劉四衛(wèi) 崔 玥 孫元元 胡 晶 張文睿 曹孟儒

肺癌嚴重威脅著人類的生命和健康，非小細胞肺癌(NSCLC)占所有確診肺癌的85%，NSCLC患者整體5年生存率低于15%[1]。腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是直接導(dǎo)致肺癌治療失敗和患者死亡的主要原因之一[2]。因此尋找治療的新靶點，對于肺癌的防治具有重要意義。叉頭框蛋白D3(Forkhead box D3，F(xiàn)OXD3)是FOX家族的重要成員之一，叉頭框(FOX)蛋白家族是一類具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。FOXD3在FOX家族中具有獨特的叉頭結(jié)構(gòu)域，不僅起著轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用，也可以作為轉(zhuǎn)錄激活因子[3]。

據(jù)報道，F(xiàn)OXD3在黑色素瘤、胃癌和神經(jīng)母細胞瘤中均呈低表達，抑制腫瘤生長和侵襲。然而，與這些發(fā)現(xiàn)相反，F(xiàn)OXD3在腎癌和子宮內(nèi)膜癌中表達上調(diào)，表現(xiàn)出致癌作用[4-6]。因此，F(xiàn)OXD3可能在人類腫瘤中表現(xiàn)出表達模式和功能的組織特異性。值得注意的是，F(xiàn)OXD3在肺癌中的表達及其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用仍有待進一步研究。因此本研究將對FOXD3在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制進行研究，為FOXD3作為肺癌的治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

肺癌細胞A549購自上海中國科學院細胞庫；1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；青霉素&鏈霉素雙抗購自上海碧云天公司；FOXD3載體、PCDNA3.1載體、MTT試劑盒、DMSO試劑、Transwell小室購自Costar公司；TRIzol購自Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒購自TransGenBiotech公司；Real-time PCR試劑盒、DNA合成引物購自蘇州金唯智生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫表達分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載腫瘤表達譜數(shù)據(jù)對FOXD3在腫瘤中的表達情況進行分析。進一步對比數(shù)據(jù)庫中腫瘤組織以及癌旁正常組織中FOXD3的表達水平。

1.2.2 GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)數(shù)據(jù)庫生存分析 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析FOXD3的高低表達對腫瘤的總體生存期(Overall survival)的影響。

1.2.3 STRING數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò) 在數(shù)據(jù)庫中查找已有證據(jù)表明與FOXD3有直接相關(guān)性的蛋白質(zhì)、有文獻支持與FOXD3有相關(guān)性的蛋白質(zhì)以及預(yù)測可能與FOXD3有相關(guān)性的蛋白質(zhì)。

1.2.4 Gene Ontology功能富集分析 功能富集是通過在線數(shù)據(jù)庫Metascape(http：//metascape.org/)分析，并對富集結(jié)果進行超幾何檢驗分析。P<0.05認為具有統(tǒng)計學意義。

1.2.5 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)肺癌細胞(A549)。其培養(yǎng)基中含1%的青-鏈霉素雙抗。細胞在37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)瓶中細胞長到80%時傳代，細胞常規(guī)換液。

1.2.6 細胞轉(zhuǎn)染 按照轉(zhuǎn)染試劑比例進行預(yù)實驗，通過熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，確定最佳轉(zhuǎn)染試劑比例，然后正式進行實驗。操作方法：選取生長狀態(tài)良好的細胞，在六孔板中每孔加入30萬細胞，轉(zhuǎn)染前觀察細胞狀態(tài)，待培養(yǎng)到細胞融合度達80%后轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染FOXD3質(zhì)粒的A549細胞為實驗組(A549 FOXD3)，轉(zhuǎn)染PCDNA3.1質(zhì)粒的A549細胞為對照組(A549 CTRL)，轉(zhuǎn)染用無血清培養(yǎng)基，以2 μg質(zhì)粒：10 μL的1X PEI進行轉(zhuǎn)染，8 h后換成含有血清的正常培養(yǎng)基，24 h后通過熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率=視野中綠色熒光細胞數(shù)/視野細胞總數(shù)×100%。

