羅藝蘋 劉可智 喻明蘭 梁雪梅 張濤 向波

精神分裂癥是高遺傳度的多基因神經(jīng)精神疾病[1-2]。多項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）發(fā)現(xiàn) G蛋白 α亞基 13（GNA13）基因與精神分裂癥存在關(guān)聯(lián)[3-4]。分析精神分裂癥患者前額皮質(zhì)的DNA甲基化數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化發(fā)生改變區(qū)域與精神分裂癥遺傳風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域相重疊[5]；構(gòu)建精神分裂癥特異性甲基化網(wǎng)絡(luò)（schizophrenic differential methylation network，SDMN）發(fā)現(xiàn)GNA13基因是精神分裂癥特異性甲基化基因中主要的高甲基化基因[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者大腦前額皮質(zhì)中的GNA13基因表達(dá)減少，同時(shí)GNA13-ERK1-eIF4G2-CYFIP1信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)下調(diào)[7]，而該信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)則主要參與神經(jīng)元的突觸發(fā)育和功能形成，以及大腦功能連接，可能與精神分裂癥認(rèn)知功能障礙相關(guān)[8-10]。因此，GNA13基因既是影響精神分裂癥發(fā)生發(fā)展中多基因聯(lián)合效應(yīng)的易感基因[11]，也是精神分裂癥患者腦組織中發(fā)生特異性高甲基化的主要基因。基于此，推測(cè)GNA13基因異?？赡苡绊懮窠?jīng)細(xì)胞形態(tài)和突觸可塑性，從而導(dǎo)致精神分裂癥的發(fā)生。本研究采用動(dòng)物細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，以慢病毒轉(zhuǎn)染的方式敲低原代神經(jīng)元細(xì)胞的Gna13基因，通過基因表達(dá)差異性分析，初步探索其功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象由北京華阜康生物科技股份有限公司提供C57BL6N野生型懷孕小鼠10只，經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將出生后24 h內(nèi)的幼鼠處死，取其大腦皮層組織進(jìn)行原代神經(jīng)元培養(yǎng)。本研究動(dòng)物的使用等所有操作已通過西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 原代神經(jīng)元培養(yǎng)與慢病毒感染 參考并在BEAUDOIN等[12]的培養(yǎng)方案上，改用木瓜蛋白酶代替胰蛋白酶將出生24 h之內(nèi)幼鼠的大腦皮層組織制備成單細(xì)胞懸液，接種在24孔板上，進(jìn)行原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)。在離體的第3天，用干擾Gna13基因的重組慢病毒載體Y1645（和元生物技術(shù)股份有限公司，上海）感染實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，空載的慢病毒載體Y007（和元生物技術(shù)股份有限公司，上海）感染空載對(duì)照組細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞不做任何干預(yù)。將上述細(xì)胞在同等實(shí)驗(yàn)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，病毒的感染復(fù)數(shù)為10。在感染72 h后，將所有細(xì)胞分成3份分別做蛋白表達(dá)分析、mRNA表達(dá)分析、高通量測(cè)序。

1.2.2Gna13基因的mRNA表達(dá)水平分析 使用TRIzol Reagent（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）提取所有細(xì)胞中的RNA。用HifairTMIII 1stStrand cDNA合成試劑盒 （翊圣生物科技有限公司，上海）逆轉(zhuǎn)錄得到總計(jì)2 μg的RNA。使用10 ng RNA的HieffTMqPCRSYBR?Green Master Mix（Low Rox Plus）（翊圣生物科技有限公司，上海）在25 μL反應(yīng)混合物中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性 10 s，58℃退火 20 s，72℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物使用熒光信號(hào)檢測(cè)。

