高灑灑， 崔曉萍

（1.陜西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院2016級中醫(yī)婦科碩士研究生，陜西咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院中醫(yī)系，陜西咸陽 712046）

在臨床上，我們經(jīng)常可以看到許多月經(jīng)量少、月經(jīng)后期，甚至閉經(jīng)的患者均處于過度消瘦的狀態(tài)，詢問病史之后，發(fā)現(xiàn)其中絕大多數(shù)女性經(jīng)常性進行節(jié)食、運動，甚或服用藥物以追求減肥。給予相關檢查，亦發(fā)現(xiàn)這些女性往往都處于卵巢功能下降甚至卵巢早衰的狀態(tài)，在本該生育的年齡卻沒有該有的生殖功能，從而引起月經(jīng)異常，不能生育。現(xiàn)代研究[1]顯示，70%的人群處于亞健康狀態(tài)，其中偏瘦人群占到80%。女性體質(zhì)量的變化對生殖功能的影響呈現(xiàn)兩極化的分布狀態(tài)，即體質(zhì)量極高或極低都會使生殖能力下降[2]。臨床上大多數(shù)消瘦女性月經(jīng)稀發(fā)、月經(jīng)后期、閉經(jīng)，甚則不孕[3]，一般有2方面原因：一方面，因雌激素受體表達于正常成人的脂肪細胞[4]，雌激素與脂肪細胞中的特異性受體結(jié)合發(fā)生作用[5]。脂肪分為類脂和中性脂肪，類脂分為磷脂和膽固醇，膽固醇是合成甾體激素的前體。過度消耗脂肪使雌激素合成減少，同時導致雌激素與雌激素受體（ER）結(jié)合減少，可以導致女性月經(jīng)量少、月經(jīng)后期、閉經(jīng)甚至不孕等癥[6]。另一方面，西醫(yī)學認為女性發(fā)育成熟階段，身高與體質(zhì)量有一定的比例，若在短期內(nèi)體質(zhì)量下降超過正常范圍，則會使促性腺激素釋放激素（GnRH）的合成與分泌減少，抑制促性腺激素，使性腺功能退減，導致閉經(jīng)等[7]，最終使下丘腦—垂體—卵巢性腺軸（HPOA）失調(diào)，導致女性生殖內(nèi)分泌功能水平下降[7，8]。

目前關于過度瘦身對女性生殖危害的機理尚缺乏具體研究。本研究擬通過運用“半量飲食+過度運動+左旋肉堿”的綜合方法造成大鼠過度瘦身模型，將不同時段大鼠下丘腦人吻素1（Kiss1）、G蛋白偶聯(lián)受體54（GPR54）mRNA表達及血清性激素水平等為切入點，論證過度瘦身對生殖功能的影響，揭示女性盲目追求“骨感美”的錯誤傾向。同時，對造成過度瘦身狀態(tài)的大鼠用左歸丸進行干預，觀察以上各項指標表達的差異，以闡明中醫(yī)“精血同源”“腎主生殖”“腎生髓充腦”的科學內(nèi)涵，為中醫(yī)“補腎促生殖”提供科學依據(jù)，為恢復和提升生殖功能提供有效的中醫(yī)藥療法方案，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物選用SPF級健康雌性12周齡SD大鼠150只，體質(zhì)量（250±20）g，購于西安交通大學實驗動物中心。動物質(zhì)量合格證號：SCXK（陜）2018-001。單籠飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學中心實驗室，室溫20～25℃，相對濕度40%～55%，光照12 h，通風良好，自來水供飲。適應性喂養(yǎng)1周期間，每日上午用電子天平給予定量標準顆粒飼料喂食，測量每只大鼠的正常飲食量（精確到0.1 g），隔日更換墊料并清洗鼠籠。

