離子色譜法測(cè)定母乳中的寡聚糖與游離唾液酸

陳 磊 Philip Haselberger 田 芳 蔡小堃 毛穎異 劉 爽 趙艷榮 王 碩* 關(guān) 巖*

（1 雅培營(yíng)養(yǎng)品上海研發(fā)中心 上海 200233

2 雅培營(yíng)養(yǎng)品 美國(guó)哥倫布 OH43219

3 南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院 天津 300350）

母乳寡聚糖（Human milk oligosaccharides，HMOs）是母乳中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與活性成分[1]。母乳寡聚糖不僅能抑制嬰兒腸道內(nèi)有害菌的粘附能力，提高嬰兒免疫力[2]，還能促進(jìn)腸道內(nèi)益生菌的生長(zhǎng)，改善胃腸道微生態(tài)[3-5]。母乳中的寡聚糖約有200多種，可定量分析的約有30多種[6-7]。HMOs按照單糖組成可分為3類(lèi)：巖藻糖基化的中性HMOs，非巖藻糖基化的中性HMOs與唾液酸化的酸性HMOs。其中3-巖藻糖基乳糖（3-fucosyllactose，3-FL）與 2’-巖藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）、乳糖-N-新四糖（lacto-N-neotetraose，LNnT）與乳糖-N-四糖（lacto-N-tetraose，LNT）、6’-唾液酸乳糖（6’-sialyllactose，6’-SL）與 3’-唾液酸乳糖（3’-sialyllactose，3’-SL）分別在3類(lèi)HMOs中含量較高[8]，具有一定的代表性。唾液酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）是構(gòu)成酸性HMOs的重要單糖衍生物，并且對(duì)于促進(jìn)嬰兒的大腦發(fā)育，提高嬰兒認(rèn)知能力具有重要作用[9-10]。因此，對(duì)于母乳中這6種母乳寡聚糖及唾液酸的快速定量分析具有重要意義。

目前，對(duì)于母乳寡聚糖的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）法[11-12]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法[13-14]、核磁（Nuclear magnetic resonance，NMR）法[15]以及離子色譜（Ion chromatography，IC）法[8，16-17]。 采用HPLC法通常需對(duì)樣品衍生后測(cè)定，操作繁瑣且重復(fù)性較差。LC-MS法由于乳品復(fù)雜的基質(zhì)導(dǎo)致回收率不理想，并且很難找到合適的內(nèi)標(biāo)消除誤差。NMR法的樣品需求量較大，并且靈敏度較差，不適用于母乳中寡聚糖的檢測(cè)。近年來(lái)，IC法由于不需要樣品的衍生在糖類(lèi)檢測(cè)方面有廣泛應(yīng)用，對(duì)于母乳寡聚糖的檢測(cè)也多有報(bào)道。然而就目前報(bào)道的方法，仍有兩個(gè)方面需要改善。首先，母乳寡聚糖種類(lèi)繁多，采用IC法檢測(cè)時(shí)容易產(chǎn)生相互干擾。此外，按照Lewis血型劃分的分泌型與非分泌型媽媽產(chǎn)生的母乳中巖藻糖基化的HMOs組分含量差異明顯[8，18]，并且各HMOs組分會(huì)隨著泌乳期發(fā)生明顯變化[12]。IC法中HMOs的分離度、量限與檢測(cè)范圍仍需進(jìn)一步優(yōu)化。母乳中唾液酸的檢測(cè)方法主要有HPLC法[19]與LC-MS法[20]。HPLC法是通過(guò)將唾液酸與衍生試劑反應(yīng)產(chǎn)生具有熒光性質(zhì)的化合物進(jìn)行檢測(cè)。LC-MS法中樣品經(jīng)離心過(guò)濾后可直接檢測(cè)。也有報(bào)道采用IC法[21]測(cè)定牛乳及乳制品中唾液酸的含量，然而還未應(yīng)用于母乳中唾液酸的檢測(cè)。同時(shí)檢測(cè)母乳寡聚糖與游離唾液酸的方法國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究建立了采用離子色譜法，通過(guò)兩種洗脫條件分離與測(cè)定母乳中6種主要母乳寡聚糖與游離唾液酸的方法，并在母乳基質(zhì)中進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

