楊柳田頭菇Y(jié)AAS711菌株F1子代胞外酶活性分析

周會明，趙永昌，柴紅梅，張焱珍

楊柳田頭菇Y(jié)AAS711菌株F1子代胞外酶活性分析

周會明1，2，趙永昌2，柴紅梅2，張焱珍1，2

（1滇西科技師范學(xué)院生物技術(shù)與工程學(xué)院，云南臨滄 677000；2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，昆明 650205）

【】探究楊柳田頭菇Y(jié)AAS711菌株的單孢菌株及其自交個體的胞外酶活性變化規(guī)律，為其遺傳育種提供理論依據(jù)。以楊柳田頭菇Y(jié)AAS711的18個單核體與22個自交雙核體為試驗(yàn)材料，分別采用3, 5-二硝基水楊酸（DNS）法、福林法、愈創(chuàng)木酚法等測定羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、半纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、漆酶、多酚氧化酶、過氧化物酶9種胞外酶活性，并對這9種胞外酶與子代生長速度、極性和交配因子進(jìn)行相關(guān)性分析。單核體和雙核體絕大多數(shù)都具有較高的淀粉酶、濾紙纖維素酶、半纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、羧甲基纖維素酶及蛋白酶活性，過氧化物酶、多酚氧化酶及漆酶活性卻較低。9種胞外酶平均活力與單核體和雙核體的菌絲生長速度均存在一定程度的相關(guān)性，除部分類型Ⅱ單核體外，菌絲生長速度較快的單核體具有較高的胞外酶活性；反之，胞外酶活性較低。相比單核體菌絲生長速度“快-快”的組合，單核體菌絲生長速度“快-慢”的組合除半纖維素酶、蛋白酶和多酚氧化酶外，其他胞外酶活性都較高。具有類型Ⅱ單核體參與形成的雙合體胞外酶活性卻各不相同且無規(guī)律。多酚氧化酶對單核體菌絲生長速度的間接影響大于漆酶，但漆酶對單核體菌絲生長速度的綜合作用最大；胞外酶之間的協(xié)同作用對雙核體菌絲生長速度影響較小，其中漆酶對其菌絲生長速度直接作用最大。多重比較結(jié)果顯示，在顯著水平為0.05上，極性對胞外酶平均活力的影響大于交配因子。單核體菌絲生長速度與本極性異常和楊柳田頭菇Y(jié)AAS711子代個體胞外酶活性差異存在顯著相關(guān)性，除部分類型Ⅱ單核體和雙核體外，類型Ⅰ菌株胞外酶活性具有相同的規(guī)律。單核體菌絲生長速度、極性、胞外酶三者之間具有一定的相關(guān)性，但交配因子與胞外酶沒有直接相關(guān)性。

