楊皓然 ，楊新美，劉愛芹 ，劉 波 *，姚慶強(qiáng) *

（1.濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，國家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省罕少見病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250062；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（山東省千佛山醫(yī)院） 藥學(xué)部，山東 濟(jì)南 250014）

細(xì)胞內(nèi)鞘脂代謝產(chǎn)物如神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer），鞘氨醇（sphingosine，Sp）和鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）（見圖1），是重要的信號(hào)分子[1]，在調(diào)控細(xì)胞增殖、存活、遷移、分化及程序性凋亡等生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。Cer和Sp是細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控因子，能抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而S1P則是重要的存活因子（survival factor），能促進(jìn)細(xì)胞生長、抑制細(xì)胞凋亡[2]。細(xì)胞內(nèi)Cer，Sp和S1P通過主要由鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SphK1）參與的酶促反應(yīng)維持動(dòng)態(tài)平衡。已有研究表明，SphK1的異常與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，包括鐮狀細(xì)胞病[3]、癌癥[4]、動(dòng)脈粥樣硬化[5]、哮喘[6]等。近年，SphK1在癌癥發(fā)生和發(fā)展中的重要作用被逐漸揭示，針對(duì)SphK1靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)、開發(fā)也成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[7]。本文就SphK1的結(jié)構(gòu)、功能及在研SphK1拮抗劑進(jìn)行綜述，期望為新型SphK1拮抗劑的研究開發(fā)提供參考。

圖1 Cer（1），Sp（2）和S1P（3）的結(jié)構(gòu)

1 SphK1及其促進(jìn)細(xì)胞增殖機(jī)制

SphK是一種高度保守的ATP依賴脂質(zhì)激酶，由Olivera等于1998年首次從大鼠腎臟細(xì)胞中提取[8]。目前，在哺乳動(dòng)物組織中發(fā)現(xiàn)有SphK1和SphK2兩種亞型，其在酵母和植物中也均有表達(dá)[9-10]。人的SphK1基因位于17號(hào)染色體（17q25.2）上，相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為42×103，主要分布于腦、心、脾、肺、腎及胸腺細(xì)胞中。SphK2基因位于19號(hào)染色體（19q13.2），SphK2比SphK1多200個(gè)氨基酸，Mr為63×103，主要分布于腎臟和肝臟肝細(xì)胞中[11]。SphK1和SphK2都有C1～C5共5個(gè)保守序列，具有高度同源性，在N端和C端分別有47 %和43 %的序列完全相同[12]。SphK1的主要功能是磷酸化Sp生成S1P，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成，抑制凋亡。SphK2 的具體作用還不十分明確，通過RNAi技術(shù)干擾HEK293細(xì)胞的SphK2，能阻斷血清撤離或藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[13]，但近期也有研究發(fā)現(xiàn)，選擇性抑制SphK2的活性對(duì)肝癌[14]、多發(fā)性骨髓瘤[15]等多種癌癥有一定的治療作用，由于其作用機(jī)制的復(fù)雜性，針對(duì) SphK2的拮抗劑還在研究中。

2013 年，人類SphK1晶體結(jié)構(gòu)被解析出來，為基于靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)的合理藥物設(shè)計(jì)提供了有力的科學(xué)依據(jù)[16]。人類SphK1（見圖2）是含有384個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，包含9個(gè)α螺旋，17個(gè)β折疊和1個(gè)310螺旋。SphK1可分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中，N-末端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD）含6個(gè)α螺旋（α1～ α6）和6個(gè)β折疊（β1～β5，β17）。NTD的中心部位是4個(gè)平行β-折疊（β2，β1，β3，β4）和2個(gè)反平行β-折疊（β5，β17），β-折疊的兩側(cè)分別被α2，α3，α4和α1，α5，α6包圍。C-末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）是底物結(jié)合域，含有3個(gè)α螺旋（α7～α9），1個(gè)310-α螺旋和11個(gè)β折疊（β6-β16）。CTD中心部位的5個(gè)反平行β折疊（β7，β6，β16，β13，β9）位于CTD背面，另外6個(gè)反平行β折疊（β15，β14，β8，β10，β11，β12）位于CTD的前面，3個(gè)α螺旋（α7～α9），310-α螺旋和1個(gè)長的卷曲環(huán)區(qū)（coiled loop）分別位于11個(gè)β折疊的前面和背面，因此SphK1的配體結(jié)合域整體上呈一個(gè)“J形”口袋（見圖2）。

