劉爾鈺 楊 昊 梁國(guó)華 趙晏方 趙文輝

雌激素受體陽(yáng)性(ER+)乳腺癌是最常見(jiàn)的乳腺癌亞型，內(nèi)分泌治療是該亞型乳腺癌的主要治療方法，并且可將復(fù)發(fā)的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)降低約40%[1-2]。但輔助內(nèi)分泌治療的中位無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)僅為9～12個(gè)月，大多數(shù)患者會(huì)面臨病情進(jìn)展[3-5]。通過(guò)對(duì)ER+乳腺癌信號(hào)傳導(dǎo)通路的進(jìn)一步探索，研究出大量的靶向抗腫瘤藥物。通過(guò)靶向PI3K-AKT-mTOR和CDK-RB-E2F通路，研究出mTOR抑制劑和CDK4/6抑制劑。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在控制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、生存、mRNA轉(zhuǎn)錄、代謝和自噬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要作用[6]。而mTOR抑制劑通過(guò)破壞mTOR的結(jié)構(gòu)完整性，削弱mTOR與相關(guān)調(diào)控蛋白的聯(lián)系，阻斷下游與相關(guān)激酶的相互作用來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。CDK4/6抑制劑可以靶向抑制CDK激酶，抑制E2F轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[8-10]。大量臨床研究結(jié)果顯示mTOR抑制劑治療ER+乳腺癌時(shí)，患者PFS有所提高[11-13]。CDK4/6抑制劑因聯(lián)合內(nèi)分泌治療的成效，F(xiàn)DA加速批準(zhǔn)其進(jìn)入臨床[14]。而近期研究的重點(diǎn)在兩藥聯(lián)合的抗腫瘤作用，在前臨床階段取得了不錯(cuò)的成績(jī)，下面簡(jiǎn)單介紹聯(lián)合用藥的機(jī)制。

1 mTOR抑制劑和CDK4/6抑制劑聯(lián)合對(duì)CDK-RB-E2F通路的影響

Vistusertib(AZD2014)是mTORC1和mTORC2底物磷酸化的抑制劑，而everolimus(RAD001)是mTORC1抑制劑，palbociclib(PD-0332991)是靶向CDK4/6抑制劑[15-16]。在小鼠試驗(yàn)中，為了檢測(cè)vistusertib(AZD2014)聯(lián)合palbociclib(PD-0332991)在體內(nèi)的效用，palbociclib(PD-0332991)和vistusertib(AZD2014)在各自的推薦劑量(RDE)下聯(lián)合使用，在第22天評(píng)估療效時(shí)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥比單藥抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用更強(qiáng)(palbociclib聯(lián)合vistusertib：106.4%vs. vistusertib：46.5%vs. palbociclib：7.0%)[13]。但palbociclib(PD-0332991)或vistusertib(AZD2014)單獨(dú)使用時(shí)，無(wú)論是最大耐受劑量(MTD)或者RDE，均無(wú)法達(dá)到完全抑制細(xì)胞增殖的作用，而當(dāng)聯(lián)合用藥時(shí)，第5天就可以觀察到細(xì)胞增殖的完全抑制，證明二者聯(lián)合存在協(xié)同效應(yīng)[13]。在everolimus(RAD001)聯(lián)合palbociclib(PD-0332991)使用時(shí)也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果[13]。通過(guò)對(duì)聯(lián)合用藥時(shí)兩個(gè)信號(hào)通路的交互作用進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，vistusertib(AZD2014)可以防止palbociclib治療時(shí)cyclin D1的升高[13]。其次，vistusertib(AZD2014)可以降低視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)磷酸化，并在聯(lián)合CDK4/6抑制劑時(shí)進(jìn)一步降低[13]。通過(guò)測(cè)定RB的磷酸化可以鑒定這一結(jié)果，結(jié)果是CDK4/6抑制劑和mTORC1/2抑制劑聯(lián)合時(shí)對(duì)RB磷酸化的抑制作用大于單獨(dú)用藥[13]。最后，觀察到vistusertib(AZD2014)和palbociclib(PD-0332991)均使編碼E2F的基因的mRNA下調(diào)，并在聯(lián)合治療中進(jìn)一步下調(diào)，在用藥后6 h和24 h內(nèi)就可觀察到此反應(yīng)，表明E2F轉(zhuǎn)錄直接受抑制，而不是通過(guò)細(xì)胞周期抑制間接影響基因表達(dá)[13]。E2F轉(zhuǎn)錄因子家族的功能是復(fù)雜的，在靜止期或G1早期，一些成員充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活因子，而另一些成員充當(dāng)轉(zhuǎn)錄抑制因子，一些E2F轉(zhuǎn)錄因子也被認(rèn)為是細(xì)胞周期后期的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[17]。因此，E2F介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制可能是復(fù)雜的，涉及多個(gè)調(diào)控機(jī)制。但無(wú)論是對(duì)mTOR通路或CDK-RB-E2F通路的抑制都會(huì)抑制E2F因子的轉(zhuǎn)錄和使進(jìn)入S期所需基因的表達(dá)降低。遂當(dāng)聯(lián)合兩藥使用時(shí)，可以最大化實(shí)現(xiàn)對(duì)E2F介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的抑制。也有報(bào)道CDK4/6抑制劑可以促進(jìn)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)的激活，誘導(dǎo)mTOR和AKT蛋白磷酸化水平的劑量依賴性上調(diào)[18-19]。所以mTOR抑制劑和CDK4/6抑制劑聯(lián)合使用可以進(jìn)一步抑制CDK-RB-E2F通路活性來(lái)控制腫瘤細(xì)胞的增殖。

