夏天一 張博淼 姚克非 崔濱濱

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率在所有惡性腫瘤中分別位居第3位和第4位，且呈逐年遞增趨勢[1]，但大部分患者初次診斷結(jié)直腸癌時，病情已經(jīng)發(fā)展至中期或晚期，導(dǎo)致患者預(yù)后較差。傳統(tǒng)意義上的手術(shù)治療與化學(xué)治療取得了一定突破，但效果尚不十分理想，患者生存期仍較短，所以我們將目光聚焦于新作用靶點的發(fā)現(xiàn)。

經(jīng)學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基(Tyrosine residues，TYR)的磷酸化和去磷酸化可以調(diào)節(jié)細胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而影響腫瘤的發(fā)生進展[2]。該過程是由蛋白酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinase，PTK)和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase，PTP)共同完成的。非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶9(Protein tyrosine phosphatase non-receptor type 9，PTPN9)是蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶亞家族的成員之一，在1993年科學(xué)家于巨核細胞中發(fā)現(xiàn)[3]，又稱PTP-MEG2。近年來的研究表明PTPN9是miRNA-126的靶基因，可以通過干預(yù)磷酸肌醇通路或血管內(nèi)皮生長因子，從而介導(dǎo)腫瘤的生長侵襲[4]。在現(xiàn)有研究中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)PTPN9與多種癌癥有關(guān)，例如食管鱗癌、肝細胞癌、乳腺癌等[4-6]。本研究旨在探索PTPN9表達水平與各項臨床參數(shù)的關(guān)系，進而評價其對于結(jié)直腸癌的影響。

1 資料和方法

1.1 腫瘤標本和臨床參數(shù)

收集2007年12月—2008年12月哈醫(yī)大附屬腫瘤醫(yī)院所行根治性手術(shù)治療的146例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織，腫瘤組織經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋標本，隨機選取蠟塊，其中132例腫瘤組織，14例非腫瘤組織。病理學(xué)診斷依照第8版AJCC。所有患者隨訪至2017年12月。收集患者的臨床指標，包括年齡、性別、腫瘤部位、病理學(xué)分級、腫瘤最大徑、大體類型、分化程度、糖尿病患病情況、生存率。

1.2 免疫組化

將蠟塊切成4 μM在60℃烤箱中烘烤120 min，后用二甲苯脫蠟3次，每次10 min；再置于無水酒精中水化，濃度95%、85%、75%各5 min；將切片用PBS液洗滌3次，每次3 min，后置于3%過氧化氫中室溫下避光孵育8～10 min；然后EDTA緩沖液微波高溫抗原修復(fù)。加山羊血清封閉液，室溫下孵育15～20 min；滴加PTPN9一抗(1∶150)，4度濕盒過夜；次日，PBS液洗滌4次，每次5 min，滴加生物素標記二抗工作液，孵育15～20 min；PBS液洗滌4次，每次5 min；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37℃下孵育15～20 min；PBS液沖洗4次，每次5 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染3～5 min，脫水，透明，干燥，中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果判定

以細胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標記結(jié)果，按染色強度計分：0分為無色；1分為著色淡者；2分為著色適中者；3分為著色深者；陽性細胞占計數(shù)細胞的百分比計分：0分為<5%，1分為6%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%。將每一張片子的染色強度與染色細胞百分數(shù)相乘，其評分為最后得分。0～2分為陰性(-)，3～5分為弱陽性(+)，6～9分為中等陽性(++)，>9分為強陽性(+++)。在統(tǒng)計分析中，將表達(-/+)劃分為低表達組，將表達(++/+++)劃分為高表達組。該結(jié)果由兩位高年資病理醫(yī)生進行雙盲評分。

1.4 隨訪

自手術(shù)之日開始隨訪，采用電話等方式，隨訪截止日期為2017年12月，總生存期(Overall survival，OS)定義為手術(shù)之日到患者因任何原因死亡或截止日期的時間。

