頭花蓼整株及根際土壤水浸提液的化感自毒作用

劉勇 劉燕 王星星

摘要：采用人工制備的2種水浸提液進(jìn)行生物測定。結(jié)果表明，頭花蓼整株水浸提液濃度≤10 mg/mL時對其種子發(fā)芽速率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等均起不同程度的促進(jìn)作用，但隨著濃度升高，種子發(fā)芽率、日均發(fā)芽數(shù)、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)降至對照組的1/3，發(fā)芽速率僅為對照組的1/5，幼苗根長、芽長為對照組的1/2～2/3，種子發(fā)芽率、發(fā)芽速率與發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)的RI值和綜合化感指數(shù)M值以10 mg/mL為界由正值轉(zhuǎn)為負(fù)值，表明頭花蓼整株水浸提液的化感自毒作用十分明顯。頭花蓼根際土壤水浸提液濃度≤250 mg/mL時種子胚芽長、發(fā)芽勢、活力指數(shù)、活力指數(shù)均不同程度增加，但濃度為500 mg/mL時種子發(fā)芽率由58.3%降至49.2%、發(fā)芽速率由1.4×10-1降至0.8×10-1、發(fā)芽指數(shù)由27.9降至17.5、活力指數(shù)由136.0降至79.7，各指標(biāo)的RI值和綜合化感指數(shù)M值均<0，表明高濃度的頭花蓼根際土壤水浸提液的化感自毒作用較明顯。綜上，頭花蓼2種水浸提液化感自毒作用很可能是其連作障礙的重要原因。

關(guān)鍵詞：頭花蓼;連作障礙;化感自毒;水浸提液;發(fā)芽率;發(fā)芽勢;發(fā)芽指數(shù);活力指數(shù);RI值;綜合化感指數(shù)

中圖分類號： R284 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0266-05

化感自毒作用是自然界普遍存在的現(xiàn)象，即植物根分泌，莖、葉等淋溶以及殘茬降解等過程釋放出的次生代謝產(chǎn)物，對自身或種內(nèi)其他植物產(chǎn)生危害的一種現(xiàn)象[1-2]。土壤是植物化感自毒作用的媒介，植物釋放的化感類物質(zhì)往往在土壤中經(jīng)過一系列的滯留、轉(zhuǎn)化、遷移等途徑逐漸富集，并維持一定的濃度和活性，進(jìn)而產(chǎn)生化感自毒效應(yīng)及連作障礙現(xiàn)象[3-4]。中藥材栽培中往往產(chǎn)生更多的次生代謝產(chǎn)物，更容易在土壤中不斷積累造成土壤環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而影響中藥材的正常生長[5-6]。研究表明，地黃、當(dāng)歸、人參等許多中藥材連作時產(chǎn)量和品質(zhì)的降低均與此有關(guān)[7-10]。因此，研究中藥材化感自毒作用對揭示其連作障礙的成因及防治具有十分重要的意義。

頭花蓼（Polygonum capitatum Buch. Ham ex D.Don）為蓼科蓼屬多年生草本植物，是我國西南地區(qū)的知名苗藥，其主要藥用成分沒食子酸對于治療泌尿系統(tǒng)感染頗具療效[11-12]。近年來，貴州威門藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的“熱淋清”顆粒是以此開發(fā)的用于治療尿路感染的特效藥[13-14]。頭花蓼作為貴州著名的藥材，其連作障礙問題一直比較突出，嚴(yán)重影響其種植產(chǎn)量和藥用成分品質(zhì)，成為制約該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素[15-16]。目前，關(guān)于頭花蓼連作障礙的研究極少，僅有頭花蓼連作土壤養(yǎng)分及施肥調(diào)控等方面的少量研究報道，而尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)其化感自毒作用的研究[15，17]。本研究通過提取頭花蓼整株和根際土壤水浸提液，采用生物學(xué)試驗(yàn)對比分析頭花蓼2種水浸提液對其種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，為頭花蓼連作障礙的成因分析及其防治措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2016年4月于貴州省威門藥業(yè)股份有限公司頭花蓼種植基地分別采集生長旺盛的新鮮頭花蓼整株、根際土壤及頭花蓼種子若干。