1.2實驗藥物左歸丸，由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠生產(chǎn)，批號：Z11020735；左旋肉堿，由上海麥克林公司生產(chǎn)，批號：L804703。每種藥物用量根據(jù)人和大鼠體表面積換算的等效劑量比率表計算。左歸丸給藥劑量為1.62 g·kg-1·d-1，用去離子水配成混懸液。左旋肉堿給藥劑量為600 mg·kg-1·d-1，采用等容積不等濃度藥液給藥，灌胃容積6 mL/kg，用去離子水配左旋肉堿水溶液質(zhì)量濃度0.1 g/mL。每周末測量大鼠體質(zhì)量1次，均根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整大鼠給藥量。

1.3實驗試劑與儀器大鼠促卵泡激素（FSH）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測試劑盒（上海優(yōu)選生物科技有限公司，批號：YX-061908R）；大鼠促黃體激素（LH）ELISA檢測試劑盒（上海優(yōu)選生物科技有限公司，批號：YX-120800R）；大鼠雌二醇（E2）ELISA檢測試劑盒（上海優(yōu)選生物科技有限公司，批號：YX-050000R）；First Strand cDNA synthesis Kit（美國Invitrogen公司，批號：K1622）；Quantity Nova SYBR Green PCR Kit（德國Qiagen公司，批號：208052）；隨機引物（美國Invitrogen公司）。CX21光學顯微鏡（日本Olympus公司）；LDZ4-1.2離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；MP-120-2電子天平（上海第二天平儀器廠）；低溫冰箱（日本Sanyo公司）；熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）。

1.4動物分組為了探討不同瘦身程度對生殖功能損害的差異，分為A組和B組兩大組，具體分組如下：150只大鼠適應性喂養(yǎng)1周，每日08:00時應用陰道脫落細胞涂片連續(xù)觀察10 d，建立大鼠動情周期檔案。將動情周期規(guī)律的大鼠納入實驗，從中隨機抽取10只作為空白A組，10只作為空白B組。剩余大鼠進行跑臺運動訓練，跑臺坡度為0°，每天20 min，第1天跑速為18 m/min，其后跑速每天增加2 m/min，共訓練6 d（最終跑速為28 m/min），休息1 d。運動中采用聲音刺激或毛刷機械刺激鼠尾部，以使鼠保持持續(xù)性運動，在整個運動過程中，未使用電刺激。連續(xù)刺激或休息時間過長仍不能維持原強度運動的大鼠不納入實驗。選擇能夠適應跑臺運動訓練的60只大鼠隨機分為模型A組、模型B組，恢復飲食A組、恢復飲食B組，恢復飲食+左歸丸A組、恢復飲食+左歸丸B組。

1.5動物造模瘦身方案選擇“半量飲食+過度運動+左旋肉堿”的方法。（1）A組分為空白A組、模型A組、恢復飲食A組、恢復飲食+左歸丸A組，每組各10只大鼠。第1～4周，除空白A組外其余各組需執(zhí)行左旋肉堿灌胃、跑臺運動（跑臺坡度為0°，跑速為28 m/min，20 min/d，運動6 d，休息1 d）、50%日常攝食量。第5～8周恢復飲食A組、恢復飲食+左歸丸A組恢復飲食，停止左旋肉堿及跑臺運動，同時恢復飲食+左歸丸A組給予左歸丸干預。（2）B組分為空白B組、模型B組、恢復飲食B組、恢復飲食+左歸丸B組，每組各10只大鼠。第1～8周，除空白B組外其余各組需執(zhí)行左旋肉堿灌胃、跑臺運動（同造模A組）、50%日常攝食量。第9～12周恢復飲食B組、恢復飲食+左歸丸B組恢復飲食，停止左旋肉堿及跑臺運動，同時恢復飲食+左歸丸B組給予左歸丸干預。