1.5 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，應(yīng)用卡方檢驗和Fisher確切概率法分析PTPN9表達水平與臨床病理資料的關(guān)系，應(yīng)用Kaplan-Meier曲線進行生存分析，用Cox比例風險模型進行多因素生存分析。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTPN9的表達水平

PTPN9蛋白在結(jié)直腸癌組織細胞中均有表達，其主要出現(xiàn)在細胞質(zhì)中，未于細胞核中發(fā)現(xiàn)陽性表達(圖1)。在腫瘤組織中，PTPN9陽性表達為50.8%，非腫瘤組織陽性表達為14.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)。

圖1 PTPN9在結(jié)直腸癌細胞中的表達情況Figure 1 Expression of PTPN9 protein in colorectal cancer tissuesNote：A.Magnification(×100)；B.Magnification(×200).

2.2 PTPN9的表達水平與臨床病理資料

分析132例結(jié)直腸癌患者組織標本，發(fā)現(xiàn)PTPN9的表達水平與患者腫瘤病理學(xué)分期(P=0.008)和糖尿病患病(P=0.022)等指標有關(guān)，而PTPN9的表達水平與患者性別、腫瘤部位、腫瘤最大徑、腫瘤大體類型、腫瘤分化程度等臨床指標無關(guān)(P>0.05)(表1)。

表1 PTPN9表達評分與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 PTPN9的表達水平與總體生存期

生存分析評估PTPN9對于患者預(yù)后的影響，觀察其表達水平變化所導(dǎo)致的總生存期差異。所有患者的隨訪時間從接受手術(shù)治療開始至死亡或失訪，時間截止至2017年12月，同時應(yīng)用Kaplan-Meier曲線對數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)高表達的PTPN9組患者其總生存期要明顯短于低表達組(P<0.001)(圖2)。通過應(yīng)用多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)PTPN9蛋白表達(HR=1.202，P<0.001)、T分期(HR=1.725，P<0.001)、N分期(HR=1.327，P=0.001)、M分期(HR=1.753，P=0.005)指標均具有統(tǒng)計學(xué)意義，為結(jié)直腸癌患者的獨立預(yù)后指標，而腫瘤病理學(xué)分期(HR=1.276，P>0.05)、糖尿病(HR=1.060，P>0.05)為危險因素，但無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

圖2 PTPN9表達強度的Kaplan-Meier曲線Figure 2 Kaplan-Meier curve of PTPN9 expression intensity

表2 結(jié)直腸癌患者總生存期影響因素的多因素Cox回歸分析

3 討論

結(jié)直腸癌現(xiàn)為全球性高發(fā)腫瘤，但以手術(shù)和化療為主的綜合治療對患者的生存期并未起到顯著的效果。對于新的治療靶點的發(fā)現(xiàn)可以讓我們對結(jié)直腸癌的早期診斷，以及后續(xù)治療打開新的思路，進而讓患者群體得到充分的受益。關(guān)于PTPN9在其他多種癌癥中已經(jīng)有了相關(guān)的報道，而對于結(jié)直腸癌方面的作用尚處于空白階段。在其他癌種中，學(xué)者們已發(fā)現(xiàn)PTPN9可以作為對患者生存期預(yù)測的獨立預(yù)后因素，而本研究結(jié)果同樣顯示在腫瘤實體部位的PTPN9表達水平要高于癌旁組織，而PTPN9的表達水平與患者N分期、M分期、腫瘤病理學(xué)階段、糖尿病、生存期等臨床參數(shù)有著顯著關(guān)聯(lián)，提示PTPN9的表達水平與腫瘤病理學(xué)分期呈現(xiàn)正相關(guān)，同時高表達者有著較短的生存期。上述結(jié)論指出PTPN9的表達水平對于結(jié)直腸癌患者的預(yù)后是獨立的預(yù)測因素。