1.2.7 Real-time PCR實驗 檢測實驗組和對照組FOXD3 mRNA的表達量，具體方法為：收集轉(zhuǎn)染FOXD3質(zhì)粒的A549實驗組細胞和轉(zhuǎn)染PCDNA3.1質(zhì)粒的A549對照組細胞，然后分別加入1 mLTrizol，震蕩混勻，按照提取細胞RNA試劑盒操作說明提取RNA，按照cNDA合成試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄RNA得到cDNA，按照RT-PCR相關(guān)操作說明擴增cDNA。引物為FOXD3，序列為，F(xiàn)OXD3-F：5′-ATGACCTCTCCGGCGGCGG-3′，F(xiàn)OXD3-R：5′CTATTGCGCCGGCCATTTGGCT-3′。內(nèi)參為TUBULIN，得到CQ值，統(tǒng)計分析實驗結(jié)果。

1.2.8 MTT細胞增殖實驗 用胰酶將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的實驗組細胞和對照組細胞消化，稀釋細胞后用細胞計數(shù)板計數(shù)，得出細胞總數(shù)，然后在96孔板中每孔加入1 500個細胞，每組細胞做5個復(fù)孔，鋪板后4 h待細胞貼壁，然后檢測0 h細胞數(shù)，以后每隔24 h檢測一次細胞數(shù)。檢測方法為：每孔加入20 μL MTT，培養(yǎng)箱中孵育4 h后，小心吸取孔中液體后加入150 μL DMSO，酶標儀檢測細胞在波長為570 nm時的吸光度。細胞增殖實驗重復(fù)三次以上且趨勢穩(wěn)定。

1.2.9 細胞劃痕實驗 六孔板中A549細胞分別轉(zhuǎn)染PCDNA3.1和FOXD3質(zhì)粒后，待細胞數(shù)長到90%，用10 μL槍頭沿著直尺垂直劃線，標記選取位置并拍照，隨后細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察細胞遷移情況并拍照，每次拍照前將培養(yǎng)基換成PBS，拍完照換回常規(guī)培養(yǎng)基。實驗重復(fù)三次以上且趨勢穩(wěn)定。

1.2.10 Transwell細胞遷移實驗 在24孔板中，分別用無血清培養(yǎng)基將4萬個轉(zhuǎn)染PCDNA3.1質(zhì)粒的A549細胞和轉(zhuǎn)染FOXD3質(zhì)粒的A549細胞懸浮，然后分別加到Transwell小室的聚碳酸酯膜上，膜上為500 μL細胞懸液，膜下為750 μL有血清的正常培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)22 h，然后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，清水清洗結(jié)晶紫，用棉棒將小室內(nèi)膜擦拭干凈。觀察細胞遷移情況并拍照。

1.2.11 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析所得數(shù)據(jù)，MTT細胞增殖實驗中對每組實驗每個復(fù)孔進行OD570重復(fù)測量取均值，并將實驗組和對照組數(shù)據(jù)標準化，實驗組和對照組不同時間點的OD值的比較采用重復(fù)測量方差分析。Transwell 細胞遷移實驗結(jié)果中兩組樣本的均數(shù)比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXD3在多種腫瘤中的表達情況

通過TCGA數(shù)據(jù)庫比對腫瘤組織與正常組織中FOXD3的轉(zhuǎn)錄水平。表達差異結(jié)果顯示，共有28種癌癥有差異表達，其中FOXD3在10種腫瘤中表達上調(diào)，在皮膚黑色素瘤(SKCM)的表達具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(圖1)，而在18種腫瘤中FOXD3表達下調(diào)，表達有統(tǒng)計學差異(P<0.05)的有結(jié)腸癌(COAD)、直腸腺癌(READ)、睪丸生殖細胞癌(TGCT)(圖2)。

2.2 腫瘤中FOXD3表達情況與患者總生存期關(guān)系

利用數(shù)據(jù)庫GEPIA在多種腫瘤中對FOXD3的表達與患者總生存期進行分析，結(jié)果顯示在肺鱗癌(LUSC)、皮膚黑色素瘤(SKCM)、腎上腺皮質(zhì)瘤(ACC)以及低分化膠質(zhì)瘤(LGG)4種腫瘤中FOXD3的差異表達與患者總生存期有關(guān)(P<0.05)(圖3)。