1.6給藥方法（1）A組：空白A組（第1～4周，每日08:00時生理鹽水灌胃6 mL）；模型A組、恢復飲食A組、恢復飲食+左歸丸A組（第1～4周，半量飲食+每日運動前半小時左旋肉堿灌胃600 mg/kg，1次/d）；恢復飲食A組、恢復飲食+左歸丸A組（第5～8周，停止半量飲食、左旋肉堿、過度運動，恢復飲食A組生理鹽水灌胃5 mL，恢復飲食+左歸丸A組給予左歸丸灌胃1.62 g·kg-1·d-1）。（2）B組：空白B組（第1～8周，每日08：00時生理鹽水灌胃6 mL）；模型B組、恢復飲食B組、恢復飲食+左歸丸B組（第1～8周，半量飲食+每日運動前半小時左旋肉堿灌胃600 mg/kg，1次/d）；恢復飲食B組、恢復飲食+左歸丸B組（第9～12周，停止半量飲食、左旋肉堿、過度運動，恢復飲食B組生理鹽水灌胃5 mL，恢復飲食+左歸丸B組左歸丸灌胃1.62 g·kg-1·d-1）。

1.7觀察指標與方法

1.7.1 大鼠一般狀態(tài)及體質(zhì)量觀察 每日08：00、12：00、18：00時詳細觀察并記錄每只大鼠造模及用藥前后飲食狀況、毛色光澤、精神狀態(tài)、活動度、大小便等情況。于大鼠運動休息日08：00時用電子天平稱取并記錄大鼠空腹體質(zhì)量，對比瘦身前后、瘦身后恢復飲食以及藥物干預后大鼠的空腹體質(zhì)量變化。

1.7.2 大鼠陰道上皮脫落細胞涂片觀察 固定大鼠，暴露其下腹部，將制作的纖細棉簽用生理鹽水濕潤后輕輕插入大鼠陰道約0.5 cm，順時針轉(zhuǎn)動1周后取出陰道脫落細胞。將取出的帶有大鼠陰道脫落細胞的棉簽在載玻片上逆時針轉(zhuǎn)動1周，制成涂片，編號并自然晾干。晾干的涂片于95%乙醇固定10 min→蘇木素染色5 min→自來水沖洗→1%鹽酸分化5 s→自來水沖洗→1%伊紅染色2 min→自來水沖洗。經(jīng)70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→100%乙醇梯度脫水→二甲苯Ⅰ透明5 min→二甲苯Ⅱ透明5 min→自然晾干，光鏡下觀察。實驗期間每日08：00時行大鼠陰道上皮脫落細胞涂片觀察，在普通光學顯微鏡下觀察各細胞形態(tài)及數(shù)目以確定大鼠所處的動情周期階段。光鏡下觀察成熟角化細胞百分比，以每200個脫落細胞中成熟角化細胞的數(shù)目所占百分比計算角化細胞指數(shù)，比較同一動情時期的角化指數(shù)。

1.7.3 大鼠血清FSH、LH、E2含量測定 大鼠禁食禁飲12 h，電子天平測量并記錄體質(zhì)量，實驗器材高溫消毒干燥，10%水合氯醛（劑量0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠。麻醉生效后，首先固定頭部以及四肢，下腹部剃毛并常規(guī)消毒，立即腹主動脈取血約5 mL，靜置30 min后，以轉(zhuǎn)速為3 000 r/min離心20 min后，用槍頭吸取上清液，置于-20℃以下冰箱保存，送陜西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗中心進行各項性激素的檢測。