楊柳田頭菇；自交后代；胞外酶活性；單核體；雙核體

0 引言

【研究意義】楊柳田頭菇（）隸屬于真菌界、擔(dān)子菌亞門、傘菌綱、傘菌亞綱、傘菌目、球蓋菇科、田頭菇屬[1-2]，其生長于亞熱帶地區(qū)柳樹上，具有外觀美、肉質(zhì)嫩、味道鮮、口感佳等優(yōu)點(diǎn)，為中國云南省特有的珍稀食用菌。雖然該菌人工栽培出菇，但農(nóng)藝性狀較差，由于資源的稀缺性及遺傳育種相關(guān)的基礎(chǔ)研究不多，開展楊柳田頭菇Y(jié)AAS711菌株F1子代胞外酶活性分析研究對雜交親本選擇具有指導(dǎo)意義。【前人研究進(jìn)展】目前，對楊柳田頭菇的一些研究主要集中在形態(tài)觀察[3-4]、分子生物學(xué)鑒定[5]、菌株馴化[6]、生物活性物質(zhì)分離[7-9]、轉(zhuǎn)錄組比較[10]、交配基因分析[11]、交配型測定[12]、品種選育[13]等方面，但缺少必要的生理生化基礎(chǔ)研究。楊柳田頭菇市場需求較大，人工種植比較容易，但從野生子實(shí)體中分離出來的菌株，因其農(nóng)藝性狀不穩(wěn)定，無法應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)用種，選育雜交品種成為其推廣的當(dāng)務(wù)之急。親本的生理特性對雜交后代的影響極為重要，該研究為品種的馴化和優(yōu)良菌株的選擇提供足夠的理論支持。胞外酶是一類產(chǎn)生于細(xì)胞內(nèi)而在細(xì)胞外發(fā)揮作用的酶，其活性大小與食用菌種類和培養(yǎng)基質(zhì)密切相關(guān)[14]。食用菌在整個生長發(fā)育階段可向培養(yǎng)基質(zhì)中分泌多種胞外酶，這些酶可將培養(yǎng)基中的大分子物質(zhì)（纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等）水解成小分子物質(zhì)供菌絲吸收和利用[15]。通過對食用菌胞外酶活性的研究，可以了解各種食用菌在不同發(fā)育階段的胞外酶分泌特點(diǎn)、活性大小及動態(tài)變化趨勢[16]，推測不同食用菌對培養(yǎng)基質(zhì)中木質(zhì)纖維素、淀粉等大分子營養(yǎng)成分的降解動態(tài)，對提高其栽培技術(shù)具有重要意義。目前在榆黃蘑（）[17]、黃孢原毛平革菌（）[18]、雅致栓孔菌（）[19]、平菇（spp.）[20]、巴爾喀什蘑菇（）[21]、蜜環(huán)菌（spp.）[22]、玉木耳（）[23]、紅托竹蓀（）[24]、茶樹菇（）[25]、白靈側(cè)耳（）[26]等大型真菌的胞外酶活性已開展了研究，上述食用菌胞外酶與其生長發(fā)育密切相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雜交育種的難點(diǎn)是親本選擇，多數(shù)的雜交育種研究都是隨機(jī)選擇，不僅工作量大，也具有較大的盲目性。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)單孢菌株群體在生長速度上有較大的差異，組合配對的雙核體生長與單核體存在某種關(guān)系，一般而言，菌絲的生長速度與基質(zhì)利用（即分泌胞外酶降解基質(zhì)）相關(guān)。有關(guān)雙核體胞外酶與兩單核體親本之間的關(guān)系研究未見報道，探索單核體交配極性、交配因子和胞外酶活性對形成的雙核體胞外酶活性的影響，將為雜交育種的親本定向選擇奠定基礎(chǔ)。楊柳田頭菇不同極性單核菌株的胞外酶活性至今尚未報道，筆者對該菇的前期研究工作表明，菌株YAAS711分離的單核體在直徑為90 mm的培養(yǎng)皿YPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)其生長速度分為生長快型（F：2.2—3.5 mm?d-1）和生長慢型（S：1.2—1.4 mm?d-1）兩類，單孢菌株群體中每種極性都有生長速度快慢之分，生長速度極慢的單核菌株幾乎集中在一種交配型AyBy中[12]。按生長速度將每種極性中的單孢菌株分為兩類，數(shù)量多的為I型菌株（包括生長速度快（F）的AxBx、AxBy、AyBx和生長速度慢（S）的AyBy），數(shù)量少的為II型菌株（包括生長速度慢（）的AxBx、AxBy、AyBx和生長速度快（）的AyBy）?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以I型菌株中F×F和F×S組合為對照，對II型中或單孢菌株進(jìn)行組合，共形成6種雙核體組合，對18個單核體與22個雙核體的9種胞外酶活性進(jìn)行測定與分析，找出楊柳田頭菇單核體與雙核體胞外酶活性變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 單核體與雙核體

楊柳田頭菇菌株YAAS711由采集于云南省香格里拉市的野生子實(shí)體分離得到，試驗(yàn)用的成熟子實(shí)體在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所實(shí)驗(yàn)室通過袋栽法獲得。無菌條件下，將新鮮子實(shí)體置于滅過菌的帶有硫酸紙的培養(yǎng)皿內(nèi)收集擔(dān)孢子，稀釋涂布法制備單孢菌株，單核體配對獲得雙核菌絲體（表1）[12,27]。不同菌株的9種胞外酶活性研究于2018年9月在滇西科技師范學(xué)院生物技術(shù)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室開展。

