青海高原披堿草屬種間天然雜種的細(xì)胞學(xué)鑒定

路興旺 劉 博 劉瑞娟 竇全文*

(1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所,中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810008； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049； 3.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所,青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810008)

披堿草屬(ElymusL.)是禾本科(Poaceae)小麥族(Triticeae)中含有物種種類最多、分布范圍最廣的一個(gè)屬，其中包含大約150個(gè)由小麥族不同近緣屬物種通過(guò)自然雜交形成的物種[1]。研究表明，披堿草屬物種基因組組合由St、H、W、Y和P 5個(gè)基本基因組組成[2～3]，其中St基因組來(lái)源于擬鵝觀草屬(Pseudoroegneria(Neveski)L?ve)、H基因組來(lái)自于大麥屬(HordeumL.)、W基因組來(lái)自于澳冰草屬(Australopyrum(Neveski)L?ve)、P組來(lái)自于冰草屬(AgropyronJ.Gaertn.)、Y基因組的來(lái)源迄今尚不明確[3～4]。披堿草屬物種為典型的異源多倍體物種，所有物種由上述不同的基因組組合組成。北美學(xué)者L?ve依據(jù)這些物種間共享基因組以及種間可雜交的特性，將上述所有物種歸并于一個(gè)大屬，即披堿草屬[1]；然而，我國(guó)分類學(xué)家顏濟(jì)依據(jù)披堿草屬形態(tài)學(xué)和基因組組成研究結(jié)果將其劃分為以下幾個(gè)屬：披堿草屬(ElymusL.，基因組組合為StH)、鵝觀草屬(RoegneriaC.Koch，基因組組合為StY)、以禮草屬(KengiliaYen et J.L.Yang，基因組組合為StYP)、彎穗草屬(Campeiostachys，基因組組合為StHY)以及花鱗草屬(Anthosachne，基因組組合為StWY)[5]。

披堿草屬物種呈現(xiàn)復(fù)雜的網(wǎng)狀進(jìn)化特征，種間雜交基因滲透普遍存在[6]。Mason-Gamer等[7]發(fā)現(xiàn)在北美和歐亞大陸間的四倍體披堿草屬間存在一定的種間雜交基因滲透現(xiàn)象；Wu等[8]揭示在同域分布的披堿草屬物種E.alaskanus(Scribn. and Merr.) Love,E.caninus,E.fibrosus和E.mutabilis之間發(fā)生了種間雜交基因漸滲，存在雙向或單向的基因流。甚至，在親緣關(guān)系很遠(yuǎn)的物種間，披堿草屬也可發(fā)生種間雜交基因滲透，如在E.repens中檢測(cè)到了來(lái)自Taeniatherum屬的GBSSI序列[9],以及來(lái)自Bromus和Panicum屬的ITS序列[10]，這在一定程度上揭示了同域分布的披堿草屬種間雜交基因滲透不僅發(fā)生在近緣種間，而且在親緣關(guān)系很遠(yuǎn)的物種間也可能發(fā)生。

青海高原是披堿草屬物種多樣性分布地區(qū)，該地區(qū)幾乎分布所有基因組組合類型的披堿草屬物種(除StWY外)，該屬中一些物種類型在青海高原地區(qū)具有高度變異和廣泛的適應(yīng)特性。該地區(qū)披堿草屬不同種間雜交、甚至披堿草屬物種與其他近緣屬物種之間雜交基因滲透，有可能在披堿草屬物種多樣性以及物種遺傳多樣性形成中發(fā)揮著重要作用。

