盧小亮，張 強，孫 渭，陳 鑫，吳洪啟，陳耀鋒*

1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西省楊凌示范區(qū)邰城路3 號 712100

2.中國煙草總公司陜西省公司，西安市曲江新區(qū)雁南四路21 號 710004

煙草赤星?。═obacco brown spot）是由絲孢綱鏈格孢屬鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起的一種嚴重危害煙草生產(chǎn)的真菌性病害［1］，給煙草行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。選育抗病品種和提高品種的抗病性是防治煙草赤星病最經(jīng)濟有效且利于環(huán)境保護的途徑［2］。在抗煙草赤星病的傳統(tǒng)育種中，大田人工病圃鑒定和離體葉片鑒定常作為抗病植株選擇的主要方法。大田人工病圃鑒定主要用于煙草生長后期的接種鑒定，易受其他雜菌影響，歷時長、耗費高，且氣候條件不易控制，因此不能準確評價材料的抗病水平［3］。離體葉片鑒定是一種在煙草苗期進行的室內(nèi)鑒定方法，相比大田人工病圃鑒定在很大程度上提高了鑒定效率，但在準確性方面不如病圃鑒定高［4］。病原菌毒素鑒定是一種新型抗病鑒定方法［5］。毒素的本質(zhì)是病原菌產(chǎn)生的、有生物毒性的代謝產(chǎn)物。在一定條件下，病原菌毒素可使寄主植物產(chǎn)生特定的病癥反應(yīng)，病癥反應(yīng)的強弱與其寄主植物的抗病性具有高度相關(guān)性［6-7］。目前，病原菌毒素被用于作物抗病種質(zhì)的篩選與鑒定。例如，廣藿香青枯病［8］、棉花黃萎病［9］和煙草黑脛?。?0］等病害的種質(zhì)抗性鑒定，其效果能合理評價病菌寄主的抗性水平。煙草赤星病菌在培養(yǎng)過程中或侵染寄主后會在寄主體內(nèi)產(chǎn)生一種寄主專化型毒素即AT-毒素［11］，該毒素在寄主體內(nèi)主要通過破壞生物膜和影響生理代謝來引起病癥反應(yīng)［12］。郭永峰［13］以赤星病菌AT-毒素液處理煙草離體葉片，發(fā)現(xiàn)其發(fā)病程度與常規(guī)接種鑒定結(jié)果高度一致。

鑒于此，在前人研究的基礎(chǔ)上，以4 種不同赤星病抗性的煙草品種為材料，進一步優(yōu)化煙草赤星病病原菌產(chǎn)毒培養(yǎng)與AT-毒素的提取技術(shù)。采用培養(yǎng)基附加煙草赤星病菌AT-毒素的方法，通過不同AT-毒素濃度、不同脅迫時間，研究煙草赤星病菌AT-毒素對不同抗性煙草品種種子發(fā)芽特性的影響，篩選能有效鑒別煙草不同抗性的最佳AT-毒素濃度和脅迫時間，旨在建立一種高效、準確、廣適的煙草赤星病離體脅迫抗性鑒定方法，為煙草赤星病抗病育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種均由中國煙草總公司陜西省公司提供。凈葉黃（抗赤星病品種，R）、G28（中抗赤星病品種，MR）、YN116（中感赤星病品種，MS）和紅花大金元（感赤星病品種，S）。供試菌株：煙草赤星病強致病力鏈格孢菌A1 號菌株，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。于2017—2018 年在西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院細胞工程實驗室進行實驗。

1.2 方法

1.2.1 赤星病菌的活化、產(chǎn)毒培養(yǎng)與AT-毒素制備

菌種活化：用PDA 培養(yǎng)基對赤星病強致病力鏈格孢菌A1 號菌株進行接種活化。28 ℃避光培養(yǎng)4～7 d，以菌絲布滿整個培養(yǎng)皿為宜［14］。

產(chǎn)毒培養(yǎng)與AT-毒素制備：參照郭永峰［13］制備AT-毒素原液的方法，用接種環(huán)取0.5 cm2已活化的赤星病菌菌餅，轉(zhuǎn)入盛有250 mL 產(chǎn)毒培養(yǎng)液的三角瓶中，26 ℃回歇振蕩培養(yǎng)21 d。經(jīng)產(chǎn)毒培養(yǎng)后，將所得的培養(yǎng)液首先經(jīng)無菌雙層紗布過濾除去菌絲體，然后4 000 r/min 離心10 min 使孢子沉淀（此步驟重復(fù)2 次）。鏡檢無孢子后用0.22 μm 無菌濾器過濾除菌得到AT-毒素液，4 ℃冰箱保存。

PDA 培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200.00 g/L、葡萄糖20.00 g/L、瓊脂18.00 g、水1 000 mL。

