彭小兵 杜吉革 彭國瑞

摘要：為確定含腐敗梭菌α毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素重組蛋白的生產(chǎn)效率并評價其作為抗原的免疫效果，用生物反應(yīng)器對重組大腸桿菌DE3-pET-AE進(jìn)行高密度發(fā)酵，并將其制苗后以不同抗原劑量分別接種家兔和綿羊，間隔21 d進(jìn)行二免，分別測定一免、二免動物混合血清的中和效價。發(fā)酵結(jié)果顯示，培養(yǎng)物菌體密度D600 nm達(dá)20.3，相對表達(dá)量為27.6%，D600 nm與相對表達(dá)量的乘積為搖瓶培養(yǎng)的6.5倍，菌體濕質(zhì)量為37.2 g/L;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果顯示，目的蛋白以可溶形式表達(dá)。動物免疫效果評價結(jié)果顯示，在家兔和綿羊上，抗原含量與免疫效果在一定的范圍內(nèi)均呈正相關(guān)，當(dāng)接種量為300 μg/只時，免疫效果均最好;對腐敗梭菌毒素與D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的血清中和效價，在家兔上一免、二免分別達(dá)4與30、15與200，在綿羊上一免、二免分別達(dá)2與30、12與250。結(jié)果表明，DE3-pET-AE菌高密度發(fā)酵可獲得高產(chǎn)量蛋白抗原，且抗原的免疫效果明顯優(yōu)于《中華人民共和國獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：腐敗梭菌α毒素;產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素;大腸桿菌高密度發(fā)酵;免疫效果;抗原含量;家兔;綿羊

中圖分類號：S852.4+3 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0186-03

羊快疫和腸毒血癥是分別由腐敗梭菌和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起綿羊和山羊發(fā)生急性死亡的2種重要梭菌性疾病[1]，因發(fā)病急導(dǎo)致無法及時治療，給養(yǎng)羊業(yè)造成重大損失，故免疫接種是預(yù)防該病的最有效途徑。然而，國內(nèi)現(xiàn)有用于預(yù)防該病的疫苗（如羊快疫、黑疫二聯(lián)滅活疫苗與羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥三聯(lián)四防滅活疫苗及羊梭菌病多聯(lián)干粉滅活疫苗等）的檢驗合格率并不高[2]。因此，一方面通過研制產(chǎn)毒培養(yǎng)基配方、改善發(fā)酵工藝進(jìn)而提高抗原含量是提高傳統(tǒng)疫苗免疫效果的有效途徑之一;另一方面，通過基因工程方法研制亞單位疫苗也成為解決現(xiàn)有疫苗質(zhì)量不高的另一重要候選途徑。腐敗梭菌α毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素分別是腐敗梭菌和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌最主要的致死性毒力因子和保護(hù)性抗原，通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)分別獲得這2種重組毒素蛋白，經(jīng)制苗后免疫動物均可產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)[3-5]。

鑒于此，本試驗對已構(gòu)建的同時含有腐敗梭菌α毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因的重組大腸桿菌進(jìn)行高密度發(fā)酵，以檢測重組蛋白的生產(chǎn)效率。隨后，將發(fā)酵產(chǎn)物制苗后免疫接種家兔和綿羊并檢測血清中和效價，以評價發(fā)酵抗原的免疫效果，進(jìn)而為研發(fā)亞單位疫苗積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 含腐敗梭菌α毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因的重組大腸桿菌DE3-pET-AE，由筆者所在實驗室構(gòu)建并保存。

1.1.2 試驗用動物 綿羊，5～6月齡，品種為小尾寒羊，購自河北保定滿城區(qū)誠信養(yǎng)殖場。CD-1（ICR）小鼠，16～20 g，SPF（無特定病原）級;日本大耳白家兔，1.5～2.0 kg，清潔級。小鼠和家兔均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 主要儀器有恒溫?fù)u床（培英，THZ-D型）、電子天平（METTLER TOLEDO，PB203-N型）、紫外分光光度計（SPECTRA max，384 plus）、臺式高速冷凍離心機(jī)（KUBOTA，3500型）、生物反應(yīng)器（Applicon，ez-control & 7 L Autoclavable Bioreactor）等。

