傅雁輝，趙澤文，徐佳明，李賽英，劉 沖，魏賽金

(江西農(nóng)業(yè)大學 生物科學與工程學院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室/江西農(nóng)業(yè)大學應用微生物研究所/江西省果蔬采后處理關鍵技術及質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心, 江西 南昌 330045)

【研究意義】柑橘果實營養(yǎng)和藥用價值較高，但采后柑橘易受青綠霉侵染腐爛，不易久藏保鮮，每年都有大量的柑橘在貯藏和運輸過程中腐爛變質(zhì)，造成了嚴重的經(jīng)濟損失，青綠霉病、炭疽病、酸腐病等病原菌的侵染是使其發(fā)生腐爛變質(zhì)的主要原因之一[1-2]。當前國內(nèi)外防治柑橘果實采后生理病害主要采取控制溫度、熱處理、保鮮劑處理、氣調(diào)貯藏、涂膜處理、臭氧處理等技術手段，在生產(chǎn)實踐中發(fā)揮了重要作用[3-4]。采后柑橘主要病害是由真菌引起的，柑橘采后控制病害主要措施是使用化學殺菌劑，如咯菌腈、鄰苯基苯酚鈉、賽苯咪唑、噻菌靈、抑霉唑和嘧霉胺等，而這些化學殺菌劑因持續(xù)使用易產(chǎn)生耐藥性，正逐漸被禁止或被限制使用[5]。因此研究開發(fā)出化學殺菌劑的替代物來防治果蔬采后病害，是果蔬采后面臨的一項緊迫任務。利用拮抗微生物及其發(fā)酵活性物質(zhì)來防治果蔬采后病害，開發(fā)成天然防腐劑，減少食品中農(nóng)藥殘留、保護環(huán)境、確保人體健康等，都具有深刻的意義[6]?！厩叭搜芯窟M展】目前應用于采后柑橘病害生物防治的微生物主要有細菌[7-9]、酵母菌[10-11]、類酵母菌[12]和木霉[13]等。放線菌因能產(chǎn)生多種拮抗物質(zhì)而成為生物防治領域的一類重要微生物，并且已有多種抗生素廣泛應用到果蔬病害控制中。申光輝等[14]研究獲得的鏈霉菌T3-5菌無菌發(fā)酵液對草莓采后灰霉病菌具有較強拮抗作用外，且對草莓果實品質(zhì)具有較好的維持作用，能夠延緩果實硬度降低，延緩可溶性固形物、可滴定酸消耗和VC成分的損失。鹿連明等[15]篩選出1株米修鏈霉菌A3202其發(fā)酵產(chǎn)物對柑橘青、綠霉病和柑橘炭疽病相對防效可達100 %。張坤宇等[16]篩選出淡紫灰鏈霉菌X33對柑橘綠霉病有很強的抑制效果?！颈狙芯壳腥朦c】江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用實驗室從珙桐植株中分離得到一株產(chǎn)灰褐色孢子的鏈霉菌，命名為JD211，對菌株JD211進行形態(tài)學、生理生化特征和分子生物學鑒定其為奈良鏈霉菌(Streptomycesnaraensis)。該菌株所產(chǎn)的環(huán)己酰亞胺類活性物質(zhì)對水稻稻瘟病菌、紋枯病菌、煙草黑脛病菌、意大利青霉等植物病原菌有強烈的抑制作用[17]。本研究以鏈霉菌JD211固體菌劑發(fā)酵活性粗提物為材料，涂膜處理采后柑橘并自然貯藏，通過測定柑橘果實品質(zhì)、過敏性反應和病程相關蛋白，研究鏈霉菌JD211活性物質(zhì)涂膜對采后柑橘的影響，旨在為開發(fā)新型綠色無公害的果蔬類防腐保鮮劑提供實踐和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘采自江西九江市農(nóng)民載種柑橘樹(未打農(nóng)藥)，其品種為蜜桔，樹齡27年，果實八至九成熟。鏈霉菌JD211(StreptomycesJD211)由江西農(nóng)業(yè)大學應用微生物研究室提供。試劑(分析純)均為市售試劑。

米飯固體培養(yǎng)基：早米500 g，葡萄糖5 g，麥片20 g。

馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基(PDA)：去皮馬鈴薯200 g/L，蔗糖20 g/L，瓊脂20 g/L。

1.2 儀器與設備

JW-3022HR型高速冷凍離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-250A生化培養(yǎng)箱，韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-ID型無菌超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；721可見分光光度計，上海佑科儀表有限公司；UV759紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；HH恒溫水浴鍋，江蘇金壇市中大儀器廠；手持折光儀，江西贛儀科技有限公司；游標卡尺，上海一尺業(yè)有限公司。