產(chǎn)毒培養(yǎng)液：蔗糖50.00 g/L、磷酸二氫鉀1.00 g/L、硝酸鈉2.00 g/L、硫酸鎂0.50 g/L、氯化鉀0.50 g/L、七水合硫酸亞鐵0.01 g/L、酵母膏5.00 g/L、水1 000 mL。

1.2.2 AT-毒素原液中蛋白質(zhì)和可溶性糖濃度的測定

采用考馬斯亮藍G-250 染色法［15］測定上述制備的AT-毒素原液中蛋白質(zhì)的濃度，以牛血清蛋白為標準蛋白質(zhì)。采用蒽酮比色法［15］測定AT-毒素原液中可溶性糖的濃度，以恒重葡萄糖為標準可溶性糖。

1.2.3 AT-毒素培養(yǎng)基的制備

AT-毒素培養(yǎng)基：MS 培養(yǎng)基（粉劑）［16］+30.0 g/L 蔗糖+6.5 g/L 瓊脂+赤星病菌AT-毒素，pH 5.8。

制備方法：稱取每200 mL AT-毒素培養(yǎng)基所需的MS 培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂等基本成分，置于250 mL 三角瓶中，然后按體積分數(shù)加入已過濾除菌的赤星病菌AT-毒素液，用蒸餾水定容至200 mL，121 ℃滅菌20 min，均勻分裝于3 個13 cm×13 cm的方形培養(yǎng)皿中。AT-毒素培養(yǎng)基的體積分數(shù)分別為0（CK）、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。

1.2.4 AT-毒素脅迫培養(yǎng)

分別挑選150 粒籽粒飽滿、大小均一的不同煙草品種種子于2.0 mL 離心管中。在超凈臺上先用75%乙醇對種子消毒30 s，無菌水沖洗2 次，再用10%過氧化氫進行深層消毒8 min，然后用無菌水沖洗4 次［17］。將消毒好的4 個煙草品種種子分別接種到AT-毒素培養(yǎng)皿中，作為1 個處理，進行3 次重復(fù)。以不加赤星病菌AT-毒素的MS 培養(yǎng)基為空白對照。將培養(yǎng)皿置于（27±2）℃、3 000 ～4 000 Lx、光照16 h/黑暗8 h 條件下培養(yǎng)10、15、20 d。以發(fā)芽率和煙草種子根系扎進培養(yǎng)基的株數(shù)比率為鑒定指標，以篩選出能有效鑒別煙草不同抗性的最佳AT-毒素濃度和脅迫時間。

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%

種子根系扎進培養(yǎng)基的株數(shù)比率=根系扎進培養(yǎng)基中的株數(shù)/發(fā)芽總株數(shù)×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2010 和DPS 17.10 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，采用Duncan’s 新復(fù)極差法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AT-毒素原液中蛋白質(zhì)和可溶性糖的濃度

分別用考馬斯亮藍G-250 染色法和蒽酮比色法測定所制備AT-毒素原液中蛋白質(zhì)和可溶性糖的濃度。結(jié)果表明，AT-毒素原液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為80.52 μg/mL，可溶性糖質(zhì)量濃度為23.39 mg/mL。

2.2 AT-毒素脅迫對煙草種子發(fā)芽率的影響

由圖1 可知，煙草赤星病菌AT-毒素脅迫處理對4 種煙草品種種子的發(fā)芽均有較大影響，隨著AT-毒素濃度的增大，發(fā)芽率呈下降趨勢。高濃度AT-毒素能顯著抑制煙草種子的發(fā)芽，當(dāng)AT-毒素濃度＞50%時，所有供試品種種子的發(fā)芽率均急劇下降。當(dāng)在濃度為90%的AT-毒素培養(yǎng)皿中脅迫20 d 時，凈葉黃和G28 仍表現(xiàn)出較高的耐受性，發(fā)芽率分別為51.39%和41.67%，顯著高于YN116 和紅花大金元。盡管不同煙草品種種子的發(fā)芽受AT-毒素影響較大，但隨著脅迫時間的延長，不同品種之間發(fā)芽率的差異逐漸降低，因此無法以發(fā)芽率的高低來準確判定煙草品種對煙草赤星病的抗病水平。

圖1 赤星病菌AT-毒素對煙草種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of AT-toxin from Alternaria alternata on germination rate of tobacco seeds