1.7.4 下丘腦Kiss1及GPR54 mRNA測定 大鼠采血后，迅速分離并摘取下丘腦組織，將其置入RNA保存液中，于-80℃冰箱凍存，用于熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法進行mRNA的檢測。具體方法：（1）抽提總RNA，測吸光度[D（260）]，并定量。（2）逆轉(zhuǎn)錄：①按下列順序在200μL PCR管中加入下列反應物（體積為12μL）：DEPC水（10-x）μL；隨機引物/Oligo dT（50 pM/μL）2μL；RNA xμL（2μg）；②放置于PCR儀中，65℃處理5 min；③立即冰浴，高速（高于5 000 g）離心5 s；④按下列順序在PCR管加入下列反應物（加入之后總體積為20μL）：RNA酶抑制劑（50 U/μL）1μL；5×buffer 4μL；dNTP MIX（10 mmol/L）2μL；RevertAid M-MuLV RT（200 U/μL）1μL；⑤混勻后，25℃，5 min，42℃，60 min（對于GC含量比較高的樣本，可以將溫度提高到45℃）；⑥70℃，處理5 min；⑦高速（高于5 000 g）離心5 s。-20℃保存。（3）熒光定量PCR擴增：①序列與引物，序列參照Gene Bank數(shù)據(jù)庫中各目的基因的序列。見表1。②PCR反應體系（10μL）：H2O 1.5μL；2×SYBGEEN PCR mix-5μL；Primer（10 pM/μL）/Primer（10 pM/μL）1μL；Template（反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，也即cDNA）2.5μL。③反應條件：95℃，2 min；95℃，5 s；60℃，10 s。45個循環(huán)。熔解曲線。實驗結(jié)果說明：所有的數(shù)值先與內(nèi)參做了△Ct，然后用第1個樣品做相對含量（p）=2-△△Ct分析。

1.8統(tǒng)計方法應用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗。造模以及后期干預后動情周期觀察數(shù)據(jù)多組的比較采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

2 結(jié)果

2.1各組大鼠一般狀態(tài)觀察空白A、B組大鼠體態(tài)適中，毛發(fā)稠密，色澤正常，行動靈活，反應靈敏，大小便正常。模型A、B組大鼠體質(zhì)量下降，眼窩凹陷，精神不振，活動減少，反應遲鈍，煩躁不安，豎毛，拱背，易驚，怕人，體毛粗糙無光澤，心率加快，體溫升高，對疼痛敏感等，且造模8周較造模4周大鼠一般狀態(tài)更差。恢復飲食A、B組與恢復飲食+左歸丸A、B組大鼠的一般狀態(tài)較同組模型組改善，且造模8周大鼠一般狀態(tài)恢復情況較造模4周大鼠恢復情況差。

2.2過度瘦身對大鼠體質(zhì)量的影響及左歸丸干預作用表2結(jié)果顯示：造模前各組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。干預后，與同組空白組比較，模型A、B組大鼠體質(zhì)量明顯下降（P＜0.01）；與同組模型組比較，恢復飲食A、B組大鼠體質(zhì)量均明顯升高（P＜0.01）；與同組恢復飲食組比較，恢復飲食+左歸丸A組大鼠體質(zhì)量升高（P＜0.05），恢復飲食+左歸丸B組大鼠體質(zhì)量無明顯變化。

研究結(jié)果分析：通過“半量飲食+跑臺運動+左旋肉堿”的方法可以導致大鼠體質(zhì)量逐漸下降。造模4周時，大鼠體質(zhì)量較原始值下降了17%，較空白組下降了26%。造模8周時，大鼠體質(zhì)量較原始值下降了23%，較空白組下降了35%。即造模8周大鼠體質(zhì)量較造模4周更低。給予恢復飲食后，造模4周大鼠體質(zhì)量恢復至空白組的98%，左歸丸干預后體質(zhì)量恢復更明顯；造模8周大鼠體質(zhì)量恢復為空白組的83%，左歸丸干預后體質(zhì)量恢復不明顯。造模8周大鼠體質(zhì)量比造模4周恢復情況差，可能與生殖功能損害程度有關，亦可能與恢復飲食及恢復飲食+左歸丸干預時長有關。

表2 過度瘦身對大鼠體質(zhì)量的影響及左歸丸干預作用Table 2 The effect of excessive weight loss on reproductive function of rats and the intervention actions of Pills （s，m/g）

表2 過度瘦身對大鼠體質(zhì)量的影響及左歸丸干預作用Table 2 The effect of excessive weight loss on reproductive function of rats and the intervention actions of Pills （s，m/g）