1.2.3Gna13基因蛋白表達(dá)水平分析 用RIPA裂解緩沖液（碧云天生物技術(shù)有限公司，上海）裂解細(xì)胞后，獲取蛋白質(zhì)，用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）檢測(cè)其濃度。通過分離、轉(zhuǎn)膜，將蛋白質(zhì)在5%脫脂乳的TBS-Tween（TBS-T，50 mmol/L Tris （pH 7.6），150 mmol/L NaCl，0.1%Tween-20）中封膜。然后將膜與一抗兔抗 GNA13 抗體（Rb anti-GNA13 antibody）（目錄號(hào)OM161046；稀釋度 1:500；Omni.Abs，美國(guó)）孵育，4℃過夜。用TBST洗滌3次，與氧化物酶標(biāo)記的生物素二抗 （biotinylated secondary antibodies）（目錄號(hào)711-005-152；稀釋度1:4000；目錄號(hào) 715-005-150； 稀釋度 1:6000；Jackson Immuno Research，美國(guó)）和鼠抗β-肌動(dòng)蛋白抗體（Ms anti-β-actin antibody）（目錄號(hào) ab8226； 稀釋度 1:10000；Abcam，美國(guó)）在室溫下孵育1 h。使用β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)源性對(duì)照，將GNA13蛋白的光密度條帶用Image J 軟 件 （Image J National Institutes of Health，Bethesda，美國(guó)）進(jìn)行分析。

1.2.4 構(gòu)建文庫(kù)和RNA測(cè)序 使用分光光度計(jì)2000（Nanodrop Technologies，美國(guó)）和 Agilent 2100（Agilen Technologies，美國(guó)）測(cè)定RNA的濃度和完整系數(shù)（integrity number，IN）。通過瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定RNA完整性，用高質(zhì)量RNA樣品（OD 260/280=1.8～2.0）構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。然后使用Illumina（美國(guó)）的TruSeqTMRNA樣品制備試劑盒，取5 μg RNA制備RNA-seq轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)。首先，用polyA-oligo dT分離mRNA，然后通過碎片緩沖液將mRNA片段化，通過隨機(jī)合成六聚體制備cDNA。Illumina（美國(guó)）文庫(kù)構(gòu)建用于處理合成的cDNA，在2%低含量瓊脂糖上用200～300 bp的目標(biāo)cDNA片段選擇文庫(kù)大小，然后使用Phusion DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)。通過TBS380定量后，用高通量測(cè)序技術(shù)4000（Illumina HiSeq 4000，美國(guó)，2×150 bp 讀取長(zhǎng)度）對(duì)配對(duì)端的RNA-seq測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 測(cè)序短序列匹配原始配對(duì)端讀數(shù)由含有默認(rèn)參數(shù)的SeqPrep和Sickle進(jìn)行修剪和質(zhì)量控制。然后使用TopHat軟件[13]將讀數(shù)分別與定向模式的參考基因組比對(duì)。Bowtie映射標(biāo)準(zhǔn)如下：測(cè)序讀數(shù)與基因組一對(duì)一匹配，最多允許2個(gè)錯(cuò)配，無插入或缺失等錯(cuò)誤。然后根據(jù)基因位點(diǎn)的深度擴(kuò)展基因區(qū)域獲得操縱子。此外，整個(gè)基因組被分成多個(gè)可共享5 kbp的15 kbp視窗。新的轉(zhuǎn)錄區(qū)域定義為含有2個(gè)以上連續(xù)視窗，而且沒有基因區(qū)域的重疊，其中每個(gè)視窗可以讀取2個(gè)相同方向的映射。

1.2.6 基因表達(dá)分析 用R軟件edgeR[14]對(duì)實(shí)驗(yàn)組、空載對(duì)照組和對(duì)照組進(jìn)行基因表達(dá)的差異性分析（differential expression genes，DEG），使用每千堿基外顯子的片段對(duì)應(yīng)每百萬映射讀數(shù)（fragments per kilobase of exon per million mapped reads，F(xiàn)RKM）方法計(jì)算每個(gè)轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平，用LI等[15]研究中RNA測(cè)序期望值最大化方法定義基因豐度。

