雪蓮果中菊淀粉型低聚果糖的神經(jīng)保護作用

安 磊 王 珂 孫雨辰 尹 航 張 維 黃小龍 王友升

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京工商大學(xué) 北京 100048）

圖1 菊淀粉型果聚糖的結(jié)構(gòu)（n=2～10或10～60）[2]Fig.1 Representation of the structure of insulin-type fructans（n=2-10 or 2-60）[2]

隨著生活節(jié)奏的加快，人口老齡化日益加深，與衰老相關(guān)的認知功能障礙及相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率逐年提高[4]。大量實驗和臨床研究表明：應(yīng)用飲食干預(yù)或營養(yǎng)補充劑在防治腦老化過程可能發(fā)揮重要作用[5-6]。腦老化的過程和機制比較復(fù)雜，目前研究認為對抗氧化應(yīng)激和增強神經(jīng)保護作用是防治腦老化的重要途徑之一[7-8]。近年來，多項研究報道中藥巴戟天中的菊淀粉型低聚果糖（與雪蓮果中菊淀粉型低聚果糖具有類似的結(jié)構(gòu)通式）具有改善認知和顯著的神經(jīng)保護作用[9-11]。最近作者在動物水平的研究中發(fā)現(xiàn)，雪蓮果中菊淀粉型低聚果糖（Insulin-type oligosaccharides from yacon，YOs）可改善動物的認知功能及抑郁樣行為[12-13]。鑒于此，本研究從體外抗氧化活性和細胞保護等方面探討YOs的神經(jīng)保護作用及其可能機制，為YOs進一步的開發(fā)和利用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪蓮果，云南陸良種植基地。雪蓮果去皮，烘干，打粉，加入去離子水，水和雪蓮果粉（V/W）比例為20，90℃提取2 h，重復(fù)3次，旋蒸濃縮，加入乙醇進行醇沉24 h，收集上清，采用Sevage法去蛋白，大孔樹脂柱層析法脫色得到粗提物，葡聚糖凝膠色譜（G20）純化得到低聚果糖提取物。采用高效液相方法測定其中菊淀粉型果聚糖8～14個糖的總質(zhì)量分數(shù)為69.72%[13]。YOs分子通式為：GF-Fn（G為葡萄糖，F(xiàn)為果糖，n=6～12），結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 YOs的結(jié)構(gòu)通式Fig.2 The structure of insulin-type oligosaccharides from yacon

1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基，東京化成工業(yè)有限公司；胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、RPMI 1640和DMEM/F12 培養(yǎng)液，美國Hyclone公司；青霉素、鏈霉素雙抗和胰蛋白酶，美國Gibco公司；DMSO，美國Sigma公司；30%H2O2，北晨方正試劑廠；MTT檢測試劑盒，北京普利萊基因技術(shù)有限公司；甲醇，北京化工廠。實驗細胞為人神經(jīng)母細胞瘤（SH-SY5Y）細胞，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院精神藥理室張有志研究員惠贈。

1.2 主要儀器

超凈工作臺，北京昌平半導(dǎo)體設(shè)備儀器廠；CO2培養(yǎng)箱，美國RS Biotech公司；倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司；電子天平，瑞士梅特勒公司；酶標儀，美國Perkin Elmer公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DPPH自由基清除能力測定[14]采用96孔板體系測定YOs對DPPH自由基清除能力，取0.177 g DPPH粉末溶于30 mL甲醇溶液中混勻，倍比稀釋100倍得到0.15 mmol/L的DPPH溶液。在96孔板，取100 μL的不同質(zhì)量濃度YOs（20，4，0.8，0.08 mg/mL）與 100 μL 0.15 mmol/L的DPPH或100 μL甲醇到孔中。在避光反應(yīng)30 min后，用酶標儀測定515 nm波長下的吸光度值。按公式（1）計算抑制率。

式中，Ac——空白的吸光度（甲醇100 μL+DPPH 100 μL）；As——樣品的吸光度（YOs 100 μL+DPPH 100 μL）；Ab——樣品空白吸光度（YOs 100 μL+甲醇 100 μL）。

以水溶性維生素E（Trolox）為陽性對照。每組設(shè)3個復(fù)孔。由回歸方程計算YOs對DPPH自由基抑制的IC50值，并以Trolox μmol/g YOs當(dāng)量表示其相對抗氧化能力。