①P＜0.01，與同組空白組比較；②P＜0.01，與同組模型組比較；③P＜0.05，與同組恢復飲食組比較

造模后及干預后300.0±5.58 223.0±5.49①293.0±6.58②301.0±7.15③324.0±4.52 211.0±8.29①268.0±6.53②270.0±5.68組別A組N 10 9 8 9 B組亞組空白A組模型A組恢復飲食A組恢復飲食+左歸丸A組空白B組模型B組恢復飲食B組恢復飲食+左歸丸B組10 10 9 9造模前268.0±4.62 269.0±5.31 270.0±6.67 271.0±5.44 270.0±5.66 274.0±4.45 272.0±5.65 271.0±4.96

2.3過度瘦身對大鼠動情周期的影響及左歸丸干預作用大鼠動情周期各期陰道上皮脫落細胞形態(tài)如圖1所示。動情前期：大量上皮細胞，胞漿呈粒狀，少量角化（無核）細胞，無白細胞；動情期：大量角化細胞，形狀大而不規(guī)則，尚有少量上皮細胞；動情后期：大量多核白細胞，尚有融合的角化細胞；動情間期：大量多核白細胞，少量上皮細胞。

表3結(jié)果顯示：恢復飲食A組動情周期規(guī)律的大鼠數(shù)量較模型A組升高（P＜0.05）；恢復飲食+左歸丸A組動情周期規(guī)律的大鼠數(shù)量較模型A組明顯升高（P＜0.01）。其余各組之間動情周期規(guī)律比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4過度瘦身對大鼠血清FSH、LH、E2水平的影響及左歸丸干預作用表4結(jié)果顯示：與同組空白組比較，模型A、B組FSH、LH水平均明顯升高，E2水平均明顯下降（P＜0.01）。與同組模型組比較，恢復飲食A、B組FSH、LH水平均明顯下降，E2水平明顯升高（P＜0.01）。與同組恢復飲食組比較，恢復飲食+左歸丸A組的FSH、LH明顯下降（P＜0.01），E2水平升高（P＜0.05），恢復飲食+左歸丸B組FSH、LH較前稍有降低，E2水平稍有提高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。A、B組對應組別之間比較，A組FSH、LH水平明顯低于B組（P＜0.01）。模型B組E2水平較模型A組降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；其余A、B組對應組別之間比較，B組E2水平明顯低于A組（P＜0.01）。

圖1 大鼠陰道上皮脫落細胞涂片觀察結(jié)果（×20）Figure 1 The smear result of exfoliative cells in vaginal epithelium（×20）

表3 過度瘦身對大鼠動情周期的影響及左歸丸干預作用Table 3 The effect of excessive weight loss on regular estrus cycle of the rats and the intervention actions of Zuogui Pills

表4 過度瘦身對大鼠血清FSH、LH、E2水平的影響及左歸丸干預作用Table 4 The effect of excessive weight loss on rat serum contents of FSH，LH and E2 and the intervention actions of Zuogui Pills

表4 過度瘦身對大鼠血清FSH、LH、E2水平的影響及左歸丸干預作用Table 4 The effect of excessive weight loss on rat serum contents of FSH，LH and E2 and the intervention actions of Zuogui Pills

①P＜0.01，與同組空白組比較；②P＜0.01，與同組模型組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與同組恢復飲食組比較

組別A組N 10 9 8 9 B組E2[ρ/（pg·mL-1）]93.02±6.77 40.94±5.38①75.21±4.92②85.79±5.29③98.68±2.64 38.51±5.16①52.88±6.15②55.91±5.90亞組空白A組模型A組恢復飲食A組恢復飲食+左歸丸A組空白B組模型B組恢復飲食B組恢復飲食+左歸丸B組10 10 9 9 FSH[J/（mIU·mL-1）]16.14±1.54 30.34±1.29①24.06±1.68②20.27±1.05④15.94±1.13 41.23±1.27①39.45±1.44②39.12±1.39 LH[J/（mIU·mL-1）]13.01±1.08 20.25±1.67①17.02±1.74②15.21±1.13④13.37±1.25 23.09±1.56①19.89±1.66②19.73±1.41