1.2 頭花蓼整株和根際土壤水浸提液制備

將新鮮頭花蓼整株（含根、莖、葉）用無菌蒸餾水清洗干凈，濾干表面水分，準(zhǔn)確稱量100 g，剪碎、研磨后置于燒杯內(nèi)，加入100 mL無菌蒸餾水，室溫（22 ℃）下浸提48 h，每隔12 h搖蕩1次，抽濾獲得1 000 mg/mL原液，倍量稀釋法分別得到5、50、100、250、500 mg/mL頭花蓼整株水浸提液。將新鮮根際土壤曬干，過60目篩，準(zhǔn)確稱量100 g根際土壤，同樣方法獲得上述濃度頭花蓼根際土壤水浸提液。

1.3 種子萌發(fā)試驗(yàn)

取3 000粒頭花蓼種子置于燒杯，35 ℃溫水浸泡24 h，挑選籽粒健康飽滿的種子，置于墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿（培養(yǎng)皿、濾紙均滅菌）中。每個培養(yǎng)皿擺放40粒種子，加入不同濃度浸提液5 mL至濾紙濕潤飽和為止，3次重復(fù)，用蒸餾水作對照組。人工培養(yǎng)箱（22 ℃）、每12 h光照和12 h黑暗條件下培養(yǎng)，每2 d加蒸餾水和1 d天加對應(yīng)水浸提液補(bǔ)充皿內(nèi)蒸發(fā)水分（確保每皿濕潤飽和），連續(xù)培養(yǎng)15 d，每天觀察、統(tǒng)計種子萌發(fā)數(shù)，直到持續(xù)3 d不再有新種子發(fā)芽為止，直尺測量種子胚根（芽）長。

1.4 幼苗生長試驗(yàn)

種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)束后，每皿選取發(fā)芽良好的種子，去掉皿蓋繼續(xù)培養(yǎng)10 d進(jìn)行幼苗生長，操作方法同上，直尺測量幼苗根（芽）長。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

發(fā)芽率=（發(fā)芽種子數(shù)/總供試種子數(shù)）×100%[18];發(fā)芽速率=[N1+（N2-N1）/2+…+（Nt-Nt-1）/t）]×100%，其中：Nt為t d內(nèi)種子發(fā)芽率[19];發(fā)芽抑制率=（1-發(fā)芽種子數(shù)/對照組發(fā)芽種子數(shù)）×100%，負(fù)值為促進(jìn)，正值為抑制[20];發(fā)芽勢=（發(fā)芽高峰期種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100%，表征種子發(fā)芽快慢與活力強(qiáng)弱[18];發(fā)芽指數(shù)GI=∑[（Gt/Dt）]，Gt為t d種子發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)種子發(fā)芽時間，d[21];種子活力指數(shù)VI=∑[（Gt/Dt）]×Sx，其中，Sx為種苗平均總長度[22];化感指數(shù)RI=（1-C/T）×100%，其中，C為對照組各指標(biāo)平均值，T為浸提液培養(yǎng)時各指標(biāo)平均值，RI>0為促進(jìn)，RI0為促進(jìn)，M<0為抑制，絕對值大小表征作用強(qiáng)弱[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 頭花蓼種子發(fā)芽表觀特征

由表1可知，頭花蓼整株、根際土壤水浸提液濃度升高時，種子長勢逐漸變?nèi)跚遗哐績A倒現(xiàn)象較為明顯，高濃度的整株水浸提液時甚至出現(xiàn)胚根發(fā)霉、胚芽腐爛等癥狀。頭花蓼整株水浸提液濃度≤10 mg/mL時，種子發(fā)芽數(shù)、日均發(fā)芽數(shù)均與對照組相似，但隨著濃度升高，種子發(fā)芽數(shù)、日均發(fā)芽數(shù)均顯著降低，當(dāng)濃度為500 mg/mL時均僅約為對照組的1/3。根際土壤水浸提液分別在所有濃度下和0～250 mg/mL時對種子發(fā)芽數(shù)、日均發(fā)芽數(shù)均未產(chǎn)生顯著影響，500 mg/mL時種子日均發(fā)芽數(shù)略微下降。2種水浸提液下的種子胚根長、胚芽長與對照組相比總體上差異不顯著，但高濃度時種子胚根長均值略微減小，種子胚芽長均值有所增加，表明高濃度的2種水浸提液下頭花蓼種子發(fā)芽不整齊。