不同物種間通過(guò)天然雜交形成F1代雜種，是種間發(fā)生基因滲透的關(guān)鍵初始步驟。在本研究中，我們?cè)趯?duì)披堿草屬物種野外天然雜交形成的不育材料的觀察、采集基礎(chǔ)上，利用細(xì)胞遺傳學(xué)手段對(duì)雜種的基因組來(lái)源進(jìn)行了鑒定分析，進(jìn)一步確定了天然雜種的身份。研究結(jié)果可以為研究披堿草屬物種間雜交基因滲透提供重要的依據(jù)，同時(shí)鑒定出的部分天然雜種，通過(guò)進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)有可能作為生態(tài)草種或優(yōu)良牧草品種，具有潛在的種質(zhì)材料價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料垂穗披堿草(ElymusnutansGriseb.)和鵝觀草屬(RoegneriaC.Koch)雜種，垂穗披堿草和達(dá)烏力披堿草(E.dahuricusTurcz. ex Griseb)雜種以及垂穗披堿草和大穎草種(KengiliagrandiglumisKeng)雜種采自青海海晏(平均海拔3 200 m)；垂穗披堿草和糙毛以禮草(KengiliahirsutaKeng)雜種，老芒麥(ElymussibiricusL.)和達(dá)烏力披堿草種間雜種以及糙毛以禮草和賴草(Leymussecalinus(Georgi) Tzvel.)雜種采自青海貴南(平均海拔3 100 m)。

1.2 方法

1.2.1 種間雜種根尖獲取

由于所有正常生長(zhǎng)的披堿草屬物種種子在秋季表現(xiàn)落粒特性，結(jié)實(shí)正常的小穗在秋季均從主穗軸脫落，但是不育小穗依然可以保留在主穗軸上，因此在秋冬季，在野外觀察披堿草穗部小穗的保留特征可以對(duì)天然雜種進(jìn)行初步篩選鑒定，并統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率以及與同域分布披堿草物種進(jìn)行形態(tài)比較，可以初步確定在形態(tài)上呈現(xiàn)出較多中間性狀且結(jié)實(shí)率為零的個(gè)體為種間雜種。將鑒定出的個(gè)體進(jìn)行整體活體采挖，移植至中科院西北高原生物所院內(nèi)進(jìn)行盆栽，待恢復(fù)生長(zhǎng)一段時(shí)間后，獲取新鮮生長(zhǎng)出的次生根，供進(jìn)一步細(xì)胞學(xué)鑒定利用。

1.2.2 染色體制片

取根尖后放于1.5 mL EP管中，打開(kāi)管口并保持管內(nèi)濕潤(rùn)，在8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下的N2O氣室中處理2 h，處理結(jié)束后向每管中加入500 μL卡諾固定液(無(wú)水酒精∶冰醋酸=3∶1，體積比)，4℃固定30 min以上，然后將固定好的根尖置于干凈的載玻片上，滴加一滴45%的醋酸，蓋上蓋玻片并用鑷子輕輕敲打以使根尖細(xì)胞分散，接著將片子在酒精燈上微熱幾秒，用大拇指用力垂直壓片，最后利用相差顯微鏡(Olympus Bx43)先在10倍鏡下觀察，然后選擇分裂相多、染色體分散和形態(tài)清晰的片子轉(zhuǎn)移至40倍鏡下確定染色體形態(tài)和數(shù)目，最終，選擇分裂相較好的制片于-80℃冰箱中冰凍30 min以上。

1.2.3 探針制備

重復(fù)序列由寡核苷酸序列pAs1代表[11]，寡核苷酸片段pAs1和(AAG)10由生工生物工程(上海)有限公司合成，并在5′端經(jīng)TAMRA(紅色)或FITC(綠色)熒光基團(tuán)修飾，作為熒光原位雜交(FISH)探針。

提取糙緣擬鵝觀草(Pseudoroegneriastipifolia(Czern. ex Nevski) A.L?ve,2n=14,StSt基因組)、布頓大麥(HordeumbogdaniiWilensky.,2n=14，HH基因組)、扁穗冰草(AgropyroncristatumJ.Gartern.，2n=14，PP基因組)以及賴草(Leymussecalinus(Georgi) Tzvel.，2n=28，NsNsXmXm基因組)基因組DNA，經(jīng)120℃高溫消解2 min，然后利用隨機(jī)引物標(biāo)記法將消解后的基因組DNA用Tetramethyl-rhodamine-5-dUTP(紅色)或fluorescein-12-dUTP(綠色)標(biāo)記，作為基因組原位雜交(GISH)探針。