研究結(jié)果表明：①過度瘦身模型可顯著提高大鼠血清FSH、LH水平，同時降低E2水平，與臨床上瘦身致卵巢功能下降患者出現(xiàn)高促性腺激素和低雌激素一致；②通過各期實驗組內(nèi)比較：給予恢復飲食、左歸丸干預后，可在一定程度上使FSH、LH下降，E2升高；恢復飲食+左歸丸干預較單純恢復飲食對生殖功能恢復有明顯優(yōu)勢；③通過兩部分實驗組間比較：給予恢復飲食、左歸丸干預后，4周生殖功能恢復情況較8周有顯著優(yōu)勢。

2.5過度瘦身對大鼠下丘腦Kiss1及GPR54 mRNA表達的影響及左歸丸干預作用圖2、3 Kiss1、GPR54 mRNA熔解曲線、擴增曲線表明擴增產(chǎn)物特異性良好。表5結(jié)果顯示：模型A、B組大鼠Kiss1的表達水平較同組空白組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；恢復飲食A組大鼠Kiss1的表達水平較模型A組顯著上升（P＜0.01）；與恢復飲食A組比較，恢復飲食+左歸丸A組大鼠Kiss1表達顯著升高（P＜0.01）；恢復飲食B組大鼠Kiss1表達與模型B組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；恢復飲食+左歸丸B組大鼠Kiss1表達水平與恢復飲食B組大鼠比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。造模8周各對應組與造模4周比較，Kiss1的表達水平均顯著下降（P＜0.01）。

圖2 下丘腦Kiss1的熒光定量PCR熔解曲線（A）及擴增曲線（B）Figure 2 Fluorescence quantitative PCR melt curve and amplifying curve of Kiss1 in rat hypothalamus

圖3 下丘腦GPR54 mRNA的熒光定量PCR熔解曲線（A）及擴增曲線（B）Figure 3 Fluorescence quantitative PCR melt curve and amplifying curve of GPR54 in rat hypothalamus

模型A、B組較同組空白組大鼠GPR54 mRNA表達顯著降低（P＜0.01）；恢復飲食A組較模型A組大鼠GPR54 mRNA表達水平顯著上升（P＜0.01）；與恢復飲食A組比較，恢復飲食+左歸丸A組大鼠GPR54 mRNA的表達水平明顯升高（P＜0.01）；恢復飲食B組大鼠GPR54 mRNA表達水平與模型B組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與恢復飲食B組比較，恢復飲食+左歸丸B組GPR54 mRNA的表達水平無明顯變化（P＞0.05）。B組各對應組大鼠GPR54 mRNA表達水平較A組明顯下降（P＜0.01）。

結(jié)果分析：①通過各實驗組內(nèi)比較：A、B模型組大鼠下丘腦Kiss1及GPR54 mRNA表達均較空白組明顯下降，恢復飲食及恢復飲食+左歸丸都可提高大鼠下丘腦Kiss1及GPR54 mRNA的表達量，尤以結(jié)合左歸丸效果更佳。②通過兩部分實驗組間比較：造模8周Kiss1及GPR54 mRNA降低情況較造模4周顯著；給予恢復飲食、左歸丸干預后，造模8周Kiss1及GPR54mRNA升高情況較造模4周緩慢?；謴惋嬍?左歸丸干預較單純恢復飲食效果好。

表5 過度瘦身對大鼠下丘腦Kiss1、GPR54 mRNA表達的影響及左歸丸干預作用Table 5 The effect of excessive weight loss on the mRNA expression levels of Kiss1 and GPR54 in rat hypothalamus and the intervention actions of Zuogui Pills （s，p）

表5 過度瘦身對大鼠下丘腦Kiss1、GPR54 mRNA表達的影響及左歸丸干預作用Table 5 The effect of excessive weight loss on the mRNA expression levels of Kiss1 and GPR54 in rat hypothalamus and the intervention actions of Zuogui Pills （s，p）