2.3 AT-毒素脅迫對煙草種子根系生長的影響

為進一步探究赤星病菌AT-毒素脅迫對煙草種子根系生長的影響，對各煙草品種種子在不同脅迫時間、不同脅迫濃度下根系扎進AT-毒素培養(yǎng)基中的能力進行分析。當(dāng)AT-毒素濃度＞60%時，各品種煙草種子根系扎進AT-毒素培養(yǎng)基的株數(shù)比率均為0 或趨于0，因此結(jié)果未在表1 中列出。由表1 可知，在一定脅迫濃度下，不同煙草品種對赤星病菌AT-毒素的耐受力差異顯著。在低濃度AT-毒素（濃度為0～20%）脅迫下，中感品種YN116 和感病品種紅花大金元能克服AT-毒素的抑制作用，將根系扎入AT-毒素培養(yǎng)基；在高濃度AT-毒素（濃度為60%～100%）脅迫下，抗病品種凈葉黃和G28 的抗性逐漸“喪失”。

表1 煙草種子根系扎進AT-毒素培養(yǎng)基中的株數(shù)比率Tab.1 Percentage of tobacco seedlings with roots’growing into AT-toxin medium

不同濃度AT-毒素脅迫對煙草種子根系生長的影響不同，根系扎進AT-毒素培養(yǎng)基中的株數(shù)比率隨AT-毒素濃度的增大而降低。在50%AT-毒素脅迫第15 和20 d 時，抗病品種凈葉黃的根系扎進培養(yǎng)基中的株數(shù)比率均最高，分別是G28、YN116、紅花大金元根系扎進培養(yǎng)基中株數(shù)比率的1.18、1.75、6.02 倍和1.02、1.75、5.52 倍。因此，通過分析煙草種子根系扎進50%AT-毒素培養(yǎng)基中的株數(shù)比率，能夠?qū)Σ煌瑹煵萜贩N抗赤星病水平進行初步鑒定。

3 討論

本研究中，發(fā)現(xiàn)赤星病菌AT-毒素脅迫對煙草種子的萌發(fā)具有一定的抑制作用，抑制效果的強弱與煙草品種對赤星病的抗性有關(guān)，與Ishida［18］用毒素液培養(yǎng)不同種質(zhì)煙草細胞的結(jié)果一致。病菌毒素是抗病接種鑒定中最常用的試劑，確定最適濃度是鑒定、篩選抗病材料的關(guān)鍵［19］。本試驗中，發(fā)現(xiàn)赤星病菌AT-毒素脅迫對煙草種子根系生長有顯著影響，根系扎進培養(yǎng)基中的株數(shù)比率隨AT-毒素濃度的增大而降低。表明在供試材料對不同濃度AT-毒素耐受范圍內(nèi)，選用高濃度AT-毒素可有效鑒定、篩選出抗赤星病的煙草品種，與高崇等［20］煙草菌核病的試驗結(jié)果相似。

煙草赤星病抗病鑒定是煙草赤星病抗性育種和抗病分子機制研究的基礎(chǔ)［21］。由于煙草赤星病的發(fā)病條件難以控制，所以其鑒定水平一直難以提高［22］。本研究中，通過簡化赤星病菌AT-毒素的提取與檢測技術(shù)，可在AT-毒素培養(yǎng)基中直接接種煙草種子進行鑒定。與現(xiàn)有技術(shù)相比，①直接利用種子進行赤星病菌AT-毒素脅迫的抗性鑒定，可大大縮短鑒定篩選周期；②避免從育苗移栽到成株期歷時長、接種苗齡不一致、誘發(fā)條件受外界影響大等因素的影響；③AT-毒素脅迫鑒定成本極低，在實驗室有限的條件下即可進行大批量的鑒定與篩選。盡管AT-毒素脅迫鑒定較傳統(tǒng)鑒定方法表現(xiàn)出種種優(yōu)勢，但其存在的局限性仍不可忽視。首先其誘發(fā)的病變只是有毒物質(zhì)對植物組織和細胞的短期傷害，不能形成再侵染，與實際病害有本質(zhì)區(qū)別；其次鑒定結(jié)果的準確性還受種子活力的影響。因此，在實際應(yīng)用中AT-毒素脅迫鑒定可作為一種前期抗性篩選的重要手段，而品種最終的抗性評價還需結(jié)合其他的鑒定結(jié)果來確定。

4 結(jié)論

①赤星病鏈格孢菌A1 號菌株經(jīng)活化、產(chǎn)毒培養(yǎng)后，獲得含蛋白質(zhì)80.52 μg/mL、可溶性糖23.39 mg/mL 的AT-毒素原液。②煙草赤星病菌AT-毒素脅迫處理對4 種煙草品種種子的發(fā)芽均有較大影響，高濃度AT-毒素能顯著抑制煙草種子的發(fā)芽。③利用50%的赤星病菌AT-毒素脅迫15～20 d時，抗、感品種煙草種子根系在AT-毒素培養(yǎng)基上扎進培養(yǎng)基中的株數(shù)比率差異顯著。