2 mTOR抑制劑和CDK4/6抑制劑聯(lián)合對(duì)細(xì)胞周期的影響

雖然這兩種藥物都誘導(dǎo)了細(xì)胞周期阻滯，但palbociclib(PD-0332991)誘導(dǎo)細(xì)胞形成“大扁平細(xì)胞”的細(xì)胞形態(tài)并增加β-半乳糖苷酶活性，誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)衰老樣表型，細(xì)胞衰老在腫瘤中的作用是復(fù)雜的，并且受到細(xì)胞自主和細(xì)胞非自主效應(yīng)的調(diào)節(jié)[20]。為了進(jìn)一步確定mTORC1/2抑制劑和CDK4/6抑制劑的聯(lián)合是否會(huì)加重細(xì)胞出現(xiàn)衰老樣表型，但研究發(fā)現(xiàn)vistusertib(AZD2014)并沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞的大扁平形態(tài)學(xué)改變，而是使細(xì)胞變小[21-23]。同時(shí)研究表明單獨(dú)使用vistusertib(AZD2014)或palbociclib(PD-0332991)都可以減慢細(xì)胞的生長(zhǎng)。但相比之下，vistusertib(AZD2014)和palbociclib(PD-0332991)的聯(lián)合使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的完全性生長(zhǎng)停滯，并且至少維持24天[20]。所以最終證實(shí)CDK4/6抑制劑在誘導(dǎo)細(xì)胞衰老表型中的作用，也證明CDK4/6抑制劑與mTORC1/2抑制劑的聯(lián)合并不會(huì)導(dǎo)致衰老樣表型的加重，而是會(huì)使細(xì)胞進(jìn)入長(zhǎng)時(shí)間的停滯狀態(tài)。