1.2.4 熒光原位雜交

制備好的染色體制片在-80℃揭片，自然干燥；配制雜交液(50%甲酰胺、50%硫酸葡聚糖、1 mg鮭魚(yú)精DNA、1 μL 20×SSC和10 ng探針DNA)；將干燥的染色體制片放入0.2 mol·L-1溶于70%酒精的NaOH溶液中變性10 min；隨后取出立即置于-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇中，脫水干燥；FISH寡核苷酸探針無(wú)需變性，可以直接加入雜交液中雜交，GISH探針與雜交液混合后在沸水中熱變性10分鐘；接著將染色體制片放置在潮濕的密封盒中，37℃避光過(guò)夜雜交(二次雜交不需要再變性)；用蒸餾水沖洗后，洗耳球吹干制片的正面，向制片中心加入10 μL含DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)的抗熒光衰減封片劑封片，然后在熒光顯微鏡(Olympus Bx63)下觀察拍照，獲取的圖片在Adobe Photoshop 6.0中進(jìn)行調(diào)節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 垂穗披堿草和鵝觀草屬物種間雜種的鑒定

此雜種在垂穗披堿草居群中發(fā)現(xiàn)，根尖染色體計(jì)數(shù)為35條，為五倍體雜種，初步推斷可能是六倍體垂穗披堿草和一四倍體披堿草物種間的雜交F1代。進(jìn)一步利用順序FISH/GISH進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析，F(xiàn)ISH和GISH雜交特征顯示7條染色體為H基因組染色體，14條染色體為St基因組染色體，其他14條染色體為Y基因組染色體(圖1:a1～a2)，此雜種染色體組成為StStYYH。因?yàn)榇顾肱麎A草染色體組成為StStHHYY[12]，所以雜種另一親本染色體組成必然為StStYY，并且該地區(qū)同域分布有大量StStYY四倍體鵝觀草屬物種[13]，另外雜種中St、Y基因組中pAs1和AAG雜交FISH特征與我們?cè)谇捌谘芯恐薪沂镜脑摰貐^(qū)垂穗披堿草和部分四倍體鵝觀草染色體FISH特征具有高度相似性[12～13]，由此我們判定此雜種為垂穗披堿草和一鵝觀草屬物種間的種間雜種。

2.2 垂穗披堿草和達(dá)烏力披堿草種間雜種的鑒定

此雜種同樣發(fā)現(xiàn)于垂穗披堿草居群中，染色體計(jì)數(shù)為42條。利用順序FISH/GISH鑒定結(jié)果表明，此雜種個(gè)體具有14條完整的St組染色體，13條完整的Y基因組染色體，13條完整的H基因組染色體，以及2條H基因組和Y基因組之間易位染色體(圖1:b1～b3)，2條易位染色體呈單倍性狀態(tài)，初步判定此雜種為兩個(gè)染色體組成為StStHHYY披堿草物種間的同倍體雜種。由于該地區(qū)同域分布有大量的達(dá)烏力披堿草物種，其染色體組為StStYYHH[14]，達(dá)烏力披堿草物種染色體組中穩(wěn)定存在一對(duì)H/Y易位染色體[14～15]，雜種中鑒定出的2條單倍性狀態(tài)的易位染色體的FISH和GISH特征與達(dá)烏力披堿草物種中存在的物種特異性易位染色體呈現(xiàn)高度一致性[14～15]，另外雜種穗形介于達(dá)烏力披堿草和垂穗披堿草穗形之間。由此，我們判定此雜種為垂穗披堿草和達(dá)烏力披堿草間的種間雜種。