1.3.2 ABST自由基清除能力測定[15]同樣采用96孔板體系測定YOs對ABTS自由基清除能力，將7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液按1∶1體積比混合，混合后的ABTS工作液室溫避光放置12～16 h.使用前用PBS溶液（pH 7.4）調(diào)整ABTS工作液在734 nm 波長下的吸光度值達到（0.700±0.020），取 10 μL的不同質(zhì)量濃度 YOs（20，4，0.8，0.08 mg/mL）與 200 μL 調(diào)整后的ABTS工作液于96孔板中，輕輕混勻，反應(yīng)6 min后，用酶標儀測定734 nm波長處的吸光度值。每組設(shè)3個復(fù)孔，與DPPH試驗中相同的抑制率公式計算ABTS抑制率，求得對ABTS自由基抑制的IC50值，并以Trolox μmol/g YOs當(dāng)量表示其相對抗氧化能力。

1.3.3 YOs對Fe3+還原能力 參考文獻[16]方法，通過 Fe3+還原試驗（Ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）評價 YOs的抗氧化活性。取 0.3 mol/L醋酸鈉緩沖液，10 mmol/L TPTZ溶液，20 mmol/L氯化鐵溶液按體積比10∶1∶1混合配制FRAP 工作液，取不同質(zhì)量濃度 YOs（50～200 μg/mL）0.1 mL，與 3 mL FRAP工作液和0.3 mL雙蒸水混勻，37℃水浴下反應(yīng)10 min，于593 nm波長處測定吸光度值，每組設(shè)3個平行對照，同法用FeSO4標準溶液（0.1～0.8 mmol/L）繪制標準曲線，選擇在標準曲線內(nèi)的數(shù)值計算YOs還原能力，以FRAP 值表示。1 FRAP 單位=1 mmol/L FeSO4，即每克樣品的抗氧化能力相當(dāng)于FeSO4的mmol數(shù)值，mmol Fe+2/g。

（3）缺乏主管部門主持協(xié)調(diào)。各平臺缺乏協(xié)調(diào)，各自為政，不能聯(lián)合建設(shè)，項目多和全，建設(shè)重點不突出。致使學(xué)科基礎(chǔ)、專業(yè)類實驗項目大同小異，低層次重復(fù)建設(shè)現(xiàn)象嚴重，資源浪費。

1.3.4 H2O2致SH-SY5Y細胞損傷模型建立 SHSY5Y培養(yǎng)液為DMEM/F12培養(yǎng)基（10%FBS+青霉素 100 U/mL+鏈霉素 100 U/mL，pH 7.4）。取對數(shù)生長期的SH-SY5Y 細胞，以1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，待細胞融合度到70%～80%，棄去培養(yǎng)液，加入含有不同濃度 H2O2（100～600 μmol/L）培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h，觀察H2O2對SHSY5Y細胞活力的影響。每組設(shè)6個復(fù)孔，用MTT法檢測吸光度值，并以對照組計算相對細胞活力。細胞活力計算公式：相對細胞活力=（OD處理-OD空白）/（OD對照-OD空白）×100%。

1.3.5 YOs對H2O2損傷SH-SY5Y細胞的影響取 對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，以1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，待細胞融合度達到70%～80%，換入含有 YOs（0.1～1 mg/mL）的培養(yǎng)液培養(yǎng) 12 h，更換含有200 μmol/L H2O2的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h（參考1.3.4節(jié)的結(jié)果），用MTT法觀察YOs對H2O2損傷SH-SY5Y細胞的保護作用。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標準差表示，數(shù)據(jù)應(yīng)用軟件GraphPad Prism 5.0版本分析，自由基清除試驗采用非線性回歸（Nonlinear regression）方程計算，細胞保護試驗采用單因素方差分析（one-way ANOVA）Dunnett’s t-test檢驗進行多組間比較，P<0.05認為有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 YOs的體外抗氧化能力

DPPH自由基是具有在波長517 nm處有特征吸收的穩(wěn)定人工自由基，利用這一原理，DPPH自由基清除試驗廣泛用于各種樣品的體外抗氧化活性評價。本研究中，YOs在0.8～20 mg/kg范圍內(nèi)，濃度依賴性的抑制DPPH自由基。不同質(zhì)量濃度的YOs和陽性對照Trolox對DPPH自由基的抑制率見表1。由非線性回歸方程計算YOs對DPPH自由基的IC50為（0.272±0.078）mg/mL，相當(dāng)于（141.01±15.67）Trolox μmol/g YOs（見表3）。

與DPPH自由基類似，ABTS是另一種常用于抗氧化活性評價的人工合成自由基。ABTS試驗顯示，YOs對ABTS自由基的抑制作用弱于DPPH自由基，不同質(zhì)量濃度的YOs和陽性對照Trolox對ABTS自由基的抑制率見表2。由非線性回歸方程計算YOs對ABTS自由基的IC50為（2.67±0.89）mg/mL，相當(dāng)于（195.81±8.13）Trolox μmol/g YOs（見表3）。