表1 試驗(yàn)菌株

“F”代表單孢生長速度較快的極性，“S”代表單孢生長速度較慢的極性，“＿”代表類型Ⅱ單核體，其他的為類型Ⅰ單核體，“×”代表雜交；“*”代表兩個不同菌株單核體形成雜合體的連接符，*前后分別為雜交配對親本單孢編號

“F” represents the polarity with a faster growth rate of single spore, “S” represents the polarity with a slower growth rate of single spore, “＿” represents the type II monokaryons, others are type I monokaryons, “×” represents hybridization, “*” represents connectors of monokaryons formation of a hybrid for two different strains, * before and after is strain No. of single spore of hybrid pairing parents

1.2 菌株培養(yǎng)與粗酶液制備

將已活化的單核體與雙核體菌株接種于YPD（0.2%蛋白胨、0.2%酵母膏、2%葡萄糖、1.5%瓊脂）固體培養(yǎng)基，在25℃條件下培養(yǎng)，平皿生長速率法測定生長速度[12]。將單核體與雙核體菌株接種于YPD固體培養(yǎng)基，在（24±1）℃下黑暗培養(yǎng)15 d，用直徑7 mm打孔器處理培養(yǎng)菌株邊緣打孔，挑取1塊接種于含120 mL YPD液體培養(yǎng)液（除不含瓊脂外，成分同固體）的250 mL三角瓶中，3次重復(fù)，置于旋轉(zhuǎn)式搖床，100 r/min、（25±1）℃下黑暗培養(yǎng)10 d。過濾（200目三層尼龍紗布），取濾液，離心（4℃、4 000 r/min、20 min），上清液即為粗酶液，置于-20℃下保存，用于胞外酶測定[28]。

1.3 酶活測定

40個子代個體是單獨(dú)一個處理下的酶活測試，羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶、β-葡糖糖苷酶、半纖維素酶以及淀粉酶的測定采用二硝基水楊酸（DNS）法[29]，所有酶活單位用U表示。

1.3.1 羧甲基纖維素酶 以羧甲基纖維素鈉為底物，用pH 4.6、0.1 mol?L-1檸檬酸緩沖液配制0.5%羧甲基纖維素（CMC）溶液。向試管（3支樣品、3支對照）中加入0.5%的CMC-Na溶液0.75 mL，樣品管加粗酶液0.125 mL，50℃恒溫水浴保溫30 min，取出后立即加入DNS試劑0.75 mL（對照管加入DNS后再加入0.125 mL酶液），沸水浴10 min，取出立即冷卻，加蒸餾水25 mL，混勻，于520 nm測OD值，依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1-A）求得還原糖量[30]。1 U=1 mg葡萄糖?(30 min)-1?mL-1發(fā)酵液（即1 mL發(fā)酵液中的酶量與底物作用30 min釋放出l mg葡萄糖為一個活力單位）。

1.3.2 濾紙纖維素酶 以一層濾紙（規(guī)格：1 cm×6 cm，新華1號）為底物，向試管（3支樣品、3支對照）中加入一條新華1號濾紙，而后加入0.1 mol? L-1檸檬酸緩沖液（pH 4.6）0.5 mL，再往樣品管中加入粗酶液0.125 mL，置于50℃保溫60 min，取出后，立即加入DNS試劑1.5 mL（對照管加入DNS后再加入0.125 mL酶液），沸水浴10 min，取出冷卻后加蒸餾水至25 mL，混勻，然后于520 nm處測OD值，依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得還原糖量[31]。1 U=1 mg葡萄糖?(60 min)-1?mL-1發(fā)酵液（即1 mL發(fā)酵液中的酶量與底物作用60 min釋放出l mg葡萄糖為一個活力單位）。