乳粉（34%蛋白，52%乳糖），市售產(chǎn)品；母乳樣品：成熟乳基質(zhì)樣品、初乳樣品1、過(guò)渡乳樣品1、成熟乳樣品1、初乳樣品2、過(guò)渡乳樣品2、成熟乳樣品2，其中，3段乳樣品1為分泌型，3段乳樣品2為非分泌型，所有母乳樣均從天津市南開(kāi)醫(yī)院收集獲得。

質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的氫氧化鈉溶液、乙酸鈉，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；3-FL、2’-FL、LNnT、LNT、6’-SL 與 3’-SL，英國(guó) Carbosynth 公司；Neu5Ac，加拿大Toronto Research Chemicals公司；試驗(yàn)用水為超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex ICS-5000離子色譜儀，美國(guó)Thermo Fisher公司，配有四元梯度泵、脈沖安培檢測(cè)器、Chromeleon 6.8色譜工作站；Milli-Q Advantage A10超純水儀，美國(guó)Millipore公司；Thermo REL5004V 冰箱、CarboPacTM PA1離子色譜柱（4 mm ×250 mm）、CarboPacTM PA1保護(hù)柱（4 mm ×50 mm），美國(guó) Thermo Fisher公司；移液器（1 mL），德國(guó) Eppendorf公司；尼龍濾膜（0.2 μm），英國(guó)Whatman公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

按照表1中 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT，Neu5Ac，6’-SL，3’-SL的質(zhì)量濃度配制混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

表1 標(biāo)準(zhǔn)系列工作液中分析組分的質(zhì)量濃度Table1 The mass concentration of each analyte in working standard solutions

1.4 離子色譜測(cè)定條件

CarboPacTMPA1離子色譜柱（4 mm×250 mm），CarboPacTMPA1保護(hù)柱（4 mm × 50 mm）；柱溫25℃；檢測(cè)器溫度25℃；流量1 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；淋洗液為水、500 mmol/L氫氧化鈉溶液、300 mmol/L乙酸鈉溶液；梯度洗脫程序1用于洗脫測(cè)試 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT（表2），梯度洗脫程序 2 用于洗脫測(cè)試 6’-SL，3’-SL，Neu5Ac（表3）。

1.5 樣品處理

準(zhǔn)確量取200 μL母乳樣品于塑料離心管中，加入超純水1 800 μL，混勻。然后放入4℃冰箱靜置 10 min 后，用 Whatman 尼龍濾膜（0.2 μm）過(guò)濾得濾液，按照離子色譜測(cè)定條件進(jìn)樣分析6’-SL，3’-SL，Neu5Ac，濾液用超純水稀釋一倍后再次進(jìn)樣分析 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS V22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估兩類(lèi)樣本間數(shù)據(jù)差異的顯著性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子色譜法中梯度洗脫的選擇

選擇梯度洗脫條件時(shí)，比較了一次梯度洗脫測(cè)定與兩種梯度洗脫程序分兩次分析測(cè)定7種分析組分。一次梯度洗脫前期使用梯度洗脫程序1，至43 min時(shí)承接梯度洗脫程序2的條件。采用同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣比較發(fā)現(xiàn)，一次梯度洗脫時(shí)，6’-SL與3’-SL的分離度為1.78，并且3’-SL譜峰有一定的拖尾，對(duì)稱(chēng)性較差（圖1），而分2次梯度洗脫的分離度可以提高至1.83，并且譜峰沒(méi)有產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，同時(shí)，Neu5Ac由于是重新采用較高洗脫能力的梯度洗脫，其保留時(shí)間較短，峰形較為尖銳，峰高是一次梯度洗脫的1.7倍（圖1），因此可以達(dá)到更低的檢出限和定量限。由于游離的Neu5Ac在母乳中含量很低[9]，尖銳的峰形更有利于Neu5Ac的檢出與定量。

表2 梯度洗脫程序1Table2 Program of gradient elution 1

表3 梯度洗脫程序2Table3 Program of gradient elution 2

圖1 不同洗脫程序的6’-SL、3’-SL、Neu5Ac離子流圖Fig.1 Ion current chromatograms of 6’-SL，3’-SL and Neu5Ac with different elution programs

