，TT和TC/CC基因型患者的中位DFS分別為4.7和3.3年，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，圖1）。

在OS方面，兩種基因型患者的中位OS分別為6.5和4.7年，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖2）。

圖1 PD-L1基因rs2297136位點(diǎn)不同基因型的213例結(jié)直腸癌患者的DFS曲線對(duì)比Fig.1 DFS of the 213 colorectal cancer patients according to PD-L1 rs2297136 genotype status

圖2 PD-L1基因rs2297136位點(diǎn)不同基因型的213例結(jié)直腸癌患者的OS曲線對(duì)比Fig.2 OS of the 213 colorectal cancer patients according to PD-L1 rs2297136 genotype status

為了進(jìn)一步校正其他混雜因素的影響，本研究構(gòu)建了COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型，先進(jìn)行了單因素分析。多變量分析時(shí)將單變量分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的風(fēng)險(xiǎn)因素如年齡、ECOG評(píng)分、病理學(xué)分期及rs2297136位點(diǎn)納入該模型。經(jīng)過多變量校正rs2297136位點(diǎn)對(duì)OS獨(dú)立的影響意義依然存在，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=1.89，P=0.006），其他的在COX模型當(dāng)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量為年齡（OR=1.42，P=0.015）、ECOG評(píng)分（OR=2.21，P=0.005）和腫瘤分期（OR=2.98，P＜0.001，表3）。

2.3 PD-L1基因rs2297136位點(diǎn)對(duì)PD-L1基因mRNA表達(dá)的影響

本研究收集了79例術(shù)后切除的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本并納入表達(dá)分析。通過提取的RNA對(duì)PD-L1基因的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行探討，并與rs2297136位點(diǎn)的基因型進(jìn)行相關(guān)性分析。首先對(duì)79例癌組織標(biāo)本進(jìn)行了rs2297136位點(diǎn)的基因分型，其中TT型55例，TC型21例，CC型3例，3種基因型分布頻率同樣符合哈迪溫伯格平衡（P=0.582）。TT型患者相對(duì)較少，同樣將TT型和CC型患者合并，共計(jì)24例。Rs2297136位點(diǎn)不同基因型患者的PD-L1基因mRNA表達(dá)如圖3所示，TC/CC型患者相對(duì)于野生型TT基因型患者，癌組織中PD-L1基因mRNA表達(dá)水平明顯較高（4.08±1.21vs2.67±1.88），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

表3 對(duì)OS構(gòu)建校正其他變量的多變量Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型Tab.3 Multivariate COX regression analysis for OS according to other characteristics

圖3 PD-L1基因rs2297136位點(diǎn)不同基因型PD-L1基因mRNA表達(dá)情況對(duì)比Fig.3 Relative expression level of PD-L1 gene mRNA according to PD-L1 rs2297136 status

3 討 論

本研究納入了213例經(jīng)過手術(shù)切除的結(jié)直腸癌患者，通過對(duì)PD-L1基因rs2297136位點(diǎn)基因分型并和患者的預(yù)后進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)攜帶C等位基因的TC/CC基因型患者相對(duì)于野生型TT型患者來說具有顯著較差的DFS和OS，并通過79例癌組織標(biāo)本的PD-L1基因mRNA表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)了該位點(diǎn)不同的基因型患者的mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)較大的差異。rs2297136位點(diǎn)可能通過影響PD-L1基因的mRNA表達(dá)進(jìn)而改變接受卡培他濱為基礎(chǔ)輔助化療治療的結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。

結(jié)直腸癌是異質(zhì)性較強(qiáng)的惡性腫瘤，在臨床治療效果和預(yù)后上也有較大的個(gè)體差異［13］。目前已經(jīng)有較多的可以預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌療效的生物標(biāo)志物的研究成果：2018年報(bào)道的胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TYMP）基因多態(tài)性對(duì)接受卡培他濱輔助化療的結(jié)直腸癌患者療效影響［14］；2017年報(bào)道的亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）多態(tài)性對(duì)氟尿嘧啶療效的影響［15］；2016年報(bào)道的胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）多態(tài)性對(duì)結(jié)腸癌一線5-FU放療效果的影響［16］。這些研究結(jié)果都提示了藥物基因組學(xué)在結(jié)直腸癌療效預(yù)測(cè)方面的價(jià)值。