A：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；B：木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；C：酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線A: Glucose standard curve; B: Xylose standard curve; C: Tyrosine standard curve

1.3.3 β-葡糖糖苷酶 以纖維二糖為底物，向試管（3支樣品、3支對照）中加入0.2%的纖維二糖0.5 mL，樣品管加入粗酶液0.075 mL，50℃恒溫水浴保溫30 min，取出后立即加入DNS試劑0.75 mL（對照管加入DNS后再加入0.075 mL酶液），沸水浴10 min，取出立即冷卻，加蒸餾水15 mL，搖勻，于520 nm測OD值，依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得還原糖量[32]。1 U=1 mg葡萄糖?(30 min)-1?mL-1發(fā)酵液（即1 mL發(fā)酵液中的酶量與底物作用30 min釋放出l mg葡萄糖為一個活力單位）。

1.3.4 半纖維素酶 以木聚糖為底物，用pH 4.6、0.2 mol?L-1的乙酸緩沖液配制0.5%木聚糖溶液。向試管中（3支樣品、3支對照）加入0.5%的木聚糖0.75 mL，樣品管加粗酶液0.05 mL，50℃恒溫水浴保溫30 min，取出立即加入DNS試劑0.75 mL（對照管加入DNS后再加0.05 mL酶液），沸水浴10 min，取出立即冷卻，加蒸餾水10 mL，搖勻，于520 nm測OD值。依據(jù)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1-B）求還原糖量[33]。1 U=1 mg木糖?(30 min)-1?mL-1發(fā)酵液（即1 mL發(fā)酵液中的酶量與底物作用30 min釋放出l mg木糖為一個活力單位）。

1.3.5 淀粉酶 以可溶性淀粉為底物，向試管（3支樣品、3支對照）中加入0.5%的可溶性淀粉溶液0.5 mL，樣品管加入粗酶液0.05 mL，混勻，38℃恒溫水浴保溫30 min，取出立即加入DNS試劑0.75 mL（對照管加入DNS后再加入0.05 mL酶液），沸水浴10 min，取出立即冷卻，加蒸餾水10 mL，搖勻，于520 nm測OD值，依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得還原糖量[34]。1 U=1 mg葡萄糖?(30 min)-1?mL-1發(fā)酵液（即1 mL發(fā)酵液中的酶量與底物作用30 min釋放出l mg葡萄糖為一個活力單位）。

1.3.6 蛋白酶 以酪蛋白為底物，向試管中（3支樣品、3支對照）加入2%酪蛋白（預(yù)熱至30℃）1 mL，樣品管加入稀釋10倍的粗酶液0.5 mL搖勻，30℃保溫10 min，加入10%三氯乙酸l mL中止反應(yīng)，再吸取粗酶液0.5 mL加入對照管中，搖勻，25℃靜置30 min，離心（4℃、3 000 r/min）2 min。另取試管（3支樣品，3支對照），然后分別加入0.5 mL上清測定液、對照液，分別加入2.5 mL的0.4 mol?L-1碳酸鈉溶液，最后加入0.5 mL福林-酚試劑，搖勻，30℃水浴保溫30 min，取出后置于分光光度計(jì)650 nm處測OD值，依酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1-C）求值[35]。1 U=1 μg酪氨酸?（30 min）-1?mL-1發(fā)酵液（即1 mL發(fā)酵液中的酶量與底物作用30 min釋放出l μg酪氨酸為一個活力單位）。

1.3.7 木質(zhì)素酶 木質(zhì)素酶主要包括漆酶、多酚氧化酶及過氧化物酶，參考Egger[36]、Pointing[37]、S?k[38]等的方法測定。酶活性定義：1 U=ΔOD?（30 min）-1?mL-1發(fā)酵液，即1 mL發(fā)酵液中的酶量每分鐘使OD值改變0.01為一個活力單位。