①P＜0.05，②P＜0.01，與同組空白組比較；③P＜0.01，與模型A組比較；④P＜0.01，與恢復飲食A組比較；⑤P＜0.01，與恢復飲食+左歸丸A組比較

GPR54 mRNA 0.993 0.307②0.499③0.632④0.902 0.181②③0.182④0.183⑤組別A組N 10 9 8 9 B組亞組空白A組模型A組恢復飲食A組恢復飲食+左歸丸A組空白B組模型B組恢復飲食B組恢復飲食+左歸丸B組10 10 9 9 Kiss1 mRNA 1.002 0.42①0.55③0.58④0.955 0.278②③0.282④0.283⑤

3 討論

3.1半量飲食+跑臺運動+左旋肉堿灌胃造成大鼠過度消瘦狀態(tài)左旋肉堿[9]是食物的組成成分，主要作用是參與體內(nèi)脂肪代謝，作為載體來促進脂肪酸的β氧化，從而調(diào)節(jié)脂肪生物代謝[10]。20世紀70年代已有左旋肉堿用于治療肥胖癥的報道[11]。研究[12]說明，左旋肉堿能夠提高運動對肥胖和超重者的促脂肪代謝作用，有效地增加運動的降重減脂效果。目前國內(nèi)減肥藥大多以左旋肉堿為主要成分，本研究選用“半量飲食+跑臺運動+左旋肉堿”綜合方法造成大鼠消瘦狀態(tài)。結(jié)果顯示，大鼠瘦身前后體質(zhì)量變化明顯，造模8周較造模4周體質(zhì)量下降程度更大，且恢復飲食及藥物干預后，造模8周較造模4周大鼠體質(zhì)量恢復情況差。

3.2過度瘦身可導致生殖功能下降下丘腦、垂體與卵巢之間相互調(diào)節(jié)、相互影響，形成完整而又協(xié)調(diào)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，即HPOA[13]，直接影響女性的生殖功能，其中任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生功能失調(diào)或病變時都有可能導致女性排卵障礙、性激素分泌異常。當體內(nèi)脂肪比重降至17%時，就會發(fā)生月經(jīng)周期紊亂、性欲明顯減退、不孕[14]。生活中越來越多的女性采用控制飲食或服用減肥藥達到瘦身目的，通過影響神經(jīng)內(nèi)分泌通路和改變生殖激素代謝率導致HPOA功能紊亂，從而影響女性生殖功能[15]。系列研究[16-19]表明，過度瘦身導致的營養(yǎng)不良嚴重影響了HPOA功能。臨床上常見神經(jīng)性厭食癥女性隨著體質(zhì)量的下降出現(xiàn)月經(jīng)紊亂、不孕等疾病，體質(zhì)量降至正常體質(zhì)量70%以下時會出現(xiàn)下丘腦性閉經(jīng)。下丘腦是HPOA的啟動中心，由下丘腦弓狀核神經(jīng)細胞分泌的GnRH通過調(diào)節(jié)垂體釋放促性腺激素，促性腺激素細胞分泌FSH和LH，進而作用于卵巢，促使卵巢卵泡生長和成熟，產(chǎn)生雌、孕激素，維持女性生理功能。Kisspeptin是由Kiss1基因編碼[20]在2001年被發(fā)現(xiàn)的一種肽類激素。GPR54屬G蛋白歐聯(lián)受體[21]，是Kisspeptin的受體。免疫組織化學檢測證實Kisspeptin主要分布于大鼠下丘腦弓狀核等部位[22]。研究[23]發(fā)現(xiàn)Kisspeptin與GPR54結(jié)合后能促進GnRH釋放，同時Kisspeptin可以介導E2的正負反饋，調(diào)節(jié)GnRH的分泌及HPOA，最終達到調(diào)節(jié)女性生殖功能的作用。