2.2 頭花蓼種子發(fā)芽率及發(fā)芽速率

由圖1-a可知，在整株、根際土壤水浸提液下，頭花蓼種子發(fā)芽率分別介于21.7%～61.7%、49.2%～57.5%。隨著整株水浸提液濃度升高，種子發(fā)芽率逐漸降低，當(dāng)濃度≤10 mg/mL 時對種子發(fā)芽率未產(chǎn)生明顯影響，但濃度>10 mg/mL 時種子發(fā)芽率均低于對照組，最低僅約為對照組的1/3。根際土壤水浸提液下對種子發(fā)芽率均無顯著影響，甚至發(fā)芽率略高于對照組。由圖1-b可知，頭花蓼整株、根際土壤水浸提液均為5 mg/mL時，種子發(fā)芽速率分別達(dá)最高值，為0.15、0.14，均顯著高于對照組，但濃度≥10 mg/mL 時種子發(fā)芽速率出現(xiàn)不同程度地降低，最低降至0.03、0.08。

2.3 頭花蓼種子發(fā)芽勢、發(fā)芽抑制率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)

由表2可知，隨著頭花蓼整株水浸提液濃度升高，種子發(fā)芽勢總體呈下降趨勢，由25%降至5.8%，其中濃度≤10 mg/mL 時發(fā)芽勢均大于對照組，種子發(fā)芽抑制率均為負(fù)值，當(dāng)濃度>10 mg/mL時發(fā)芽勢均小于對照組，發(fā)芽抑制率均為正值且隨著濃度升高值由28.9%增加至62.8%。根際土壤水浸提液下發(fā)芽勢介于13.3%～25.0%，除濃度為 10 mg/mL 時發(fā)芽勢小于對照組外，其他濃度時均大于對照組，最大值為25.0%。根際土壤水浸提液濃度≤100 mg/mL時（50 mg/mL除外），發(fā)芽抑制率均為負(fù)值，濃度為50、250、500 mg/mL 時發(fā)芽抑制率均為正值。

頭花蓼整株、根際土壤水浸提液對其種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響具有顯著差異性（圖2-a、圖2-b）。整株水浸提液濃度≤10 mg/mL時，種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)值均大于對照組，其中5 mg/mL時分別達(dá)最大值（32.9、150.5），當(dāng)濃度>10 mg/mL時，種子發(fā)芽指數(shù)值逐漸降至7.1，活力指數(shù)降至28.7。根際土壤水浸提液濃度≤250 mg/mL時種子活力指數(shù)和發(fā)芽指數(shù)值均大于對照組且分別高達(dá)27.9、136.0，而濃度為500 mg/mL時，種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均小于對照組且分別降至17.5、79.7。

2.4 頭花蓼種子發(fā)芽各指標(biāo)化感指數(shù)RI及綜合化感指數(shù)M

通過計算頭花蓼整株、根際土壤水浸提液對其種子發(fā)芽率、發(fā)芽速率、發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)的化感指數(shù)RI值和綜合化感指數(shù)M值（圖3-a、圖3-b）。隨著頭花蓼整株水浸提液濃度升高，其種子各指標(biāo)RI值和綜合化感指數(shù)M值均逐漸降低，其中濃度≤10 mg/mL時均為正值，分別高達(dá)0.04、0.3、0.3、0.2，而濃度>10 mg/mL時均為負(fù)值，分別降至 -1.7、-2.9、-2.0、-2.2。根際土壤水浸提液濃度 ≤250 mg/mL 時，除少部分指標(biāo)RI值和綜合化感指數(shù)M值略低于0之外，其余均為正值且分別高達(dá)0.1、0.2、0.3、0.2，而濃度為 500 mg/mL 時均為負(fù)值，降至-0.2、-0.5、-0.1、-0.3。

2.5 頭花蓼2種水浸提液下幼苗生長情況

頭花蓼幼苗生長過程中，在高濃度的整株水浸提液下部分幼苗根發(fā)霉或芽腐爛甚至死亡，而在根際土壤水浸提液下傾倒的幼苗長勢重新好轉(zhuǎn)等（表3）。頭花蓼整株水浸提液濃度≤10 mg/mL時幼苗根長、芽長與對照組接近，分別為1.9、3.0 cm，而隨著濃度進(jìn)一步升高，幼苗根長、芽長總體呈現(xiàn)下降趨勢，分別降至1.4、1.6 cm。根際土壤水浸提液下幼苗根長、芽長與對照組接近且變化趨勢不明顯，分別介于1.5～1.9、2.8～3.4 cm。通過計算頭花蓼種子胚根芽比和幼苗根芽比（表4），與對照組相比，2種水浸提液下其種子胚根芽比和幼苗根芽比總體上差異不顯著且無明顯變化規(guī)律。