2.3 老芒麥和達(dá)烏力披堿草種間雜種的鑒定

此雜種根據(jù)形態(tài)學(xué)特征在老芒麥居群中發(fā)現(xiàn)，染色體計(jì)數(shù)為35條。由于老芒麥為異源四倍體物種(2n=28，染色體組為StStHH)，推測(cè)此雜種為老芒麥和一六倍物種間的雜種，進(jìn)一步利用順序FISH/GISH進(jìn)行鑒定，結(jié)果揭示此雜種具有14條完整的St組染色體，6條完整的Y組染色體，13條完整的H組染色體，以及2條H基因組和Y基因組之間易位染色體(圖1:c1～c2)，雜種染色體組成為StStHHY。初步推斷，此雜種為四倍體老芒麥和六倍體StStHHYY披堿草物種間的雜種。同樣，此雜種中2條處于單倍性狀態(tài)的H和Y易位染色體與達(dá)烏力披堿草物種特異性易位染色體高度一致，由此我們判定此雜種為老芒麥和達(dá)烏力披堿草間種間雜種。

圖1 披堿草屬物種不同種間雜種根尖有絲分裂中期染色體的FISH和GISH鑒定 a.垂穗披堿草和鵝觀草間雜種(染色體數(shù)為35)；b.垂穗披堿草和達(dá)烏力披堿草間雜種(染色體數(shù)為42)；c.老芒麥和達(dá)烏力披堿草間雜種(染色體數(shù)為35)；d.垂穗披堿草和糙毛以禮草間雜種(染色體數(shù)為42)；e.垂穗披堿草和大穎草間雜種(染色體數(shù)為42)；f.糙毛以禮草和賴草間雜種(染色體數(shù)為35)a1、b1、c1、d1、e1、f1利用pAs1(紅色)和(AAG)10(綠色)為探針組合進(jìn)行FISH雜交；a2、b2、c2、d2、e2、f2為利用St基因組(紅色)和H基因組(綠色)為探針組合的順序GISH雜交；e3和f3為分別利用P基因組(紅色)和H基因組(綠色)為探針組合、以及賴草基因組(紅色)和P基因組(綠色)為探針組合的GISH雜交。箭頭所示為基因組間易位染色體。Fig.1 FISH and GISH patterns on root tips mitotic metaphase cells of interspecific hybrids in Elymus a,b,c,d,e,f are hybrids between E.nutans and Roegneria,E.nutans and E.dahuricus,E.sibiricus and E.dahuricus,E.nutans and K.hirsuta,E.nutans and R.grandiglumis and K.hirsuta and L.secalinus respectively a1,b1,c1,d1,e1 and f1 are FISH patterns hybridized by probes of pAs1(red) and(AAG)10(green); a2,b2,c2,d2,e2 and f2 are sequential GISH patterns hybridized by probed St(red) and H(green) genomic DNAs; e3 and f3 are GISH patterns probed by combination of probed P(red) and H(green) genomic DNAs,and combination of probed L.secalinus(red) and P(green) genomic DNAs,respectively.The arrows indicate the inter-genomic translocations.

2.4 垂穗披堿草和糙毛以禮草種間雜種的鑒定

此雜種在垂穗披堿草和糙毛以禮草分布的中間地帶通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察得到，染色體觀察計(jì)數(shù)為42條，進(jìn)一步利用細(xì)胞學(xué)鑒定揭示此雜種含有13條完整的St組染色體，14條完整的Y組染色體，一條St和Y易位染色體，7條H組染色體以及其他7條形態(tài)較長(zhǎng)的染色體(圖1:d1～d2)，根據(jù)FISH雜交特征推斷7條形態(tài)較長(zhǎng)染色體應(yīng)該為P基因組染色體，判定雜種染色體組成為StStYYHP，推測(cè)為垂穗披堿草和一染色體組成為StStYYPP物種間的雜種。由于同域伴生有大量糙毛以禮草物種，染色體組成為StStYYPP，其染色體分子核型特征與此雜種中部分St、Y和全部P組染色體FISH雜交信號(hào)呈現(xiàn)高度相似性[16]。由此，我們判定此雜種為垂穗披堿草和糙毛以禮草種間雜種。垂穗披堿草核型中，染色體組間易位經(jīng)常發(fā)生[14,17]，此雜種的一條易位染色體可能來(lái)自親本垂穗披堿草。