1.3 鏈霉菌JD211活性物質(zhì)的粗提物制備

先將試管斜面中的JD211接種到茄形瓶中擴大培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)6～7 d，再將新鮮的早米用清水洗凈，加水浸泡24 h，瀝干水蒸煮40 min，將葡萄糖用少量蒸餾水溶解加入到米飯中，并加入麥片，攪拌均勻，加水至米飯手捏成團，落地而散。配置好的固體培養(yǎng)基分裝到蘑菇瓶中，高溫高壓滅菌2 h。再將茄形瓶中的JD211孢子用100 mL無菌水洗下，接種到固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每瓶接種15 mL孢子懸液，30 ℃培養(yǎng)8 d。取1粒米飯發(fā)酵物，置于含意大利青霉、指狀青霉培養(yǎng)皿中，30 ℃培養(yǎng)3 d，檢測活性。用蒸餾水以體積比1∶1浸提培養(yǎng)8 d的固體培養(yǎng)基24 h，離心取上清液，真空抽濾濃縮，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌得到用那他霉素標定的抑菌活性為7.98 μg/mL的無菌JD211活性粗提物。

1.4 果實處理

采摘選取沒有機械損傷、大小均勻的果實放入塑料果筐中，靜置過夜。先用2 %次氯酸消毒清洗，再用蒸餾水清洗自然晾干，最后用無菌脫脂棉吸取5 mL鏈霉菌JD211活性物涂膜處理果實，蒸餾水為對照，每種處理150個果實，重復3次[18]。晾干后用聚乙烯薄膜單果包裝，放入塑料果框中，置于室內(nèi)自然貯藏。統(tǒng)計60 d后失重率和爛果率，每隔10 d取樣測定果實品質(zhì)及抗性生理生化指標。

1.5 各項指標測定方法

1.5.1 失重率和腐爛率的測定

失重率=(果實前一次稱重-果實后一次稱重)/果實前一次稱重×100 %

腐爛率=腐爛個數(shù)/果實總數(shù)×100 %

1.5.2 果實品質(zhì)測定 可溶性固形物(SSC)含量用手持折光儀測定[19]；可滴定酸(TA)測定參考Henriod[20]；抗壞血酸(AsA)含量采用 2，6-二氯靛酚滴定法測定[21]；蒽酮比色法[22]測定總糖(TSC)含量。

1.5.3 鏈霉菌JD211對果實過敏性反應的影響 過氧化氫酶(CAT)測定參照隋麗(2009)[23]；脂氧合酶(LOX)活性測定參照李強(2008)[24]；過氧化氫(H2O2)含量采用二甲酚橙法測定[25]；硫代巴比妥酸(TBA)比色法[26]測定丙二醛(MDA)含量。

1.5.4 鏈霉菌JD211對果實病程相關蛋白的影響 幾丁質(zhì)酶(CHT)活性測定參照Mauch[27-28]的方法，β-1,3-葡聚糖酶(GUN)活性測定參照曹健康的方法[29-30]。

1.5.5 數(shù)據(jù)分析及圖形制作 采用DPS 7.05軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，顯著水平取P=0.05(差異顯著)或P=0.01(差異極顯著)。采用Excel 2016和Origin 9.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及圖形的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈霉菌JD211對意大利青霉和指狀青霉抑菌活性

如圖1所示，鏈霉菌JD211固體發(fā)酵物對意大利青霉和指狀青霉有較強的抑制效果，對意大利青霉拮抗圈平均直徑為20.02 mm，對指狀青霉拮抗圈平均直徑為25.95 mm。

2.2 貯藏效果

腐爛率和失重率是評價一種保鮮劑保鮮防腐效果的重要指標。從表1可看出，鏈霉菌JD211活性物質(zhì)涂膜處理的果實失重率為5.62 %，與對照相比涂膜處理能有效減少采后柑橘水分散失程度，其原因可能是由于鏈霉菌JD211活性物附于柑橘果皮，阻塞了果皮表面氣孔，從而減少水分散失。處理組涂膜處理果實腐爛率為10.00 %，極顯著低于對照(P<0.01)，這與鏈霉菌JD211活性物本身具有抑菌作用密切相關，在采后貯藏期間能減少病菌的侵染及病害的發(fā)生。

表1 采后柑橘不同處理自然貯藏第60天的失重率和腐爛率

Table 1 Weight loss and decay rate of postharvest citrus treated with different treatments during the 60th day of natural storage

處理失重率( %)腐爛率( %)對照6.02±0.31Aa15.33±0.77AaJD211涂膜5.62±0.39Aa10.00±0.77Bb

注：同一列不同大寫字母表示極顯著差異(P<0.01)，不同小寫字母表示顯著差異(P<0.05)。

Notes:Different capital letters within the same colμmn indicate significant difference atP<0.01, Different small letters within the same colμmn indicate significant difference atP<0.05.