2.3 FOXD3抑制肺癌細胞生長

前期研究發(fā)現(xiàn)FOXD3對肺鱗癌患者預(yù)后產(chǎn)生影響，為了驗證FOXD3在肺鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，隨后在96孔板中做MTT細胞增殖實驗。實驗結(jié)果顯示從24 h開始出現(xiàn)趨勢，72 h差異最顯著且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染FOXD3質(zhì)粒的A549細胞增殖能力弱于轉(zhuǎn)染PCDNA3.1質(zhì)粒的A549細胞，表明FOXD3能夠抑制肺癌細胞的增殖能力(圖4)。

圖1 FOXD3在腫瘤中表達上調(diào)Figure 1 The expression of FOXD3 was upregulated in tumor tissuesNote：T for tumor tissue；N for normal tissue；* P<0.05，when compared with the normal tissues.

圖2 FOXD3在腫瘤中表達下調(diào)Figure 2 The expression of FOXD3 was downregulated in tumor tissuesNote：T for tumor tissue；N for normal tissue；* P<0.05，when compared with the normal tissues.

圖3 FOXD3表達與總生存期之間的關(guān)系Figure 3 The relationship between FOXD3 expression and overall survival

2.4 FOXD3抑制肺癌細胞遷移

為了明確FOXD3對肺癌細胞A549遷移能力的影響，在初始劃痕區(qū)域一致的情況下，分別在培養(yǎng)0 h、24 h后觀察實驗組和對照組細胞生長情況，實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染FOXD3質(zhì)粒的A549細胞的遷移速度明顯慢于轉(zhuǎn)染PCDNA3.1質(zhì)粒的A549細胞，Transwell結(jié)果表明轉(zhuǎn)染FOXD3質(zhì)粒的A549細胞遷移能力明顯弱于轉(zhuǎn)染PCDNA3.1質(zhì)粒的A549細胞。以上研究結(jié)果表明FOXD3抑制肺癌細胞A549遷移能力(圖5)。

圖4 FOXD3對A549細胞的增殖能力的影響Figure 4 The effect of FOXD3 on proliferation of A549 cellsNote：A.The expression of FOXD3 was examined in over-expressed FOXD3 A549 cells by RT-qPCR.The expression of FOXD3 was increased when compared to the control A549 cells(*** P<0.001)；B.Cell viability was examined in A549 cells by MTT assay.The cell viability of control A549 cells was increased when compared to overexpressed FOXD3 A549 cells(* P<0.05).

圖5 FOXD3對A549細胞遷移的影響Figure 5 The effect of FOXD3 on migration of A549 cellsNote：A.Migration ability of different cancer cells was detected by wound healing assay；B.The wound healing ability of A549 FOXD3 was weaker than that of A549 CTRL cells(***P<0.001)；C.The number of migration in the control and experimental groups(100×)；D.The statistical results of transwell assay between A549 CTRL and A549 FOXD3 cells.The migration ability of A549 FOXD3 was decreased when compared to the control A549 cells(** P<0.01).

2.5 FOXD3相互作用蛋白質(zhì)的預(yù)測以及功能富集分析

為了進一步研究FOXD3可能參與的信號通路，我們通過在STRING數(shù)據(jù)庫中對FOXD3參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行預(yù)測，分析結(jié)果顯示以FOXD3為中心參與多種基因的表達調(diào)控。例如，F(xiàn)OXD3與SOX2、POU5F1、NANOG等多種蛋白質(zhì)相互作用，隨后并對其進行功能富集分析，結(jié)果顯示相關(guān)蛋白質(zhì)功能主要在激活細胞增殖有關(guān)基因，且具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖6)。

圖6 FOXD3互作蛋白質(zhì)Figure 6 FOXD3 interacts with other proteins

3 討論

全國惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢，其中肺癌在惡性腫瘤中的死亡率位于首位。由于其預(yù)后差，死亡率高，給社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔[7]。