3 mTOR抑制劑和CDK4/6抑制劑聯(lián)合對(duì)雌激素受體與染色質(zhì)結(jié)合的影響

雌激素受體(ER)可以通過(guò)多種機(jī)制來(lái)調(diào)控乳腺癌信號(hào)通路的傳導(dǎo)[17-24]。其中PI3K通路和ER信號(hào)通路之間的交叉作用已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[25-27]。Herrera-Abreu和她的同事之前還報(bào)道了PI3K抑制劑、fulvestrant、palbociclib(PD-0332991)的三重聯(lián)合治療乳腺癌時(shí)，可以顯著減少腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)[28]。為了研究mTORC1/2抑制劑是否直接影響ER與染色質(zhì)的結(jié)合，用差異分析來(lái)檢測(cè)該結(jié)果，結(jié)果顯示：在23 537個(gè)ER結(jié)合位點(diǎn)中只有37個(gè)ER結(jié)合位點(diǎn)受到everolimus(RAD001)的影響，而在vistusertib(AZD2014)治療中沒(méi)有檢測(cè)到受影響的結(jié)合位點(diǎn)[13]。該分析表明，mTOR抑制劑不會(huì)影響ER與染色質(zhì)的結(jié)合，也不會(huì)通過(guò)ER下游的機(jī)制影響ER介導(dǎo)的生長(zhǎng)。但ER信號(hào)通路可以激活CCND1(編碼cyclinD1的基因)啟動(dòng)子，ER+乳腺癌中cyclinD1呈高水平表達(dá)[29-31]。并且有報(bào)道指出cyclinD1具有結(jié)合并促進(jìn)ER轉(zhuǎn)錄活性的作用[29-31]。所以CDK4/6抑制劑、內(nèi)分泌藥物二者聯(lián)合治療ER+乳腺癌時(shí)，可以起到協(xié)同治療的效用。并且有研究發(fā)現(xiàn)vistusertib(AZD2014)、palbociclib(PD-0332991)和fulvestrant三者聯(lián)合治療ER+乳腺癌時(shí)，可以觀察到生長(zhǎng)抑制作用(48天腫瘤生長(zhǎng)抑制率為110.2%)，提示三組聯(lián)合治療乳腺癌可以起到更強(qiáng)效的作用[13]。

4 mTOR抑制劑和CDK4/6抑制劑聯(lián)合對(duì)CDK4/6耐藥細(xì)胞的影響

臨床試驗(yàn)研發(fā)的靶向治療藥物的主要限制是其暫時(shí)處于臨床試驗(yàn)階段，是短期內(nèi)抑制腫瘤的生長(zhǎng)，存在早期適應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，并可以通過(guò)多種機(jī)制產(chǎn)生耐藥[32-33]。為了進(jìn)一步了解細(xì)胞耐藥后原傳導(dǎo)通路的變化，將對(duì)palbociclib(PD-0332991)耐藥的細(xì)胞群分成10個(gè)組，隨機(jī)選擇其中4個(gè)組來(lái)評(píng)估RB磷酸化和E2F轉(zhuǎn)錄水平，并檢測(cè)CDK是否存在突變。該結(jié)果顯示，palbociclib(PD-0332991)耐藥細(xì)胞株保留了不同水平的RB磷酸化和E2F轉(zhuǎn)錄活性，并且在耐藥株中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CDK4或者CDK6的突變[13]。所以在發(fā)生CDK4/6抑制劑耐藥時(shí)，細(xì)胞重新啟動(dòng)CDK-RB-E2F通路。研究進(jìn)一步表明，當(dāng)vistusertib(AZD2014)治療該耐藥細(xì)胞時(shí)，仍然可以抑制RB磷酸化，降低E2F依賴性基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[13]。因此，在腫瘤細(xì)胞對(duì)palbociclib(PD-0332991)產(chǎn)生耐藥的情況下，vistusertib(AZD2014)仍能夠調(diào)節(jié)CDK-RB-E2F軸，從而控制細(xì)胞增殖。表明mTOR抑制劑對(duì)palbociclib(PD-0332991)治療后復(fù)發(fā)的患者有益。