2.3 鏈霉菌JD211對果實品質(zhì)的影響

果實在采后貯藏過程中，可溶性固形物、可滴定酸、抗壞血酸和總糖等物質(zhì)會隨著時間積累和消耗，它們含量的積累和消耗會影響果實的品質(zhì)。因此這些指標被視為果實品質(zhì)的重要指標。如圖2所示，可溶性固形物(SSC)含量在前期是一個積累的過程，JD211處理在第20天達到峰值，對照組在第10天達到峰值，分別為 9.30 %和8.06 %。JD211處理在第20天后開始急劇下降，并在貯藏后期第30天后趨于穩(wěn)定；對照組第20天急劇下降至最低值8.06 %，并在30 d后逐漸趨于穩(wěn)定。貯藏30～60 d期間處理組含量均高于對照組，說明鏈霉菌JD211活性物質(zhì)涂膜處理柑橘果實能夠減緩果實營養(yǎng)物質(zhì)的降解速率，延遲衰老進程，從而維持較好的風味。果實抗壞血酸含量先升后降低，處理組和對照組分別在第40和20天達到峰值，每100 g果肉中含量分別為23.00和22.05 mg。處理后期處理組含量高于對照組含量。說明鏈霉菌JD211活性物質(zhì)能有效減小果實中抗壞血酸的氧化分解，從而維持果實較高的營養(yǎng)。果實可滴定酸(TA)含量變化處理組和對照組都是先上升后下降，0～10 d可滴定酸含量積累達到峰值，分別為0.69 %和0.73 %，第10天至末期可滴定酸含量逐漸下降至最低值，貯藏第60天時可滴定酸含量處理組比對照組高41.41 %，處理組的下降程度較對照組平緩，含量比對照組高，二者差異顯著(P<0.05)。說明JD211活性物處理果實能夠減緩果實中可滴定酸的分解速率，有效保持果實的風味品質(zhì)。果實總糖(TSC)含量變化均呈平緩波動，對照組果實的波動較處理組平緩，處理組果實總糖含量在0～60 d內(nèi)產(chǎn)生兩次波峰，在貯藏第50天兩處理達到峰值其中處理組較對照組高6.46 %，0～50 d內(nèi)處理組總糖含量高于對照組，說明鏈霉菌JD211活性物處理能有效減少采后貯藏過程中對糖類的消耗，維持果實品質(zhì)。

圖1 鏈霉菌JD211對意大利青霉(A)和指狀青霉抑菌(B)效果Fig.1 Inhibitory effect of Streptomyces JD211 on P. Italialis(A) and P. digitatum(B)

圖2 鏈霉菌JD211發(fā)酵提取物對果實品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of fermentation extracts of Streptomyces sp. JD211 on fruit quality

2.4 鏈霉菌JD211對果實過敏性反應的影響

如圖3所示，果實H2O2含量變化在貯藏10 d內(nèi)均是迅速下降，對照組在第10天后H2O2含量積累逐漸上升并在第60天達到最大值46.58 μmol/g，處理組在第10天后逐漸上升并在第40天后下降至末期達到最低值9.02 μmol/g。貯藏第10天后對照組H2O2含量均高于處理組，二者差異顯著(P<0.05)。說明鏈霉菌JD211活性物涂膜處理果實，能有效降低果實膜系統(tǒng)的損害，維持植物體較強的保護性能。果實過氧化氫酶(CAT)活性變化趨勢都是逐漸波動上升，對照組和處理組CAT活性在第50天均達到峰值，其中處理組比對照組活性高22.73 %，貯藏前期對照組CAT活性高于處理組，中后期處理組CAT活性均大于對照組，二者差異顯著(P<0.05)。說明了鏈霉菌JD211活性物涂膜處理柑橘果實增強了CAT活性，提高了H2O2的分解能力，減緩了H2O2的影響。果實丙二醛(MDA)含量變化趨勢對照組是逐漸上升，并在第60天達到最大值0.25 mmol/g，處理組MDA含量變化先上升后趨于平緩，在第20天達到最大值0.89 mmol/g，對照組MDA含量在貯藏后期高于處理組，貯藏第60天對照組含量比處理組高56.84 %，二者差異顯著(P<0.05)。可見鏈霉菌JD211活性物涂膜處理可以抑制MDA含量的積累，減少膜脂過氧化程度，維持膜系統(tǒng)的完整性，從而對逆境有較好的抗性。果實脂氧合酶(LOX)活性對照組變化趨勢是先上升后趨于平緩，在第20天達到峰值。鏈霉菌JD211活性物涂膜處理LOX活性呈下降變化，第60天對照組LOX活性較處理組高 62.34 %， 貯藏期間LOX活性處理組低于對照組，可見鏈霉菌JD211活性物涂膜處理降低了LOX活性，減緩果實膜脂過氧化。