1.3.7.1 漆酶 向試管中（3支樣品、3支對照）加入3.36 mmol?L-1鄰聯(lián)甲苯胺0.5 mL作為底物，加入0.2 mol?L-1乙酸緩沖液（pH 4.6）3 mL，樣品管再加入0.4 mL酶液，對照管中加入煮沸10 min的粗酶液0.4 mL，置28℃恒溫水浴下反應(yīng)30 min，取出后立即于600 nm處測OD值。

1.3.7.2 多酚氧化酶 向試管中（3支樣品、3支對照）加入0.1 mmol?L-1的鄰苯二酚2.0 mL和0.05 mol?L-1磷酸緩沖液（pH=6.0）2.0 mL，樣品管再加入粗酶液0.4 mL，對照管中加入煮沸10 min的粗酶液0.4 mL，28℃恒溫水浴保溫30 min，取出后立即于400 nm處測0D值。

1.3.7.3 過氧化物酶 向3支樣品管加入粗酶液0.4 mL，3支對照管中加入煮沸10 min的粗酶液0.4 mL，再分別加入過氧化物反應(yīng)混合物（取愈創(chuàng)木酚0.019 mL，過氧化氫0.028 mL，pH 6.0的0.2 mol?L-1磷酸緩沖液100 mL混合）3.0 mL，倒入比色皿立即計(jì)時30 min，測定470 nm的OD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

活性值的測定均為3次重復(fù)，采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[39]。

2 結(jié)果

2.1 楊柳田頭菇不同單核體的菌絲生長速度及其9種胞外酶活性分析

通過上述方法測定楊柳田頭菇不同單核體的菌絲生長速度和胞外酶活性。多重比較（Duncan法）結(jié)果表明，不同的單核體其菌絲生長速度與9種胞外酶活性均存在較大的差異，在顯著水平為0.05上各自均表現(xiàn)出不同程度的顯著差異（表2）。大部分菌絲生長速度較快的單核體的胞外酶活性也較高，反之，胞外酶活性較低；但少數(shù)類型Ⅱ單核體如、及等卻出現(xiàn)菌絲生長速度與大部分胞外酶活性成反比的現(xiàn)象。同時，除類型Ⅱ的單核體和的羧甲基纖維素酶外，所有單核體的淀粉酶、濾紙纖維素酶、半纖維素酶、β-葡糖糖苷酶、羧甲基纖維素酶及蛋白酶比過氧化物酶、多酚氧化酶、漆酶的活性高。因此，單核體生長發(fā)育階段，淀粉、纖維素、半纖維素及蛋白質(zhì)是其菌絲通過胞外酶降解并吸收利用的主要大分子物質(zhì)，對木質(zhì)素的要求較少。

2.2 楊柳田頭菇不同雙核體的菌絲生長速度及其9種胞外酶活性分析

雙核體的菌絲生長速度和胞外酶活性多重比較（Duncan法）結(jié)果表明，不同類型的雙核體其菌絲生長速度與9種胞外酶活性均存在較大的差異（＜0.05）（表3）。對于類型Ⅰ單核體組合所形成的雙核體來說，單核體菌絲生長速度“快-慢”組合與“快-快”組合相比，前者除半纖維素酶、蛋白酶和多酚氧化酶外，其他胞外酶活性都較高，具有類型Ⅱ單核體參與形成的雙核體的胞外酶活性卻各不相同且無規(guī)律，一部分雙核體（如：*、096*）胞外酶活性表現(xiàn)較高，另一部分雙核體（如：096*、*）胞外酶活性卻較低?？傊?2個雙核體中，組合編號為001*029、096*、*等的胞外酶活性較高，而組合編號為036*096、071*、071*等胞外酶活性較低。同時，除部分雙核體蛋白酶（001*029、001*071、001*187、*和096*）、半纖維素酶（*和*）和-葡萄糖苷酶（071*和096*）外，所有雙核體的淀粉酶、濾紙纖維素酶、半纖維素酶、β-葡糖糖苷酶、羧甲基纖維素酶及蛋白酶比過氧化物酶、多酚氧化酶、漆酶的活性高。因此，雙核體生長發(fā)育階段，對大分子物質(zhì)的需求與單核體相似。