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍

通過(guò)混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液做線性，各分析組分在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（表4），相關(guān)系數(shù)均大于0.999，線性范圍以mg/L母乳樣品計(jì)。

表4 分析組分線性范圍與標(biāo)準(zhǔn)曲線Table4 The linear range and standard curve of each analyte

2.3 檢出限與定量限

由于母乳基質(zhì)中各分析組分含量較高，不適用于定量限加標(biāo)。因此選用各分析組分含量較低的乳粉作為基質(zhì)，并調(diào)整基質(zhì)中宏量營(yíng)養(yǎng)素的含量得到乳粉基質(zhì)溶液以匹配母乳基質(zhì)（母乳中乳糖含量約6%，蛋白含量約1%[22]）。

在乳粉基質(zhì)溶液中加標(biāo)給定質(zhì)量濃度的分析組分評(píng)估定量限，同時(shí)計(jì)算該溶液的3 s/n得出檢出限。由表5可知，對(duì)于給定的加標(biāo)量得到的回收率在92.6%～103.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）小于3.2%，該加標(biāo)量可以作為方法的定量限，即 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT，Neu5Ac，6’-SL，3’-SL的定量限分別為19.8，9.8，19.9，19.7，5.0，9.9，9.9 mg/L。從各分析組分得出 s/n 計(jì)算檢出限（3 s/n）為5.2，0.4，2.8，2.5，0.5，1.0，1.8 mg/L。

表5 方法檢出限與定量限的驗(yàn)證結(jié)果（n=6）Table5 Validation results of LOD and LOQ（n=6）

2.4 精密度與回收率

取成熟乳基質(zhì)樣品按照樣品處理步驟處理后進(jìn)樣分析，測(cè)定6次后得出平均值，各組分RSD均小于3.7%。然后按照成熟乳基質(zhì)樣品中各組分質(zhì)量濃度的50%與100%進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，評(píng)估方法的精密度與回收率。兩組加標(biāo)試驗(yàn)均做6次平行計(jì)算平均值，組分RSD均小于2.1%，回收率在91.8%～106.1%之間，說(shuō)明該方法具有良好的精密度與回收率。

2.5 方法的應(yīng)用

媽媽的Lewis血型決定了α-1-2-L-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是否正常表達(dá)分泌，而根據(jù)該酶的表達(dá)分泌狀況可以將母乳分為分泌型與非分泌型，具體表現(xiàn)為分泌型母乳中含有大量的α-1-2-L-巖藻糖基化低聚糖，如2’-FL等，而非分泌型則較少[8，18]。另外研究顯示母乳中各HMOs隨著泌乳期會(huì)發(fā)生明顯變化[12]。因此本文選擇了分泌型與非分泌型的初乳、過(guò)渡乳、成熟乳共6個(gè)樣品，采用該方法分別測(cè)定樣品中 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT，Neu5Ac，6’-SL，3’-SL的含量，每個(gè)樣品做 3 個(gè)平行，用以考察方法在不同類(lèi)型、不同階段母乳中的適用性，測(cè)定結(jié)果如表7所示。

表6 方法精密度與回收率的驗(yàn)證結(jié)果（n=6）Table6 Validation results of precision and recovery（n=6）

表7 不同類(lèi)別母乳樣品中分析組分含量（n=3）Table7 The content of analytes in various human milk samples（n=3）

從表7中可以發(fā)現(xiàn)，分泌型3段乳中3-FL含量明顯小于非分泌型 3段乳（P<0.05），而 2’-FL含量明顯大于非分泌型3段乳（P<0.05）。所有樣品中的游離的Neu5Ac質(zhì)量濃度均低于30.9 mg/L。 3-FL，2’-FL，LNnT，LNT，Neu5Ac，6’-SL 與 3’-SL在這6種母乳樣品中的最低濃度分別為42.3，24.7，74.4，493.8，10.0，98.2 mg/L 與 57.8 mg/L，均大于建立方法的定量限。對(duì)比已報(bào)道文獻(xiàn)中這7種分析組分在母乳中的含量（表7）發(fā)現(xiàn)，由于該方法的定量限較低，個(gè)別樣品中2’-FL與3-FL的含量低于文獻(xiàn)中范圍，其余的5種分析組分含量均在文獻(xiàn)報(bào)道的范圍內(nèi)。并且所有已報(bào)道分析組分的檢測(cè)值均高于本方法的定量限，且在線性范圍內(nèi)。因此該方法可滿(mǎn)足母乳研究中主要HMOs與游離唾液酸含量的準(zhǔn)確測(cè)定。