圖2 SphK1的結(jié)構(gòu)和“J形”疏水口袋

人體內(nèi)鞘磷脂（sphingomyelin）的代謝途徑為：細(xì)胞膜外的鞘磷脂（sphingomyelin）通過水解反應(yīng)轉(zhuǎn)化為Cer，然后Cer通過去酰化作用生成Sp，最后SphK1磷酸化Sp生成S1P。游離S1P可快速被S1P磷酸酶（S1P-phosphatase，SPP）降解成Sp或被S1P裂解酶（S1P lyase）不可逆地降解為軟脂醛（palmitaldehyde）和磷酸膽堿（phosphoryl choline）。目前的研究認(rèn)為S1P發(fā)揮生物學(xué)功能主要通過兩種方式，一種為行使細(xì)胞外第一信使功能，即S1P以自分泌或旁分泌的方式分泌到細(xì)胞外，與G蛋白偶聯(lián)受體上的相應(yīng)S1P受體（S1P receptor，S1PR）結(jié)合產(chǎn)生“由內(nèi)而外”的信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)功能[17-18]。另一種為行使細(xì)胞內(nèi)第二信使功能，即胞內(nèi)S1P直接作用于細(xì)胞內(nèi)的不同蛋白靶點(diǎn)介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)[19-20]（見圖3）。

2 SphK1拮抗劑

圖3 Sphk1-S1P-S1PR信號(hào)通路

SphK1小分子拮抗劑的開發(fā)研究始于2003年[19]，其作用機(jī)制多數(shù)是通過與SphK1的“J形”口袋結(jié)合來調(diào)節(jié)SphK1的功能[7]。目前在研的SphK1拮抗劑根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為鞘氨醇類和非脂質(zhì)類。近年，一些天然產(chǎn)物也被發(fā)現(xiàn)具有抑制SphK1的作用。本文總結(jié)了近年具有代表性的SphK1拮抗劑，并將各拮抗劑匯總見表1。

表1 SphK1拮抗劑匯總

注：ND：未測(cè)定

2.1 鞘氨醇類SphK1拮抗劑

鞘氨醇類SphK1拮抗劑可看作是Sp的衍生物或類似物。該類拮抗劑主要針對(duì)Sp的極性頭部、連接鏈、疏水尾部3部分進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾、改造（見圖4）。

圖4 鞘氨醇結(jié)構(gòu)及其關(guān)鍵化學(xué)區(qū)域

SK1-I（BML-258）是同時(shí)對(duì)Sp 的疏水尾部和連接鏈進(jìn)行改造而得到的化合物，也是第一個(gè)水溶性選擇性SphK1拮抗劑。與通常在聚乙二醇或DMSO中遞送的其他鞘氨醇類拮抗劑不同，SK1-I具有優(yōu)異的溶解性，可以鹽水溶液的形式給藥[7]。SK1-I能選擇性抑制SphK1的活性，對(duì)SphK2及其他激酶無抑制作用[21]。Sk1-I在白血病和U937細(xì)胞中可通過影響細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）和Akt信號(hào)來有效抑制腫瘤生長[21]，在乳腺癌細(xì)胞中，Sk1-I可降低胞內(nèi)S1P水平，也發(fā)揮出一定的抗增殖活性[22]。最近也有研究表明Sk1-I能通過提高抑癌蛋白TP53的活性而調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡[23]。