1.1.4 主要試劑 腐敗梭菌菌株C55-1株（CVCC60021）外毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-3株（CVCC82）外毒素，由筆者所在實驗室制備并保存。α-乳糖，SIGMA公司;酪蛋白胨、酵母浸出物，北京奧博星生物技術(shù)有限公司;葡萄糖、無機(jī)鹽、甘油，北京化學(xué)試劑公司;生理鹽水、明膠緩沖液、葡萄糖溶液等參照《中國獸用生物制品規(guī)程》[6]配制。

1.2 方法

1.2.1 重組菌的復(fù)蘇 將重組菌DE3-pET-AE劃線接種于LB平板上[添加氨芐青霉素（簡稱Amp+）]，37 ℃培養(yǎng) 12 h。

1.2.2 搖瓶振蕩培養(yǎng) 挑取重組菌單菌落，接種于2 mL MDG[7]（Amp+）非誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，37 ℃、260 r/min振搖培養(yǎng)10 h;將全部培養(yǎng)物接種于100 mL ZYM-5052[7]（Amp+）自誘導(dǎo)培養(yǎng)中，30 ℃、260 r/min振搖培養(yǎng)24 h。收獲培養(yǎng)物，測定D600 nm，并進(jìn)行蛋白電泳，用Quantity One軟件分析靶蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.3 生物反應(yīng)器高密度發(fā)酵 挑取重組菌單菌落，接種于 4 mL MDG（Amp+）非誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，37 ℃、260 r/min振搖培養(yǎng)16 h;將全部培養(yǎng)物接種于200 mL MDG（Amp+）非誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，37 ℃、260 r/min振搖培養(yǎng)10 h。將培養(yǎng)物接種于含4 L基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Amp+）的生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為4%，發(fā)酵溫度為30 ℃，通氣量為10 L/min，攪拌速度為500 r/min，控制pH值為7.0（補(bǔ)堿管接5 mol/L NaOH，補(bǔ)酸管接補(bǔ)料培養(yǎng)基），共培養(yǎng)24 h。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，C源組分用葡萄糖替換5052（即甘油、葡萄糖和乳糖的混合液），其他組分與ZYM-5052相同。補(bǔ)料培養(yǎng)基包括 10.0%酪蛋白胨、5.0%酵母浸出物、33.3%甘油、13.3%乳糖、0.8% MgSO4·7H2O。培養(yǎng)結(jié)束后收獲培養(yǎng)物，測定D600 nm。對發(fā)酵后菌液進(jìn)行10倍稀釋，再經(jīng)超聲波裂解處理后對全菌、菌體破碎上清和包涵體進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，用Quantity One軟件分析靶蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.4 制苗 取生物反應(yīng)器培養(yǎng)物，按總體積的0.4%加入甲醛溶液（含40%甲醛），37 ℃滅活48 h。經(jīng)滅活脫毒檢驗合格后，以抗原、鋁膠比例為4 ∶ 1來制備疫苗，使靶蛋白的終濃度為300 μg/mL。

1.2.5 疫苗在家兔上的免疫效果研究 免疫前在每只家兔耳中動脈采血5 mL，分離血清，按《中華人民共和國獸藥典》[8]的方法測定血清對腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價。血清效價是指“0.1 mL血清能中和的小鼠MLD（最小致死量）數(shù)”。將疫苗用20%鋁膠鹽水（含200 g氫氧化鋁膠和800 mL0.85%NaCl）稀釋后，分別以300、150、75、37.5 μg的劑量皮下注射家兔各5只，免疫后21 d進(jìn)行第2次免疫（免疫劑量及接種方式同首免），首免后21、35 d對每只家兔進(jìn)行耳中動脈采血5 mL，分離血清，測定每組5只家兔混合血清分別對腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價。