2.5 垂穗披堿草和大穎草種間雜種的鑒定

此雜種通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察在大穎草居群邊緣地帶發(fā)現(xiàn)，染色體觀察計(jì)數(shù)為42條。利用FISH和GISH細(xì)胞學(xué)鑒定此雜種分別具有14條St組和Y組染色體，7條H組染色體，7條P組染色體(圖1:e1～e3)，染色體組成為StStYYHP，推測(cè)其為六倍體StStYYHH和StStYYPP物種間天然雜種。由于在此大穎草居群周邊伴生有大量垂穗披堿草物種，結(jié)合此雜種與大穎草和垂穗披堿草染色體分子核型特征[14,17]分析，我們判定此雜種為垂穗披堿草和大穎草種間雜種。

2.6 糙毛以禮草和賴草種間雜種的鑒定

此雜種在賴草居群分布生境中得到，染色體根尖計(jì)數(shù)為35條。相鄰區(qū)域分布有大量的垂穗披堿草和糙毛以禮草物種，初步推測(cè)為四倍體賴草和六倍體垂穗披堿草或糙毛以禮草雜種，利用pAs1和AAG探針雜交顯示此雜種染色體上AAG雜交信號(hào)較含StYH基因組的雜種顯著減少(圖1:f1)，進(jìn)一步利用H基因組和St基因組探針雜交顯示無(wú)明顯H基因組信號(hào)檢出，7條染色體為St組染色體，顯示St信號(hào)較弱的7條為Y組染色體，7條較大染色體上有微弱H基因組信號(hào)分布，其余14條染色體無(wú)任何雜交信號(hào)(圖1:f2)。為進(jìn)一步確定染色體的身份，利用賴草基因組和冰草基因組探針進(jìn)行第三次雜交，結(jié)果表明此雜種中含有14條完整的賴草染色體和7條P基因組染色體(圖1:f3)。由此，我們推定此雜種為賴草和糙毛以禮草種間雜種，染色體組成為StYPNsXm。

3 討論

本研究揭示了3個(gè)五倍體雜種，其中StStHHY和StStYYH雜種為披堿草屬內(nèi)不同倍性物種間非對(duì)稱雜交后代，兩種雜種染色體組合類型在青海高原不同地區(qū)被發(fā)現(xiàn)和鑒定，StStHHY雜種被推定為四倍體老芒麥和其他未知六倍體披堿草間雜種[18～19],StStYYH雜種被推定為垂穗披堿草和短穎鵝觀草(R.breviglumisKeng et S.L.)間雜種[20]。在本研究中揭示的上述兩個(gè)五倍體雜種類型有可能與其他研究者報(bào)道的部分五倍體雜種來(lái)自相同的親本物種。本文揭示的糙毛以禮草和賴草之間的五倍體雜種為一未曾報(bào)道過(guò)的類型。文中揭示的3個(gè)六倍體型雜種，其中垂穗披堿草與大穎草間雜種與相吉山[20]所報(bào)道的來(lái)自相同的親本物種，達(dá)烏力披堿草與垂穗披堿草種間雜種有可能與相吉山[20]未能明確鑒定的一種垂穗披堿草和六倍體雜種來(lái)源相同，糙毛以禮草與垂穗披堿草間雜種未見(jiàn)報(bào)道。另外，結(jié)合本研究披堿草屬物種間天然雜種的鑒定以及其他研究結(jié)果，我們認(rèn)為在青海高原地區(qū)披堿草屬物種間天然雜交高頻率發(fā)生，深入系統(tǒng)地對(duì)該地區(qū)天然雜種進(jìn)行鑒定分析，有可能發(fā)現(xiàn)更多披堿草物種間、乃至屬間的雜種類型。