2.5 鏈霉菌JD211對果實病程相關蛋白的影響

如圖4所示，果實β-1,3-葡聚糖酶(GUN)活性呈單峰變化。對照組和處理組GUN活性在貯藏前期均快速上升至峰值，隨后迅速下降。其中第20天處理組GUN活性較對照組高53.35 %，貯藏10～50 d期間處理組酶活性顯著(P<0.05)高于對照組，可見鏈霉菌JD211活性物涂膜處理，增強了GUN活性，提高了果實抗病性。果實幾丁質(zhì)酶(CHT)活性變化表現(xiàn)為先上升后下降對照組的峰值出現(xiàn)在第20天為0.0314 U/g FW，涂膜處理峰值出現(xiàn)在第30天為0.0283 U/g FW。涂膜處理的峰值低于對照組，其上升和下降的幅度均小于對照組，貯藏第30天后，處理組CHT活性均大于對照組，第60天處理組較對照組高94.28 %，可見涂膜處理可以減緩果實貯藏過程中的CHT活性的波動，增強抗病性。

圖3 鏈霉菌JD211對果實過敏性反應的影響Fig.3 Effect of streptomyces JD211 on allergic reaction of fruits

圖4 鏈霉菌JD211對果實病程相關蛋白的影響Fig.4 Effect of Streptomyces JD211 on Pathogenesis-related protein in fruit

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)采用鏈霉菌JD211固體發(fā)酵提取物涂膜處理采后柑橘，自然貯藏條件下，能有效減少采后柑橘果實失重率和腐爛率，減緩可溶性固形物、可滴定酸、抗壞血酸和總糖的損耗、變化，貯藏后期對可滴定酸損耗有明顯減緩效果，維持了果實的品質(zhì)。這與申光輝等[14]對草莓防腐保鮮結(jié)果類似。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一，其含量的多少可以反應出植物的抗逆性和膜系統(tǒng)受損傷程度，隨著貯藏時間的增加，果實逐漸衰老，MDA含量也會逐漸上升。脂氧合酶(LOX)是廣泛存在于植物體中的與膜脂過氧化過程有關的酶，其活性的增加可能會加速細胞膜脂過氧化，促進果實衰老[31]。鏈霉菌JD211活性物涂膜處理柑橘果實能有效的減少貯藏期間MDA的積累，延緩LOX活性高峰的出現(xiàn)，處理組LOX活性直到第50天才達到峰值，說明JD211涂膜處理延緩了細胞膜脂過氧化程度，從而有效減緩了柑橘果實發(fā)病程度和時間。H2O2是生物體內(nèi)各種生理代謝的副產(chǎn)物，是一種氧化脅迫因子，植物組織遭受各種非生物及生物脅迫時，它的含量迅速升高，過量H2O2會對細胞產(chǎn)生毒害作用[32]。過氧化氫酶(CAT)通過清除植物組織細胞內(nèi)H2O2，增強抗氧化能力。植物在受到病原菌侵染后，通過與病原菌相互作用誘導防衛(wèi)基因的活化，合成抗菌物質(zhì)及防御蛋白，β-1,3-葡聚糖酶(GUN)和幾丁質(zhì)酶(CHT)都屬于這類蛋白。CHT和GUN主要降解幾丁質(zhì)和葡聚糖，這兩種物質(zhì)都是病原菌細胞壁的主要成分[33]。本研究發(fā)現(xiàn)鏈霉菌JD211活性物涂膜處理延緩了GUN和CHT活性的峰值和活性，提高和延長了病程相關蛋白酶活性，增強了果實的抗病性。

4 結(jié) 論

鏈霉菌JD211固體發(fā)酵活性物不僅對柑橘病原真菌意大利青霉和指狀青霉有強烈的拮抗作用，同時涂膜處理采后柑橘，對采后柑橘自然貯藏果實品質(zhì)維持、果實過敏性和抗病性有較好的效果，具有開發(fā)成采后柑橘保鮮劑的潛力。