2.3 單核體菌絲生長速度與9種胞外酶活性之間的相關(guān)性分析及通徑分析

為分析不同胞外酶活力大小與楊柳田頭菇菌絲生長速度的關(guān)系，對18個單核體的菌絲生長速度及其9種胞外酶平均活力進(jìn)行相關(guān)性分析及通徑分析[40]。相關(guān)性分析結(jié)果表明（表4），所測定的胞外酶平均活力除濾紙纖維素酶、半纖維素酶、過氧化物酶外，其余與單核體菌絲生長速度呈正相關(guān)；其中單核體的菌絲生長速度與漆酶、多酚氧化酶、蛋白酶的平均酶活力呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），與淀粉酶、β-葡萄糖苷酶的平均酶活力呈顯著正相關(guān)（＜0.05）。因此，單核體的菌絲生長速度與9種胞外酶平均活力存在著一定程度的相關(guān)性。

表2 楊柳田頭菇不同單核體的菌絲生長速度與胞外酶平均活力的差異

CMC：羧甲基纖維素酶（CMCase）；FP：濾紙纖維素酶（Filter paper cellulose）；βG：-葡萄糖苷酶（-glucanase）；HC：半纖維素酶（Hemieetlutase）；AM：淀粉酶（Amylase）；PR：蛋白酶（Protease）；LA：漆酶（Laccase）；PPO：多酚氧化酶（Polyphenolase）；POD：過氧化物酶（Peroxidase）。同列數(shù)字后不同小寫字母表示在0.05水平有顯著差異。下同 Different small letters behind the data in the same column mean significant difference at 0.05 level. The same as below

表3 楊柳田頭菇不同雙核體的菌絲生長速度與胞外酶平均活力的差異

表4 菌絲生長速度及其胞外酶平均活力的相關(guān)系數(shù)

“*”代表顯著相關(guān)（＜0.05）；“**”代表極顯著相關(guān)（＜0.01）。下同

“*” represents the significant correlation (＜0.05), “**” represents the highly significant correlation (＜0.01). The same as below

上述相關(guān)性分析只能表明胞外酶活力與單核體菌絲生長速度之間的直接關(guān)系，但不同胞外酶之間相互作用對其影響沒有直觀表現(xiàn)。因此，需在相關(guān)性分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行通徑分析，通過逐步回歸分析法，把胞外酶活力與單核體菌絲生長速度之間的相關(guān)性分解為直接作用和間接作用，篩選出與單核體菌絲生長速度較為密切的胞外酶種類。

以單核體菌絲生長速度為因變量Y，羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、HC、半纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、漆酶、多酚氧化酶和過氧化物酶分別為自變量X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9。采取多元線性回歸分析法，剔除偏回歸系數(shù)不顯著的自變量，建立Y的最優(yōu)多元回歸方程為：=0.086+0.2057+0.2028（=20.136，=0.000＜0.01），多元線形回歸方程的F檢驗(yàn)達(dá)到極顯著，進(jìn)一步做通徑分析。

表5 以菌絲生長速度為因變量的通徑分析

“→”表示通過該酶對Y產(chǎn)生間接作用?！啊眒eans that the enzyme has an indirect effect on Y

通徑分析結(jié)果表明（表5），在2個自變量與Y的多元線形回歸方程中，直接通徑作用的關(guān)聯(lián)程度為X7>X8，間接通徑的關(guān)聯(lián)程度為X8>X7，決策系數(shù)的大小為X7>X8。因此，X8通過X7對Y的間接作用大于X7通過X8對Y的間接作用（0.284>0.178），說明多酚氧化酶對單核體的菌絲生長速度的間接影響大于漆酶，但漆酶對單核體的菌絲生長速度的綜合作用（包括直接作用以及與其他胞外酶的協(xié)同作用）最大（2=0.585）。同時，多酚氧化酶與漆酶共同作用參與木質(zhì)素的降解，因此，在楊柳田頭菇單核體的生長發(fā)育過程中，木質(zhì)素對其影響較大。