Sp的極性頭部OH部分能被SphK1磷酸化后發(fā)揮信使作用，因此去除OH可能獲得活性較好的SphK1拮抗劑，基于該思路得到了化合物Enigmol[24]。Enigmol不能被SphK1磷酸化，且對(duì)多種癌細(xì)胞表現(xiàn)出有效的抗癌活性，在小鼠結(jié)腸癌和前列腺癌的異種移植瘤模型中，口服給予Enigmol對(duì)兩種癌細(xì)胞均顯示出顯著的生長抑制[25]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)Enigmol進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化后得到的化合物對(duì)多種癌細(xì)胞也具有良好的抗增殖活性[24]。于Enigmol的長鏈?zhǔn)杷膊恳雰蓚€(gè)氟原子，得到CF2-Enigmol，其在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中除了在抗增殖方面較親代具有更好的效果，其在肺、腦和腎中具有較高的血藥濃度，因此對(duì)于治療肺、腦、腎組織中的實(shí)體瘤具有重要的意義[26]。

對(duì)Sp的連接鏈的氨基部分進(jìn)行改造，分別得到化合物Dimethylsphingosine（DMS）和LCL351。DMS是SphK1、SphK2的共同拮抗劑，對(duì)蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），神經(jīng)酰胺激酶 （ceramide kinase，CK）和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）等多種重要蛋白激酶都具有抑制作用，選擇性較低。DMS在多種癌細(xì)胞中均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]，但也已被證實(shí)在較低濃時(shí)反而會(huì)增強(qiáng)SphK1的活性[28]，另外，紅細(xì)胞溶血和肝毒性等副作用也限制了其在臨床上的應(yīng)用[29]。LCL351是選擇性的SphK1拮抗劑，在炎癥性腸病的小鼠模型中，LCL351可選擇性地抑制SphK1的活性而減少炎癥物的產(chǎn)生，且在體內(nèi)未見任何不良反應(yīng)[30]。但作為抗腫瘤藥，LCL351在體內(nèi)生物利用度不高，藥理活性也并不理想[31]。

Safingol可看作是Sp的疏水尾部雙鍵還原后得到的化合物，也能同時(shí)抑制SphK2、PKC和CK等激酶的活性，選擇性較低[29]。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，Safingol通過引起細(xì)胞自噬抑制癌細(xì)胞增殖[32]，對(duì)患有晚期實(shí)體瘤的患者進(jìn)行的I期臨床試驗(yàn)表明，Safingol可安全地與順鉑聯(lián)合給藥，僅顯示出可逆的劑量依賴性肝毒性[33]。

近年，基于計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)和構(gòu)效關(guān)系研究設(shè)計(jì)合成的SphK1拮抗劑也在蓬勃發(fā)展。為了獲得選擇性更高的化合物，在Sp的基本骨架上引入脒基，由此得到了一系列脒類化合物，該類化合物對(duì)SphK1的選擇性高于SphK2，并且對(duì)人PKC等多種激酶均無抑制作用[34]。VPC96091在納摩爾濃度下即可顯著降低U937細(xì)胞胞內(nèi)S1P的水平，升高Sp和Cer水平，但僅在較高濃度（10 μmol/L） 時(shí)才會(huì)對(duì)該細(xì)胞中的ERK和Akt信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生影響[7]，抗增殖作用并不理想。在脒基的基礎(chǔ)上，繼續(xù)引入其他官能團(tuán)如噁唑，得到化合物11g，該化合物對(duì)于SphK1的選擇性是SphK2的705倍，是目前已知的選擇性最好的拮抗劑[35]。雖然該類化合物的選擇性和活性都很出色，但普遍存在體內(nèi)代謝穩(wěn)定性差，半衰期較短的缺點(diǎn)[34-35]，且該類化合物的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)還有待進(jìn)一步研究[36]?；跇?gòu)效關(guān)系研究設(shè)計(jì)合成的化合物RB-005在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中可降低SphK1基因的表達(dá)，同時(shí)可誘導(dǎo)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中SphK1蛋白酶體降解，可作為SphK1拮抗劑研發(fā)的理想先導(dǎo)物[37]。