1.2.7 基因的 Phenotype 表型、Gene ontology（GO）以及Kyotoencyclopediaofgeneandgenomes（KEGG）分析 對(duì)差異基因用WebGestalt軟件[16]進(jìn)行Phenotype表型、GO以及KEGG富集分析，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，經(jīng)多重校正 （false discovery rate，F(xiàn)DR）后P＜0.05的相關(guān)表型、生物學(xué)通路以及KEGG pathway為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用 SPSS 19.0版（Chicago，IL，美國(guó)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)組、空載對(duì)照組和對(duì)照組mRNA和蛋白表達(dá)水平組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用最小顯著差異法（least-significant difference，LSD）， 檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Gna13基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平3組間Gna13基因的 mRNA（F=11.02，P=0.01）和蛋白（F=504.95，P＜0.01）表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較，實(shí)驗(yàn)組mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于空載對(duì)照組和對(duì)照組（P＜0.05），空載對(duì)照組與對(duì)照組之間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）（表1與圖 1）。

表1 小鼠大腦皮層神經(jīng)元感染重組病毒后Gna13基因mRNA和蛋白表達(dá)水平

圖1 小鼠大腦皮層神經(jīng)元感染重組病毒后Gna13蛋白表達(dá)水平電泳圖。對(duì)照組為未經(jīng)處理的正常神經(jīng)元，實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染Gna13基因重組慢病毒（Y1645）的神經(jīng)元，空載對(duì)照組為轉(zhuǎn)染空載慢病毒載體（Y007）的神經(jīng)元

2.2 基因功能分析

2.2.1 基因表達(dá)差異分析 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，表達(dá)有差異的基因共211個(gè)（P＜0.05，F(xiàn)DR校正），其中表達(dá)上調(diào)基因共141個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因共70個(gè)（圖 2）。

2.2.2 表型富集分析表型富集分析表明，表達(dá)上調(diào)基因主要與生存異常、老化異常、腎小管形態(tài)異常等表型相關(guān)（P＜0.05，F(xiàn)DR校正），表達(dá)下調(diào)基因主要與異常有絲分裂、腦形態(tài)異常、產(chǎn)前發(fā)育遲緩等表型相關(guān)（P＜0.05，F(xiàn)DR 校正）（表 2）。

圖2 神經(jīng)元轉(zhuǎn)染重組病毒后基因差異表達(dá)火山圖。紅色點(diǎn)代表實(shí)驗(yàn)組相較對(duì)照組表達(dá)下調(diào)的基因，藍(lán)色點(diǎn)代表實(shí)驗(yàn)組相較對(duì)照組表達(dá)上調(diào)的基因，綠色點(diǎn)代表差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因

表2 Gna13基因差異表達(dá)表型富集分析結(jié)果

2.2.3 GO功能富集 GO富集分析表明，表達(dá)上調(diào)基因主要與蛋白質(zhì)定位、細(xì)胞代謝過程、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等生物過程相關(guān)（P＜0.05，F(xiàn)DR校正），表達(dá)下調(diào)基因主要與細(xì)胞周期的催化代謝、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶活性的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞的高分子代謝等生物過程相關(guān)（P＜0.05，F(xiàn)DR 校正）（表 3）。

2.2.4 Pathway富集分析 Pathway富集分析顯示，表達(dá)上調(diào)基因主要參與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路、軸突導(dǎo)向、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號(hào)通路和有絲分裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路（P＜0.05，F(xiàn)DR 校正），表達(dá)下調(diào)基因主要參與 p53（protein 53，p53）信號(hào)通路、調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和粘著力 （P＜0.05，F(xiàn)DR校正）（表 4）。

3 討論

多種基因相互作用以及基因和環(huán)境間相互影響共同導(dǎo)致精神分裂癥發(fā)生[17]。一方面有研究利用新一代的測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）和GWAS，發(fā)現(xiàn)精神分裂癥的相關(guān)基因位點(diǎn)，通過多基因綜合分析為精神分裂癥遺傳學(xué)研究提供基礎(chǔ)[18]；另一方面精神分裂癥的表觀遺傳學(xué)研究則提供了基因和環(huán)境間相互影響的重要信息[19]。