2.4 雙核體菌絲生長速度與9種胞外酶活性之間的相關(guān)性分析及通徑分析

雙核體的菌絲生長速度與胞外酶的相關(guān)性分析表明（表6），所測定的胞外酶平均活力除多酚氧化酶與過氧化物酶外，其余與其菌絲生長速度呈正相關(guān)。其中雙核體的菌絲生長速度與漆酶、淀粉酶、羧甲基纖維素酶的平均酶活力呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），但與多酚氧化酶平均酶活力呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01）。因此，楊柳田頭菇單核體菌絲的生長速度與9種胞外酶平均活力也存在著一定程度的相關(guān)性。

表6 菌絲生長速度及其胞外酶平均活力的相關(guān)系數(shù)

以相關(guān)性分析為基礎(chǔ)，對胞外酶活力與雙核體菌絲生長速度進(jìn)行通徑分析，剔除偏回歸系數(shù)不顯著的自變量，建立Y的最優(yōu)線性方程為：=0.195+ 0.1047（=39.276，=0.000＜0.01），線形回歸方程的F檢驗(yàn)達(dá)到極顯著?？傊崦笇﹄p核體的菌絲生長速度的作用最大，不同胞外酶之間的協(xié)同作用對雙核體菌絲的生長速度影響較小。

2.5 極性對9種胞外酶平均活力的影響分析

在單核體的基礎(chǔ)上，根據(jù)極性不同將單核體分為AxBx、AyBy、AxBy和AyBx4類，分別計(jì)算每一類極性中單核體的9種胞外酶平均活力，通過多重比較（Duncan法）分析不同極性對9種胞外酶平均活力的影響。結(jié)果表明（表7），-葡萄糖苷酶、淀粉酶、漆酶、多酚氧化因極性不同而表現(xiàn)出一定的顯著差異，其余胞外酶酶活的表現(xiàn)無差異。

表7 不同極性對胞外酶平均活力的影響

2.6 交配因子與9種胞外酶平均活力的影響分析

用上述同樣的方法，在單核體的基礎(chǔ)上，根據(jù)交配因子不同將單核體分為Ax、Ay、Bx和By4類，分別計(jì)算每一類交配因子中單核體的9種胞外酶平均活力，通過多重比較（Duncan法）分析不同交配因子對9種胞外酶平均活力的影響。結(jié)果表明（表8），大部分胞外酶因交配因子不同而未表現(xiàn)出差異性，只有漆酶、多酚氧化酶、過氧化物酶存在一定的顯著差異。

3 討論

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道，大型真菌菌絲體的生長速率是由多個基因控制的數(shù)量性狀位點(diǎn)[41-42]。大型真菌菌絲生長速度與酶類、激素分泌和耐溫特性等[43-44]相關(guān)，并已經(jīng)證實(shí)其單核體菌絲生長速度相關(guān)控制基因或數(shù)量基因座與交配因子[45]和自我識別系統(tǒng)連鎖[46]。然而，直接說真菌胞外酶活性與菌絲生長速度相關(guān)的研究目前尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)楊柳田頭菇單核體中生長速度較快的也具有較高的胞外酶活性，生長速度較慢的其胞外酶活性低，因此，單核體胞外酶活性與菌絲生長速度之間可能存在一定的相關(guān)性。

表8 不同交配因子對胞外酶平均活力的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，在顯著水平為0.05上，極性對胞外酶的影響大于交配因子，目前的研究已證明交配因子A和B本身并不連鎖且存在于不同的染色體上[47-48]。因此，楊柳田頭菇單核體的胞外酶活性是與極性有相關(guān)性的多基因控制的數(shù)量性狀，而不是與單獨(dú)的交配因子相關(guān)。