3 討論與結(jié)論

化感自毒作用是中藥材連作障礙的重要發(fā)生機(jī)制之一。很多研究表明，中藥材根、莖、葉等組織中廣泛存在醛類、黃酮類、單寧類、生物堿、萜類和甾類等次生代謝產(chǎn)物[25-28]。這些次生代謝產(chǎn)物通過雨水淋溶、自然揮發(fā)、根系分泌和植株分解等途徑釋放到土壤環(huán)境中形成一個微環(huán)境區(qū)域，對土壤的理化性質(zhì)、微生物的群落結(jié)構(gòu)、自身植株酶活性及代謝功能等產(chǎn)生重要影響，進(jìn)而對自身具有明顯的“低促高抑”化感作用。即當(dāng)其濃度在一定范圍內(nèi)會作為營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)中藥材自身生長，但當(dāng)濃度超過一定閾值后則會明顯破壞種子或幼苗細(xì)胞膜透性和多種酶活性、干擾細(xì)胞的分裂和伸長并阻礙養(yǎng)分的吸收與利用等，造成中藥材產(chǎn)量與品質(zhì)大幅下降的連作障礙問題[29-31]。本研究中頭花蓼整株、根際土壤水浸提液對其種子發(fā)芽或幼苗生長的“低促高抑”化感作用明顯，即2種水浸提液在低濃度時對種子發(fā)芽或幼苗生長有一定的促進(jìn)作用，但是隨著水浸提液濃度升高則出現(xiàn)種子發(fā)芽或幼苗生長長勢較差或傾倒現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)（胚）根發(fā)霉、（胚）芽腐爛等明顯抑制影響。

頭花蓼整株水浸提液濃度≤10 mg/mL時雖然對種子發(fā)芽（數(shù)）率、日均發(fā)芽數(shù)以及幼苗根長或芽長等影響較小，但發(fā)芽速率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均大于對照組，分別高達(dá)0.2、25.0%、32.9、150.5，發(fā)芽抑制率為負(fù)值，表明頭花蓼整株水浸提液在該濃度范圍內(nèi)其種子活力較強(qiáng)、發(fā)芽較快，總體起促進(jìn)作用，但隨著濃度升高，種子發(fā)芽率、日均發(fā)芽數(shù)、發(fā)芽速率分別驟降至21.7%、0.5、0，發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)降至5.8%、7.1、28.7，發(fā)芽抑制率>0，幼苗根長、芽長分別降至1.4、1.6 cm，對種子發(fā)芽或幼苗生長的抑制影響十分明顯。另外，種子發(fā)芽率、發(fā)芽速率與發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)的RI值和綜合化感指數(shù)M值均隨著整株水浸提液濃度升高而不斷減小，且以10 mg/mL為界由正值轉(zhuǎn)為負(fù)值，表明頭花蓼整株水浸提液的化感自毒作用較明顯且隨著濃度升高越來越強(qiáng)烈。

頭花蓼根際土壤水浸提液濃度≤250 mg/mL時對種子發(fā)芽（數(shù)）率、日均發(fā)芽數(shù)及幼苗根長、芽長等影響較小，而種子胚芽長、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)均有不同程度增加，而種子發(fā)芽率、發(fā)芽速率與發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)的RI值和綜合化感指數(shù)M值大多為正值，表明頭花蓼根際土壤水浸提液對種子發(fā)芽或幼苗生長的促進(jìn)作用更明顯，但是當(dāng)濃度達(dá) 500 mg/mL 時，種子發(fā)芽率、發(fā)芽速率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均有所下降，分別由58.3%降至49.2%、0.14降至0.08、27.9降至17.5、136.0降至79.7，各指標(biāo)的RI值和綜合化感指數(shù)M值均為負(fù)值，可見高濃度的頭花蓼根際土壤水浸提液有明顯的化感自毒作用。

綜上，頭花蓼整株、根際土壤水浸提液均具有化感自毒作用，其中整株水浸提液的化感自毒作用尤為突出，很可能是頭花蓼連作障礙的重要原因。因此，在頭花蓼連作栽培中可通過盡可能清理出土壤中頭花蓼植株殘留物、深耕翻土暴曬、篩選培育抗逆性強(qiáng)的頭花蓼品種或建立科學(xué)的多種植物輪（間）作體系等措施有效減緩其連作障礙的發(fā)生。

致謝：特別感謝貴州威門藥業(yè)股份有限公司為本研究開展提供便利！

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