表1 YOs對DPPH自由基的抑制率Table1 The DPPH radical inhibition rate of YOs

表2 YOs對ABTS自由基的抑制率Table2 The ABTS radical inhibition rate of YOs

FRAP試驗是利用抗氧化劑可以將Fe3+-TPTZ復(fù)合物氧化成Fe2+-TPTZ復(fù)合物，此過程伴隨顏色變化的原理來評價抗氧化活性。FeSO4（0.1～0.8 mmol/L）標準曲線見圖3，根據(jù)線性回歸方程（y=0.7906x-0.0014，R2=0.9999）計算 YOs的FRAP值為（10.12± 0.35）mmol/g，相當(dāng)于（82.40± 1.59）Trolox μmol/g YOs（見表3）。

2.2 H2O2對SH-SY5Y細胞活力的影響及YOs保護作用

SH-SY5Y細胞經(jīng)過H2O2處理后胞體變圓，貼壁能力降低，數(shù)量減少。H2O2在100～600 μmol/L濃度范圍內(nèi)濃度依賴性降低SH-SY5Y細胞活力，見圖4。其中200 μmol/L H2O2孵育12 h后，使細胞活力降低至對照組的74.82%，損傷強度適合藥效學(xué)及藥物機制的研究，與文獻[17]報道一致。因此在進一步的細胞保護試驗中采用此損傷條件制備H2O2損傷模型。

圖3 FRAP試驗中FeSO4標準曲線Fig.3 The standard curve of FeSO4in FRAP assay

細胞試驗結(jié)果顯示，YOs（0.1～1 mg/mL）可濃度依賴性的逆轉(zhuǎn)H2O2（200 μmol/L）對SH-SY5Y的損傷，其中YOs在0.5，1 mg/mL質(zhì)量濃度時對SH-SY5Y細胞的保護作用具有顯著性（見圖5），提示YOs對于SH-SY5Y細胞的氧化應(yīng)激損傷具有神經(jīng)保護作用。

表3 YOs的體外抗氧化活性Table3 Antioxidant activities of YOs

圖4 H2O2對SH-SY5Y細胞的損傷作用Fig.4 Injured effect of different concentration H2O2 on SH-SY5Y cells

圖5 YOs對H2O2所致SH-SY5Y細胞損傷的保護作用Fig.5 Cytoprotective effect of YOs on H2O2 treated SH-SY5Y cells

3 討論

大腦衰老及相關(guān)神經(jīng)退行性疾病病理機制復(fù)雜，至今不明，目前公認的始動因素為大腦衰老過程中，腦內(nèi)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化增加，引起炎癥和纖維蛋白沉積。體內(nèi)外研究均表明，多種天然抗氧化劑具有很好的防治腦老化作用，對抗氧化應(yīng)激損傷可能是其發(fā)揮效應(yīng)的重要機制之一[8]。

本研究通過DPPH，ABTS和FRAP中3個體外試驗評價YOs的抗氧化活性，結(jié)果表明YOs具有較好的清除DPPH和ABTS自由基作用和Fe3+還原能力。SH-SY5Y細胞是一種分化程度較低的腫瘤細胞，其形態(tài)、生理和生化功能與正常神經(jīng)細胞十分相近，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制和治療藥物篩選的研究。本試驗采用H2O2損傷SH-SY5Y細胞模型，模擬高活氧狀態(tài)的氧化應(yīng)激損傷。 YOs（0.5，1 mg/mL）對這種損傷具有明顯的逆轉(zhuǎn)作用。綜上，YOs對抗細胞氧化應(yīng)激損傷作用與其體外抗氧化活性相一致。

近年來，研究表明腸道微生態(tài)可以通過神經(jīng)途徑、內(nèi)分泌途徑和免疫途徑影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，改善腸道微生態(tài)環(huán)境可以改善腦衰老過程及神經(jīng)退行性疾病的腦代謝及行為[18]。前期研究發(fā)現(xiàn)YOs改善認知與抗抑郁樣行為作用可能與其益生元作用有關(guān)[13]。本研究結(jié)果表明，YOs對H2O2所致的類神經(jīng)細胞的氧化應(yīng)激損傷具有明顯的保護作用，這一作用可能與其典型的益生元作用相互促進，共同發(fā)揮防治腦老化及相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的作用。綜上所述，雪蓮果及其所含的菊淀粉性低聚果糖可能成為抗腦老化的明星食品及功能因子。