高等真菌在人工馴化栽培過程中，其有性繁殖階段交配型因子位點(diǎn)內(nèi)出現(xiàn)重組的現(xiàn)象極其普遍，常常引發(fā)交配因子的偏分離，偏分離現(xiàn)象在[49]、[50]、[46]等中均有報道，可導(dǎo)致極性菌株不成比例，嚴(yán)重者還出現(xiàn)某一極性丟失的現(xiàn)象[51]，與正常菌株相比，偏分離菌株會出現(xiàn)一些不同的特征，如菌絲生長速度和胞外酶活性異常。本研究發(fā)現(xiàn)，除一些單核體和雙核體菌株外，類型Ⅰ菌株的胞外酶活性有一定的規(guī)律。因此，單核體的菌絲生長速度與本極性異常與其胞外酶活性相關(guān)。

4 結(jié)論

淀粉酶、濾紙纖維素酶、半纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、羧甲基纖維素酶及蛋白酶活性在單核體和雙核體的表達(dá)水平較高；單核體與雙核體的胞外酶活性極有可能與菌絲生長速度、極性相關(guān)，其中漆酶對單核體和雙核體菌絲生長速度的影響較大，極性對胞外酶平均活力的影響大于交配因子。單核體的菌絲生長速度與本極性異常是改變各菌株生長速度和胞外酶活性表達(dá)水平的根源。

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The Extracellular Enzymes Activity of F1Generations and Single-spore Isolations inStrain YAAS711

ZHOU HuiMing1,2, ZHAO YongChang2, CHAI HongMei2, ZHANG YanZhen1,2

(1School of Biotechnology and Engineering, West Yunnan University, Lincang 677000, Yunnan;2Institute of Biotechnology and Germplasmic Resource, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650205)

【】The objective of this study was to explore the changes in activities of extracellular enzymes (EEA) of single-spore isolations and its self-crossing individuals fromYAAS711 and to provide evidence for its genetic breeding.【】Eighteen single-spore monokaryons and 22 dikaryons from self-crossing progeny ofYAAS711 were used as the test materials. The activities of CMCase, filter paper cellulase, β-glucanase, hemicellulase, amylase, protease, laccase, polyphenolase and peroxidase of all test strains were determined by 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS), Folin methods and guaiacol method, and correlation analysis were carried out between the 9 EEs with mycelial growth rate, polarities and mating factors.【】The results of 9 EEs showed that most of the both monokaryons and dikaryons had higher activities of amylase, filter paper cellulase, hemicellulose, β-glucanase, CMCase and protease, but their activities of peroxidase, polyphenolase and laccase were low. The mycelial growth rate of monokaryons and dikaryons had a certain degree of correlation with the average activity of 9 EEAs. Compared with the dikaryons derived from the combination of “fast-fast” growth rate of monokaryons, the dikaryons derived from the combination of “fast-slow” growth rates of monokaryons had higher EEAs, except hemicellulase, protease and polyphenol oxidase activities. However, there were no rules to follow, when it came to the combination of dikaryons from the cross of type II monokaryons. The indirect effect of polyphenolase on the mycelial growth rate of monokaryons was greater than that of laccase, but the combined effect of laccase on the mycelial growth rate of monokaryons was the largest. The synergistic effect among EEs had little effect on the mycelial growth rate of dikaryons, among them, laccase had the greatest direct effect on its mycelial growth rate. Multiple comparisons showed that the effect of polarity on EEs was greater than that of mating factors at a significant level of 0.05.【】In short, there was a significant correlation between the anomalies of the mycelial growth rate of the monokaryons from same polarity single spore isolations and the EEAs of F1 generations deriverd from these monokaryons instrain YAAS711. The EEAs of type I strains had same rule, but the differences were existed in some type II monokaryons and the dikaryons. There were certain correlation between the growth rate of monokaryons, EEAs and polarity, there were no direct correlation between mating factors and EEAs.

; self-crossing F1generations; extracellular enzyme activity; monokaryon; dikaryon

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.20.017

2019-04-08；

2019-08-03

云南省教育廳科學(xué)研究基金（2018JS522）、國家食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-20）

周會明，E-mail：632243530@qq.com。

趙永昌，E-mail：yaasmushroom@aliyun.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）