2.2 非脂質(zhì)類SphK1拮抗劑

SKI-II是一類最早發(fā)現(xiàn)的非脂質(zhì)類拮抗劑，對(duì)SphK1、SphK2都具有抑制活性，對(duì)PKC，ERK和PI3K等激酶無抑制作用，并能通過降低細(xì)胞內(nèi)S1P的水平，升高Cer和Sp的水平，誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡[38-39]，此外，SKI-II還被證實(shí)可增強(qiáng)多柔比星等幾種抗癌藥物對(duì)癌細(xì)胞的作用效果[40-41]，用SKI-II處理細(xì)胞也引起SphK1蛋白酶體降解，這有助于增強(qiáng)SKI-II降低細(xì)胞內(nèi)S1P的能力[42]。在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中，SKI-II有良好的口服生物利用度，但“脫靶”（off-target）效應(yīng)限制了其在臨床中的應(yīng)用[43]。

美國的安進(jìn)（Amgen）公司基于構(gòu)效關(guān)系研究將SKI-II和Sp 的骨架進(jìn)行拼接，開發(fā)了一系列高效的鞘氨醇激酶拮抗劑，代表化合物為化合物23，該化合物具有良好的物理化學(xué)和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然該化合物可有效抑制SphK1的活性，但并不能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，更深層的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究[44]。

SKI-178是對(duì)SKI-II的同系化合物SKI-I進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而產(chǎn)生的，對(duì)SphK1、SphK2都具有抑制活性。SKI-178在較低濃度時(shí)即可誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡[45]，目前還沒有證據(jù)表明SKI-178會(huì)對(duì)PKC等蛋白激酶產(chǎn)生抑制作用。HL-60細(xì)胞中，SKI-178可加速促存活因子Bcl-2，Bcl-xl 和 Mcl-1的降解而發(fā)揮抗增殖作用[45]。AML細(xì)胞中，SKI-178除抑制SphK，還可破環(huán)細(xì)胞中的微管網(wǎng)絡(luò)，從而誘導(dǎo)AML細(xì)胞的凋亡[46]。SKI-178在AML小鼠模型中具有良好的耐受性，安全有效，可作為多靶點(diǎn)抗癌治療劑進(jìn)一步發(fā)展[46]。

PF-543是高選擇性的SphK1拮抗劑，對(duì)SphK1的選擇性是SphK2的130倍，與RB-005和SKI-II一樣，PF-543在發(fā)揮抑制作用的同時(shí)，也同時(shí)誘導(dǎo)SphK1蛋白酶體降解[47]。PF-543對(duì)原發(fā)性結(jié)直腸癌細(xì)胞具有抗增殖和細(xì)胞毒活性[48]。長時(shí)間較高劑量下PF-543可通過引起細(xì)胞自噬來誘導(dǎo)頭頸部鱗狀癌細(xì)胞的凋亡[49]。PF-543在鐮狀細(xì)胞性貧血小鼠模型中有效阻斷鐮狀細(xì)胞、溶血和炎癥的產(chǎn)生，并在小鼠肺動(dòng)脈高壓低氧模型中對(duì)心臟具有一定的保護(hù)作用[50]。除了發(fā)揮抗腫瘤作用外，PF-543在對(duì)抗炎癥和自身免疫疾病方面的重要作用也應(yīng)得到重視。

SK1-5c是一種選擇性SphK1拮抗劑，對(duì)PKC等蛋白激酶均無抑制作用[51]。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，SK1-5c可降低Akt信號(hào)的傳導(dǎo)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[52]，SK1-5c也可誘導(dǎo)MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡，并在小鼠MDA-MB-231異種移植瘤模型中使腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制[53]。雖然SK1-5c是選擇性SphK1拮抗劑，但其對(duì)其他脂質(zhì)激酶、蛋白激酶和其他鞘脂代謝酶的影響需進(jìn)一步研究。