1.2.6 疫苗在綿羊上的免疫效果研究 免疫前在每只綿羊頸靜脈采血5 mL，分離血清，按《中華人民共和國獸藥典》[8]的方法測定血清對腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價。將疫苗用20%鋁膠鹽水稀釋后，分別以300、150、75、37.5 μg的劑量皮下注射綿羊各5只，免疫后21 d進(jìn)行第2次免疫（免疫劑量及接種方式同首免），首免后21、35 d 對每只綿羊進(jìn)行頸靜脈采血5 mL，分離血清，測定每組5只綿羊混合血清分別對腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶振蕩培養(yǎng)結(jié)果

采用搖瓶振蕩培養(yǎng)重組大腸桿菌DE3-pET-AE，30 ℃、260 r/min培養(yǎng)24 h，結(jié)果菌體密度D600 nm為4.81，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后用軟件測算得到目的蛋白相對表達(dá)量為17.9%，C值（C=D600 nm×相對表達(dá)量）為0.86。

2.2 高密度發(fā)酵結(jié)果

采用生物反應(yīng)器高密度發(fā)酵重組大腸桿菌DE3-pET-AE，30 ℃培養(yǎng)24 h，結(jié)果菌體密度D600 nm達(dá)20.3，相對表達(dá)量為27.6%，C值為5.60，菌體濕質(zhì)量為37.2 g/L。SDS-PAGE結(jié)果見圖1，可見目的蛋白以可溶形式表達(dá)。

2.3 疫苗在家兔上的免疫效果

對免疫前家兔血清進(jìn)行測定，結(jié)果對腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價均小于1，均為抗體陰性兔。將不同抗原劑量的疫苗分別免疫家兔后，測定每組5只家兔混合血清對腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價。由表1可知，在一定范圍內(nèi)抗原劑量與免疫效果呈正相關(guān);一免、二免血清中和效價均達(dá)到或顯著高于《中華人民共和國獸藥典》相關(guān)產(chǎn)品合格的標(biāo)準(zhǔn)（即血清中和效價對腐敗梭菌毒素應(yīng)達(dá)到1 MLOs/0.1 mL，對D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素應(yīng)達(dá)到3 MLOs/0.1 mL）[8]。對于腐敗梭菌毒素組分，一免血清效價為《中華人民共和國獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的 1～4倍，二免血清效價大幅提高為《中華人民共和國獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的3～15倍，增至一免效價的2～5倍。對于D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素組分，一免血清效價為《中華人民共和國獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的10倍，二免血清效價大幅提高為《中華人民共和國獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的17～67倍，增至一免效價的 1.7～6.7倍。提示免疫劑量為300 μg/只時，家兔免疫效果最好，一免血清效價對腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素分別可達(dá)到《中華人民共和國獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的4、10倍，而二免效價則分別可達(dá)到《中華人民共和國獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的15、67倍。

2.4 疫苗在綿羊上的免疫效果

對免疫前綿羊血清進(jìn)行測定，結(jié)果對腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價均小于1，均為抗體陰性綿羊。將不同抗原劑量的疫苗分別免疫綿羊后，測定每組5只綿羊混合血清分別對腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價。由表2可知，在一定范圍內(nèi)抗原劑量與免疫效果呈正相關(guān);一免、二免血清中和效價均達(dá)到或顯著高于《中華人民共和國獸藥典》相關(guān)產(chǎn)品合格的標(biāo)準(zhǔn)（即血清中和效價對腐敗梭菌毒素應(yīng)達(dá)到1 MLDs/0.1 mL，對D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素應(yīng)達(dá)到3 MLDs/0.1 mL）[8]。對于腐敗梭菌毒素組分，一免血清效價為《中華人民共和國獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的 1～4倍，二免血清效價大幅提高為《中華人民共和國獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的2～12倍，增至一免效價的2～6倍。對于D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素組分，一免血清效價為《中華人民共和國獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的1.7～10.0倍，二免血清效價大幅提高為《中華人民共和國獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的16.7～83.3倍，增至一免效價的5～10倍。提示免疫劑量為300 μg/只時，綿羊免疫效果最好，一免血清效價對腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素分別可達(dá)到《中華人民共和國獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的2、6倍，而二免效價則分別可達(dá)到《中華人民共和國獸藥典》標(biāo)準(zhǔn)的12、83.3倍。