本研究通過造成大鼠過度瘦身模型，模擬人的消瘦狀態(tài)，通過觀察大鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量、血清性激素含量、下丘腦Kiss1及GPR54 mRNA表達水平來評價大鼠實驗前后的生殖功能變化，后期給予恢復飲食及左歸丸干預，檢測大鼠生殖功能有無變化。結(jié)果顯示：當體質(zhì)量較原始值下降17%，較空白組下降26%時，大鼠生殖功能已損害。當體質(zhì)量較原始值下降23%，較空白組下降35%時，大鼠生殖功能損害程度更大，甚至呈卵巢早衰狀態(tài)；模型大鼠血清FSH、LH水平顯著升高，同時E2水平降低；模型組大鼠下丘腦Kiss1及GPR54 mRNA表達均明顯下降。說明過度瘦身可以導致下丘腦功能明顯下降，Kiss1及GPR54 mRNA表達水平下調(diào)，從而抑制垂體分泌及釋放FSH、LH，進而導致卵巢功能降低。臨床上我們常見到過度消瘦的女性月經(jīng)異常，甚至閉經(jīng)，其生殖功能低于本年齡階段該有的水平。因此，本研究目的之一即是告誡女性不要盲目追求“骨感美”，從而影響自身健康，特別是對生殖功能的危害。

左歸丸為補益腎精的經(jīng)典方劑。有研究證實左歸丸可以通過增加大鼠卵巢、子宮肌層血管數(shù)目及卵巢、子宮肌層血管密度和管腔內(nèi)徑，來提高卵巢局部血循和子宮血運[24]。朱玲等[25，26]發(fā)現(xiàn)，左歸丸可以從免疫平衡調(diào)節(jié)、性腺軸調(diào)節(jié)、卵泡凋亡等方面改善生殖功能。本研究選用左歸丸為干預中藥，觀察其對過度瘦身造成的陰血虧虛狀態(tài)的影響。結(jié)果顯示：給予恢復飲食后，造模4周大鼠體質(zhì)量恢復為空白組的98%，卵巢功能恢復明顯，且結(jié)合左歸丸效果更佳；造模8周大鼠體質(zhì)量恢復為空白組的83%，生殖功能恢復不明顯，且結(jié)合左歸丸效果不明顯；恢復飲食可使模型大鼠體內(nèi)FSH、LH水平下降，E2水平升高；恢復飲食及恢復飲食+左歸丸都可提高模型大鼠下丘腦Kiss1及GPR54 mRNA的表達量，尤以結(jié)合左歸丸效果更佳。給予恢復飲食及左歸丸干預后，造模4周較造模8周大鼠卵巢功能恢復更明顯，且結(jié)合左歸丸效果更佳；造模8周大鼠卵巢功能恢復不明顯，可能與卵巢受損程度有關，亦或與恢復飲食及藥物干預時長有關。說明左歸丸可以通過補腎填精逆轉(zhuǎn)下降的生殖功能，證明了中醫(yī)“精血同源、腎主生殖、腎生髓充腦”的科學內(nèi)涵，可為中醫(yī)逆轉(zhuǎn)卵巢早衰的作用機制和恢復卵巢功能提供物質(zhì)基礎，為臨床防治卵巢早衰提供有效方案，為中藥抗卵巢早衰提供科學依據(jù)。

綜上所述，當體質(zhì)量較原始值下降17%時，大鼠生殖功能已明顯損害。當體質(zhì)量較原始值下降23%時，大鼠生殖功能損害程度更大，甚至呈卵巢早衰狀態(tài)。早期階段，給予恢復飲食及左歸丸可以一定程度逆轉(zhuǎn)卵巢功能。造模時間越長，大鼠卵巢功能越低下，干預后恢復程度越小。說明如果過度瘦身，即體質(zhì)量喪失越多，卵巢功能則越低下。因此，強烈呼吁廣大女性在愛美的同時，注意保護身體健康，尤其是要保護女性生殖功能，不要盲目地瘦身，追求骨感形體，最終導致生殖功能的損害。