MP-A08是通過計(jì)算機(jī)對(duì)接篩選得到的ATP競(jìng)爭(zhēng)性SphK拮抗劑[54]，其對(duì)SphK1和SphK2均有抑制作用。MP-A08不抑制人神經(jīng)酰胺激酶（ceramide kinase，CK）和二?；视图っ福╠iacylglycerol kinase，DAGK）等激酶的活性，并能降低S1P的水平，升高Sp和Cer的水平，但其并不誘導(dǎo)SphK1蛋白酶體降解。在小鼠肺癌異種移植瘤模型中，MP-A08能和ATP競(jìng)爭(zhēng)鞘氨醇激酶上的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而阻斷促增生信號(hào)通路，減少腫瘤血管的形成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[54]。由于MP-A08相對(duì)于其他已知的SphK1拮抗劑有不同的作用模式，因而可為靶向SphK1的抗癌藥物的研究提供新的思路。

2.3 天然產(chǎn)物類SphK1拮抗劑

天然產(chǎn)物一直是藥物和藥物先導(dǎo)物的重要源泉。目前發(fā)現(xiàn)一些從細(xì)菌和真菌中分離得到的天然產(chǎn)物，對(duì)鞘氨醇激酶也具有抑制作用。從海洋細(xì)菌中分離得到的B-5354c，可同時(shí)抑制SphK1和SphK2的活性，并能誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞（PC-3）凋亡，在原位異種移植的PC-3細(xì)胞模型中與喜樹堿發(fā)揮協(xié)同作用，增強(qiáng)喜樹堿的抗腫瘤活性[55]。從真菌Trichopezizella barbata的培養(yǎng)液中分離得到的F-12509A，可同時(shí)抑制SphK1和SphK2的活性；HL-60細(xì)胞中，F(xiàn)-12509A可通過抑制SphK1來阻斷S1P的產(chǎn)生，且無論多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）基因表達(dá)如何，F(xiàn)-12509A均能在低濃度促進(jìn)下誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡[56]。雖然天然產(chǎn)物對(duì)SphK的選擇性不太好，但它們可作為潛在的先導(dǎo)物用于開發(fā)更有效和特異性的SphK1拮抗劑。

天然產(chǎn)物 pachastrissamine（又名Jaspine B）是2002年及2003年從海綿中分離得到的一類無水鞘氨醇類化合物[57-58]，其在結(jié)構(gòu)上可看作 Sp的分子內(nèi)脫水產(chǎn)物。佳司派恩（Jaspine B）具有順式三取代的四氫呋喃環(huán)骨架，能同時(shí)抑制SphK1、SphK2的活性并對(duì)人類P388、A549、HT29、MEL28等多種癌細(xì)胞有細(xì)胞毒活性[59-60]。目前Jaspine B及其2,3,4-位異構(gòu)體已全部合成出來[61]，在測(cè)試中發(fā)現(xiàn)，其2位異構(gòu)體對(duì)SphK1的選擇性最高，可作為先導(dǎo)物進(jìn)行改造、優(yōu)化。目前，本課題組正利用分子對(duì)接等合理藥物設(shè)計(jì)方法對(duì)2-位異構(gòu)體進(jìn)行衍生物設(shè)計(jì)、合成及生物活性研究，期望得到靶向SphK1的抗腫瘤臨床候選藥物。

3 結(jié)語與展望

SphK1與腫瘤等疾病之間聯(lián)系密切，可作為癌癥治療的理想靶標(biāo)。近年，SphK1拮抗劑發(fā)展迅速，特別是計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)和構(gòu)效關(guān)系研究的興起，為這類藥物的設(shè)計(jì)提供了更加科學(xué)的指導(dǎo)。但在研 SphK1 拮抗劑的選擇性、體內(nèi)活性或藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)限制了其臨床應(yīng)用，目前還沒有上市及進(jìn)入臨床試驗(yàn)的候選藥物，因此設(shè)計(jì)開發(fā)對(duì) SphK1 具有高親和力的特異性拮抗劑具有廣闊的發(fā)展空間和重要的臨床意義。

4 致謝

感謝山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院院級(jí)科技計(jì)劃（2016-5），山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生科技創(chuàng)新工程經(jīng)費(fèi)支持。