5 mTOR抑制劑和CDK4/6抑制劑聯(lián)合對(duì)自噬的影響

CyclinD-CDK4/6復(fù)合物可以促進(jìn)TSC2的磷酸化，從而增加mTORC1的活性(圖1)[34]。而在腫瘤細(xì)胞中PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的持續(xù)活躍會(huì)抑制自噬的發(fā)生。所以CDK4/6抑制劑可以間接抑制mTOR活性。因此，聯(lián)合抑制CDK-RB-E2F和PI3K-AKT-mTOR通路節(jié)點(diǎn)可以最大限度地抑制mTORC1活性，啟動(dòng)自噬的發(fā)生。自噬是回收受損細(xì)胞器所必需的。所以當(dāng)mTORC1受到抑制后，促進(jìn)自噬體形成。然后，自噬體吞噬細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器并與溶酶體融合，在溶酶體中，細(xì)胞成分被降解，細(xì)胞被回收。自噬在腫瘤發(fā)生過(guò)程中是一把雙刃劍，既是腫瘤抑制因子，又是腫瘤細(xì)胞存活的保護(hù)劑[6]。研究發(fā)現(xiàn)缺乏自噬過(guò)程的小鼠會(huì)加速促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[34]。自噬缺陷的細(xì)胞積累蛋白質(zhì)聚集物、受損的線粒體和活性氧，這些都認(rèn)為是使DNA損傷和腫瘤發(fā)生的因素[6]。所以聯(lián)合用藥可以促進(jìn)自噬的發(fā)生。

圖1 ER+乳腺癌信號(hào)傳導(dǎo)通路Figure 1 The signal transduction pathways in ER+breast cancer

6 mTOR抑制劑和CDK4/6抑制劑聯(lián)合對(duì)能量代謝的影響

能量代謝異常也是腫瘤的標(biāo)志[37]。有研究表明[37]，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白直接參與細(xì)胞能量代謝的調(diào)控。其中CDK-RB-E2F通路參與多種代謝過(guò)程，如葡萄糖產(chǎn)生和糖酵解代謝，表明代謝反應(yīng)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)[38]。有研究表明palbociclib(PD-0332991)能使葡萄糖攝取和消耗降低約15%，與mTOR抑制劑聯(lián)合使用后，葡萄糖攝取和消耗降低25%。在CDK-RB-E2F通路中，E2F轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)抑制線粒體的有氧氧化來(lái)負(fù)性調(diào)控能量消耗，E2F還通過(guò)調(diào)節(jié)磷酸果糖激酶的表達(dá)來(lái)促進(jìn)糖酵解過(guò)程[39]。此外，在E2F下游，c-myc轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)多種機(jī)制影響腫瘤的代謝[39]。所以CDK4/6抑制劑通過(guò)抑制CDK-RB-E2F通路，抑制腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝。最近在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的研究中，結(jié)果顯示palbociclib(PD-0332991)聯(lián)合everolimus(RAD001)可以抑制糖酵解[40-42]。所以這些結(jié)果最終表明palbociclib(PD-0332991)聯(lián)合mTOR抑制劑通過(guò)抑制葡萄糖的代謝來(lái)提高palbociclib(PD-0332991)的療效，這為兩藥聯(lián)合抑制腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn)一步提供了理論基礎(chǔ)。

7 小結(jié)與展望

PI3K-AKT-mTOR通路和CDK-RB-E2F通路的激活促進(jìn)了腫瘤耐藥的發(fā)生，腫瘤細(xì)胞再次增殖失控。當(dāng)聯(lián)合mTOR抑制劑和CDK4/6抑制劑靶向治療ER+乳腺癌時(shí)，可以進(jìn)一步降低RB蛋白的磷酸化，抑制E2F功能，控制細(xì)胞增殖，起到抗腫瘤的作用。其次也有研究證實(shí)兩藥聯(lián)合對(duì)比單藥可以顯示出完全抑制細(xì)胞增殖的效用，進(jìn)一步控制腫瘤的生長(zhǎng)。最后通過(guò)促進(jìn)自噬的過(guò)程，進(jìn)一步控制腫瘤的形成。還有多種機(jī)制表明同時(shí)阻斷兩個(gè)通路可以發(fā)揮更大的抗腫瘤作用。因?yàn)榭茖W(xué)的進(jìn)步，我們期待更多的臨床研究來(lái)證明兩藥聯(lián)合的臨床受益率，同時(shí)也期待臨床試驗(yàn)研究?jī)伤幝?lián)合的不良反應(yīng)是否可以耐受，會(huì)不會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)的疊加。隨著對(duì)藥物作用機(jī)制更好的理解，這兩種藥物是否可以治療其他亞型乳腺癌，或者提出更優(yōu)化的組合來(lái)抑制乳腺癌的進(jìn)展，從而提高乳腺癌患者的生存和生活質(zhì)量。