在目前可查的報(bào)道檢測(cè)HMOs方法的文獻(xiàn)中，HPLC法、LC-MS法以及 IC法報(bào)道較多[8，11-14，16-17]，其中 LC-MS 法與 IC 法均未對(duì)定量限進(jìn)行驗(yàn)證，HPLC法中僅Sean等[11]建立的方法驗(yàn)證了定量限，方法中指出了3-FL與2’-FL的定量限分別為43 mg/kg與53 mg/kg，并發(fā)現(xiàn)哺乳期8個(gè)月內(nèi)的母乳中有21%的樣品中2’-FL無(wú)法定量測(cè)定，這部分樣品均屬于非分泌型母乳。由于非分泌型母乳中2’-FL含量較低，目前對(duì)于2’-FL的研究?jī)H針對(duì)分泌型母乳。本文為進(jìn)一步研究非分泌型母乳中2’-FL含量變化以及與其它HMOs的關(guān)系提供更為有效的方法。此外，2’-FL是劃分分泌型與非分泌型母乳的一個(gè)重要指標(biāo)，具有低定量限的方法能夠覆蓋更多低2’-FL含量的母乳樣品的定量分析，為分泌型母乳與非分泌型母乳的具體劃分提供更為有效的方法。同時(shí)，該HPLC方法指出了哺乳期8個(gè)月內(nèi)的母乳中有2%的樣品中3-FL含量低于定量限43 mg/kg，主要集中在分泌型母乳中。本研究建立的方法對(duì)更全面的研究母乳樣品的3-FL的含量分布及在不同泌乳期的變化趨勢(shì)提供可能。

另外，研究顯示，成熟乳中 LNnT，LNT，6’-SL與3’-SL的含量與分泌型母乳中2’-FL含量會(huì)隨著泌乳期迅速降低[23]。為研究泌乳后期母乳中LNnT，LNT，6’-SL，3’-SL 與 2’-FL 含量變化與相互關(guān)系，建立更為靈敏準(zhǔn)確的定量方法也很有必要。與已報(bào)道的方法相比，本文建立的方法6’-SL，3’-SL 與 2’-FL 具有較低的定量限，同時(shí)樣品制備的過(guò)程中不經(jīng)稀釋進(jìn)樣可以進(jìn)一步降低LNnT，LNT與2’-FL的定量限，在檢測(cè)研究泌乳后期母乳中 LNnT，LNT，6’-SL，3’-SL 與 2’-FL含量變化更有優(yōu)勢(shì)。

母乳中另一種活性成分唾液酸主要以糖鍵合、蛋白鍵合、脂質(zhì)鍵合以及游離4種形式存在，游離的唾液酸占比較低，僅占總唾液酸的3%左右。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)哺乳期3個(gè)月內(nèi)的母乳中游離狀態(tài)的唾液酸含量為9.3～59 mg/L，并且其含量隨著泌乳期會(huì)進(jìn)一步降低[10]。對(duì)于報(bào)道采用HPLC、LCMS以及IC測(cè)定唾液酸的方法[19-21]中，并未進(jìn)行方法的定量限驗(yàn)證。本文建立的方法對(duì)定量限進(jìn)行了完整驗(yàn)證，能夠準(zhǔn)確定量母乳中含量較低的游離唾液酸，對(duì)于整個(gè)泌乳期母乳中游離唾液酸含量變化的研究提供一個(gè)有效的方法。

3 結(jié)論

采用離子色譜建立了測(cè)定母乳中3-FL，2’-FL，LNnT，LNT，6’-SL，3’-SL 6 種主要 HMOs 以及游離唾液酸的方法，該方法操作簡(jiǎn)單，具有良好的分離度、精密度與準(zhǔn)確性以及較低的檢出限與定量限，研究證明對(duì)于分泌型與非分泌型3段乳中的這7種組分均能夠準(zhǔn)確定量。該方法可以應(yīng)用于母乳研究中主要HMOs與游離唾液酸的常規(guī)檢測(cè)與分析。