相吉山[20]在對(duì)種間雜種鑒定時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同基因組間染色體有較高頻率的易位發(fā)生，但是不能確定其易位來(lái)源，其認(rèn)為在雜種中存在的相互易位染色體有可能是雜種形成過(guò)程中產(chǎn)生的，而其他易位染色體應(yīng)該源自親本物種。在本研究中雜種也有少量易位檢出，而且檢出的易位染色體呈單倍性狀態(tài)，在雜種類型沒(méi)有檢測(cè)到相互易位染色體存在，對(duì)比分析其親本物種的染色體特征，我們認(rèn)為雜種中檢測(cè)到的易位來(lái)自于親本物種，因?yàn)殡s種形成過(guò)程本身不能產(chǎn)生易位。

種間雜交基因滲透有可能是披堿草屬物種和遺傳多樣性形成的一個(gè)重要驅(qū)動(dòng)因子[21]。以禮草屬多個(gè)物種是青海高原地區(qū)特有物種，而且某些物種種下有變種發(fā)生[22]，本研究以及前人研究[19～20]揭示以禮草屬物種大穎草及糙毛以禮草與同域分布的垂穗披堿草、無(wú)芒披堿草、乃至賴草屬物種間極易產(chǎn)生雜交，這些結(jié)果提示種間雜交有可能在該地區(qū)以禮草屬物種多樣性形成中起著重要作用。垂穗披堿草(E.nutans)是高寒區(qū)最為引人關(guān)注的一個(gè)草種，且在生境上具有普遍的適應(yīng)特性，在海拔1 000～5 000 m的河灘、山坡、灌叢以及高寒草地等均有廣泛分布，從形態(tài)學(xué)、生化、分子、核型等不同水平上均呈現(xiàn)很高的變異特性[12,23～25]。垂穗披堿草自交結(jié)實(shí)率高，為自花授粉植物[26],但是遺傳多樣性檢測(cè)揭示居群內(nèi)多樣性高于居群間多樣性[23～25]。在本研究中揭示垂穗披堿草可以與多個(gè)不同的披堿草屬物種發(fā)生種間雜交，這種結(jié)果提示種間雜交有可能是高原地區(qū)垂穗披堿草物種遺傳多樣性形成的一個(gè)重要驅(qū)動(dòng)因素，局部地域分布的垂穗披堿草多樣性形成有可能受到同域分布披堿草物種雜交基因流的強(qiáng)烈影響。種間雜交形成雜種是種間基因滲透的初始步驟，進(jìn)一步回交形成后代才是種間基因滲透的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在本研究中我們只是得到了有關(guān)披堿草屬不同種間可以形成雜種的證據(jù)，而進(jìn)一步利用實(shí)驗(yàn)手段揭示回交的程度及在多樣性形成中的作用是非常必要的。

披堿草屬中眾多物種為青海高原天然草場(chǎng)優(yōu)質(zhì)牧草，尤其是老芒麥和垂穗披堿草在高寒地區(qū)表現(xiàn)出抗逆性強(qiáng)、生物量高、適口性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被馴化為優(yōu)良牧草品種在飼草生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。本研究揭示的老芒麥、垂穗披堿草和其他物種間的雜種，有可能作為特殊種質(zhì)材料進(jìn)行進(jìn)一步育種利用。利用非對(duì)稱雜交雜種，如StStHHY或StStYYH雜種，進(jìn)一步與四倍親本物種回交，在后代中有可能選育出攜帶有不同染色體的單體附加材料，可以作為優(yōu)異基因定位、發(fā)掘的良好材料。本研究鑒定出的糙毛以禮草和賴草間雜種具有St、P、Y、Hs和Xm各一套染色體組，對(duì)這個(gè)材料直接加倍，有可能獲得結(jié)實(shí)性良好、遺傳相對(duì)穩(wěn)定的材料。糙毛以禮草在沙丘與草地過(guò)渡生態(tài)環(huán)境中具有很好適應(yīng)性，且種子結(jié)實(shí)率高；而賴草抗旱性強(qiáng)、根莖系統(tǒng)強(qiáng)大，但是結(jié)實(shí)率極低。因此，對(duì)其雜種類型的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用，有可能培育出抗逆性強(qiáng)大、結(jié)實(shí)率較高的可用于高寒地區(qū)生態(tài)恢復(fù)利用的新型草種。