到目前為止，F(xiàn)OXD3在腫瘤中的研究還不太深入。據(jù)報道FOXD3直接與miR-137啟動子結(jié)合，激活其轉(zhuǎn)錄，通過AKT2途徑抑制人肝癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移[8]；FOXD3缺陷能誘導(dǎo)乳腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化并與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[9]；在胃癌中，幽門螺桿菌感染是導(dǎo)致胃癌發(fā)生的重要因素，感染幽門螺桿菌會導(dǎo)致FOXD3的高甲基化，使FOXD3表達減少，胃癌發(fā)生機會增加，并且FOXD3過表達會使CYFIP2和RARB的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，進而抑制細胞增殖[4]。然而有研究發(fā)現(xiàn)FOXD3表達低是胃癌的有利預(yù)后因素[10]。此外，F(xiàn)OXD3通過EGFR-Ras-Raf-MEK-ERK信號通路抑制結(jié)腸癌細胞增殖[11]。

本研究對FOXD3在多種腫瘤中的表達情況進行了全面總結(jié)，發(fā)現(xiàn)FOXD3在多種腫瘤中都存在差異性表達；同時也分析了FOXD3對腫瘤患者總生存期的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXD3的差異表達對肺癌患者的總生存期產(chǎn)生影響。因此我們在肺癌中對FOXD3基因進行深入研究，首先構(gòu)建FOXD3過表達肺癌細胞系，隨后進行了細胞增殖和遷移侵襲相關(guān)實驗，實驗結(jié)果顯示FOXD3抑制肺癌細胞增殖以及遷移侵襲能力。最后本研究通過在STRTNG數(shù)據(jù)庫中對FOXD3參與的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)FOXD3與POU5F1、SOX2、NANOG等多種蛋白質(zhì)存在明確的相互作用。并對這四個基因進行GO功能富集分析。結(jié)果顯示功能主要富集到細胞增殖上，且有統(tǒng)計學意義。POU5F1是POU轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在胚胎發(fā)育和干細胞多能性中起關(guān)鍵作用。該基因在組織中的異常表達與腫瘤發(fā)生有關(guān)。例如在結(jié)腸癌中POU5F1低表達患者在根治性手術(shù)切除后無病生存率高，POU5F1被認為是結(jié)腸癌患者的預(yù)后因素[13]。POU5F1在肺癌中也有相關(guān)報道，研究發(fā)現(xiàn)肺癌的放射抗性與AKT-Onzin-POU5F1軸相關(guān)[14]。SOX2是SRY相關(guān)HMG-box(SOX)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中干細胞維持所必需的，同時還參與胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)。研究表明SOX2與多種惡性腫瘤進展有關(guān)，例如，SOX2的異位表達逆轉(zhuǎn)了人膀胱癌細胞中ChlA-F對細胞侵襲能力的抑制，ChlA-F處理誘導(dǎo)HuR蛋白表達，并且增加的HuR與USP8 mRNA相互作用，導(dǎo)致USP8 mRNA穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)表達的升高，升高的USP8隨后充當E3連接酶以促進SOX2泛素化和蛋白質(zhì)降解；而且ChlA-F處理顯著增加Ser63和Ser73的c-Jun磷酸化，啟動miR-200c轉(zhuǎn)錄，增加的miR-200c直接結(jié)合SOX2 mRNA的3′-UTR以抑制SOX2蛋白翻譯[15]。尼古丁是煙草煙霧的成癮成分，不能引發(fā)腫瘤，但可以促進體外細胞的增殖、遷移和侵襲，促進體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。有研究已證實尼古丁可以誘導(dǎo)胚胎干細胞因子SOX2的表達，這是非小細胞肺癌細胞中自我更新和維持干細胞特性必不可少的[16]。此外，在肺癌中，SOX2與CtBP1的相互作用可以促進肺腺癌的生長，遷移和侵襲[17]。

綜上所述，通過對FOXD3進行互作蛋白預(yù)測將為FOXD3的后續(xù)研究指明了方向并提供了理論依據(jù)。