本研究在中國(guó)首次報(bào)道了結(jié)直腸癌患者接受卡培他濱為基礎(chǔ)的輔助化療方案時(shí)，PD-L1基因rs2297136位點(diǎn)的C等位基因攜帶者可能通過影響該基因的表達(dá)，從而改變接受卡培他濱為基礎(chǔ)輔助化療的結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。首先，本研究中rs2297136位點(diǎn)的最小等位基因頻率為0.17，這和美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中中國(guó)人群中的突變頻率一致，另外也與之前Xie等［12］的研究中rs2297136位點(diǎn)的分布頻率基本一致。Xie等［12］的研究納入225例肝癌患者和200位健康志愿者，通過對(duì)PD-L1基因上4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs2297136位點(diǎn)CC基因型與肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。另外，在該位點(diǎn)和肝癌患者預(yù)后分析方面，Xie等［12］的研究和本研究結(jié)果也基本一致。他們的研究結(jié)果也表明，rs2297136位點(diǎn)較少等位基因攜帶患者的預(yù)后較差。然而，他們的研究并沒有深入探討該位點(diǎn)和PD-L1基因表達(dá)方面的關(guān)聯(lián)性。另外，Du等［17］的研究探討了位于PD-L1基因的3’-UTR區(qū)域的多態(tài)性rs2297136位點(diǎn)對(duì)非小細(xì)胞肺癌的易感性的影響，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，rs2297136位點(diǎn)通過擾亂miR-296-5p、miR-138及PD-L1基因mRNA從而可影響非小細(xì)胞肺癌的易感性。他們研究的rs2297136位點(diǎn)的分布頻率與本研究不太一致，可能是納入研究的癌種差異，這在Xie等［12］納入的肝癌患者的研究中也初步提示有類似趨勢(shì)。然而Du等［17］的研究并沒有繼續(xù)探討rs2297136位點(diǎn)不同基因型患者的PD-L1基因表達(dá)情況。

另一方面，PD-L1是目前腫瘤免疫治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)基因，多項(xiàng)免疫治療的臨床研究結(jié)果顯示，PD-L1的表達(dá)水平可以預(yù)測(cè)PD-1和PD-L1抑制劑的療效［18］。然而，在PD-L1基因表達(dá)水平和接受常規(guī)化療的結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)上，目前尚存在較大的爭(zhēng)議。本研究結(jié)果初步表明PD-L1基因mRNA高表達(dá)的人群在接受卡培他濱輔助化療時(shí)具有較差的預(yù)后，這與之前Enkhbat等［19］的研究結(jié)果是一致的。他們的研究納入了116例手術(shù)切除的Ⅱ期和Ⅲ期的結(jié)直腸癌患者，分析了PD-1和PD-L1表達(dá)水平的相關(guān)性以及和預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PD-L1高表達(dá)的人群預(yù)后較差。然而，另一方面也有很多研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD-L1基因編碼的蛋白主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面，通過和激活的T細(xì)胞表面的PD-1的結(jié)合后，抑制T細(xì)胞活性，引起T細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)的作用還有一些尚不清楚。然而，也有部分臨床研究的結(jié)果表明PD-L1高表達(dá)人群患者的預(yù)后較好［20］。這些結(jié)果可能和納入研究樣本的異質(zhì)性，接受輔助化療等情況相關(guān)，總之還需要進(jìn)一步的深入研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了在中國(guó)結(jié)直腸癌人群當(dāng)中PD-L1基因rs2297136位點(diǎn)是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后影響因素。當(dāng)然，本研究也有部分局限性，首先納入研究的樣本量不大，沒有在大樣本當(dāng)中評(píng)估該位點(diǎn)的預(yù)后指導(dǎo)意義。另外，研究為回顧性分析，有一些偏倚無法避免。不過本研究還是比較充分地對(duì)rs2297136位點(diǎn)的預(yù)后影響意義進(jìn)行了評(píng)估，同時(shí)也從PD-L1基因mRNA表達(dá)層面去揭示了該位點(diǎn)造成預(yù)后差異的部分原因，對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的指導(dǎo)具有臨床指導(dǎo)意義。