根據(jù)以往的研究，我們可以發(fā)現(xiàn)PTPN9的功能在多種癌癥中均有研究。在肝細胞癌中，Hu等[5]的研究表明PTPN9在腫瘤組織上的表達降低，PTPN9低表達患者具有較短的生存期，相比于高表達的患者。在Hong等[6]的研究中，PTPN9在乳腺癌組織中表達水平降低，且其表達可以降低腫瘤細胞的增殖和侵襲能力。在Zhu等[4]的實驗中，PTPN9在腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達，標志著高期別的食管鱗狀細胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)。

既往研究中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)PTPN9具有腫瘤抑制功能[7]，可在上述癌種中PTPN9的功能卻表現(xiàn)出一定差異性。研究發(fā)現(xiàn)PTPN9可以直接調(diào)節(jié)p-STAT所介導(dǎo)的去磷酸化作用，進而干預(yù)JAK/STAT通路所引起的持續(xù)刺激腫瘤發(fā)生侵襲的作用，而其核心在于PTPN9的表達干預(yù)STAT3的活化[8]?；仡櫳鲜鲅芯浚瑲w納來看在不同癌癥中：(1)PTPN9的低表達可以引發(fā)STAT3的激活，從而增強腫瘤的侵襲能力[5]；(2)miR-96可以下調(diào)PTPN9的表達水平，而STAT3的持續(xù)活化又可以是miR-96的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，三者結(jié)合構(gòu)成一條雙重負反饋鏈條，進而介導(dǎo)癌癥的發(fā)生侵襲[6]；(3)miR-126的低表達可以上調(diào)PTPN9的表達水平，從而促進腫瘤細胞的發(fā)生和侵襲[4]。

在JAK/STAT通路中，STAT3為血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的調(diào)節(jié)因子，STAT3的持續(xù)上調(diào)可以促進VEGF的表達增加，進而增加腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[9-10]，PTPN9的低表達又能上調(diào)STAT3活性，與Hong，Hu等的研究結(jié)果相符合，但與本文和Zhu的研究結(jié)果相悖。查閱資料，發(fā)現(xiàn)PTPN9可以下調(diào)VEGFR2的功能和信號[11]，而VEGF和VEGFR2間存在著某種正反饋調(diào)節(jié)[12]。那是否在肝細胞癌和乳腺癌中存在著某種反饋機制，即PTPN9的低水平表達刺激STAT3的持續(xù)活化，進而上調(diào)VEGF的表達，從而增強腫瘤的惡性度，而相對在食管鱗狀細胞癌和結(jié)直腸癌中PTPN9的高表達卻抑制STAT3的活化，降低VEGF的表達強度，下調(diào)VEGFR2的功能，但這種趨勢卻并未抵消VEGF與VEGFR2之間的正反饋作用，甚至對其環(huán)路起到整體促進的作用，或CRC和ESCC中miR-126的低表達上調(diào)PTPN9的表達水平，從而促進腫瘤細胞的發(fā)生和侵襲，導(dǎo)致腫瘤的高病理學(xué)分期，但現(xiàn)尚無理論研究證明，詳細的機制仍需要進一步研究和探討。

PTPN9在現(xiàn)有研究中證實有著肝胰島素信號的拮抗作用，即PTPN9的表達水平升高，抑制了肝臟中的胰島素信號，一定程度上促進了胰島素抵抗的發(fā)生[13]，但也有觀點認為STAT3轉(zhuǎn)錄的增強，同樣對于胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生起到了促進的作用[14]。這兩種觀點與現(xiàn)所知的，關(guān)于PTPN9的低水平表達刺激STAT3的持續(xù)活化的結(jié)論不完全一致。在本文結(jié)果中，顯示隨PTPN9的表達水平升高，糖尿病的發(fā)病率也隨之升高。

綜上所述，本研究證明PTPN9對于結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生發(fā)展有著干預(yù)作用，并且高表達的PTPN9對于結(jié)直腸癌患者的預(yù)后起到預(yù)測指標的作用，PTPN9可能作為一個新的基因治療靶點用于抗擊結(jié)直腸癌，從而提高患者的生存期。同時，其可能對糖尿病的發(fā)生和治療有著提示作用，其具體機制尚需要進一步研究。