3 討論

自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的原理在于碳源，即大腸桿菌優(yōu)先使用葡萄糖生長至飽和，當(dāng)葡萄糖被消耗殆盡時開始使用乳糖（既作為碳源，又作為誘導(dǎo)劑），進(jìn)而表達(dá)目的蛋白[7]。自誘導(dǎo)系統(tǒng)的優(yōu)點在于重組菌可生長至較高密度，無需人為添加誘導(dǎo)劑，并且用乳糖替代異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）具有無毒且價廉的特點。本研究用自誘導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，菌體密度D600 nm達(dá)到4.81時，遠(yuǎn)高于以LB培養(yǎng)至D560 nm為0.5～1.0再加入IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)方式。影響重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的主要因素包括宿主菌、接種量、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)條件、誘導(dǎo)劑的選擇、補(bǔ)料方式等[9-10]。本研究在借鑒前人經(jīng)驗和自誘導(dǎo)原理的基礎(chǔ)上，采用生物反應(yīng)器進(jìn)行高密度發(fā)酵，即先以葡萄糖作為碳源使細(xì)菌生長到高密度，再以流加含甘油和乳糖組合的方式誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，結(jié)果菌體密度D600 nm達(dá)到搖瓶培養(yǎng)的4.2倍，相對表達(dá)量達(dá)到搖瓶培養(yǎng)的1.5倍，菌體密度和相對表達(dá)量的乘積達(dá)到搖瓶培養(yǎng)的6.5倍。本研究所采用的高密度發(fā)酵策略使重組蛋白產(chǎn)率大大提高，并且其后的動物試驗也證明發(fā)酵產(chǎn)物具有良好的免疫效果，此策略可供其他研究者借鑒參考。另外，本研究的發(fā)酵產(chǎn)物以可溶性形式表達(dá)，將有利于蛋白折疊成天然構(gòu)象進(jìn)而露出抗原表位，可能有助于抗原獲得可靠的免疫效果。

本研究首次報道了同時含有腐敗梭菌α毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵工藝，及其產(chǎn)物在家兔和綿羊上的免疫效果。同時表達(dá)2種毒素蛋白的優(yōu)勢在于僅發(fā)酵1株大腸桿菌即可達(dá)到預(yù)防2種疾病的目的。家兔和綿羊試驗結(jié)果也表明，重組蛋白免疫效果良好，其誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的較好的血清中和效價顯著高于現(xiàn)有《中華人民共和國獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)[8]，即使低至“每只動物予37.5 μg”的抗原免疫量仍可達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。筆者曾報道現(xiàn)有疫苗檢驗合格率不高[2]，并且田間綿羊效價檢測合格率也偏低（數(shù)據(jù)未報道）。由此推知，靶動物免疫持續(xù)期的抗體效價將更難達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。值得一提的是，國際上羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥類疫苗無論在田間使用還是在替代動物效力檢驗[11-12]上均采用2次免疫。故本研究對二免家兔和綿羊的血清效價均進(jìn)行了評估，結(jié)果顯示2種組分的二免效價均獲得大幅增長，分別提升為《中華人民共和國獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的至少12倍和67倍，此結(jié)果為我國此類疫病的防控及制品質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)與方法的改進(jìn)提供了參考依據(jù)。綜合一免、二免數(shù)據(jù)來看，家兔和綿羊獲得最佳效價的抗原劑量相同，且各劑量的家兔效果普遍好于綿羊，推測其原因可能是綿羊體質(zhì)量相對較大，故需要接種的抗原量更多。

隨著基因工程技術(shù)的日益成熟，亞單位疫苗的發(fā)展速度也越來越快，本研究結(jié)果為羊快疫和腸毒血癥的預(yù)防提供了基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。此外，國內(nèi)外常將不同的梭菌組分相互聯(lián)合或與其他非梭菌組分相聯(lián)合制備多聯(lián)苗，以達(dá)到“一針多防”的目的[8，11-12]。本研究所制備的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)動物試驗表明，可用于同時預(yù)防羊快疫和腸毒血癥，至于將其進(jìn)一步聯(lián)合其他組分制備更多聯(lián)疫苗的可行性及組分間的兼容性，仍有待于進(jìn)一步研究驗證。

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