表3 Gna13基因差異表達(dá)GO功能富集分析結(jié)果

表4 KEGG通路分析結(jié)果

本研究通過重組病毒感染小鼠實(shí)驗(yàn)組大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞，并進(jìn)行mRNA及蛋白表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)，空載對(duì)照組與對(duì)照組之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，F(xiàn)DR 校正），表明空載病毒（Y007）本身對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)Gna13基因的mRNA及蛋白無明顯影響；而實(shí)驗(yàn)組與空載對(duì)照組和對(duì)照組之間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，F(xiàn)DR校正），表明重組病毒（Y6145）成功感染，并敲低Gna13基因，導(dǎo)致其mRNA和蛋白表達(dá)水平降低。在此基礎(chǔ)進(jìn)行基因表達(dá)的差異性分析，檢測(cè)到相對(duì)于對(duì)照組，Gna13基因敲低后細(xì)胞表達(dá)有差異的基因共211個(gè) （P＜0.05，F(xiàn)DR校正），對(duì)這211個(gè)基因進(jìn)一步進(jìn)行分析。

在Phenotype表型分析中，本研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)下調(diào)基因參與腦形態(tài)異常的表型。目前已有影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，首發(fā)精神分裂癥患者的海馬體、丘腦、紋狀體、左側(cè)顳中回和小腦灰質(zhì)體積減小，腦干、前額以及胼胝體白質(zhì)減小，第三腦室及側(cè)腦室擴(kuò)大[20-21]。本研究結(jié)果支持GNA13基因異?？赡芤鹉X形態(tài)異常，從而參與精神分裂癥發(fā)生發(fā)展，但目前證據(jù)并不充分，其關(guān)聯(lián)性及具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

在GO富集分析中，表達(dá)下調(diào)的基因與細(xì)胞周期、細(xì)胞周期的催化調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶活性的正調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程相關(guān)；而在pathway的富集分析中，表達(dá)下調(diào)的基因同樣與異常有絲分裂、細(xì)胞周期、p53信號(hào)等通路相關(guān)。而目前已有研究證實(shí)精神分裂的發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)異常密切相關(guān)[22]。同時(shí)在GO富集分析中，表達(dá)下調(diào)的基因與細(xì)胞代謝、細(xì)胞的大分子代謝過程相關(guān)，pathway富集分析中也發(fā)現(xiàn)表達(dá)下調(diào)的基因與代謝途徑相關(guān)。而既往研究表明精神分裂癥患者常常伴有代謝綜合征和氧化應(yīng)激[23]。因此，本研究提示GNA13基因異?？赡軐?dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)異常及代謝異常，這與精神分裂癥病理變化具有一致性，但其關(guān)聯(lián)性及具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

在pathway分析中發(fā)現(xiàn)表達(dá)下調(diào)基因參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)和粘附力等相關(guān)通路。而MOERS等[24]研究發(fā)現(xiàn)G蛋白α亞基13與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)和以肌動(dòng)蛋白為基礎(chǔ)的細(xì)胞收縮性有關(guān)，敲除編碼G蛋白α亞基I2和G蛋白α亞基13中α亞基的基因后，小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元和小腦浦肯野細(xì)胞過度遷移，導(dǎo)致大腦和小腦皮質(zhì)的神經(jīng)元異位，提示GNA13可能通過參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)和粘附力而影響神經(jīng)元功能。同時(shí)，HIRAYAMA-KUROGI等[7]研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者的大腦前額皮質(zhì)中GNA13基因表達(dá)減少，GNA13-ERK1-eIF4G2信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)下調(diào)，進(jìn)一步導(dǎo)致下游eIF4A1/2和CYFIP1表達(dá)減少。同時(shí)已有研究證明，在精神分裂癥的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，CYFIP1表達(dá)缺陷將導(dǎo)致大腦功能連接性缺陷以及神經(jīng)突觸前功能改變，從而引起精神分裂癥感知覺異常的相關(guān)癥狀[8-10]。因此本研究提示GNA13基因可能通過影響肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)和突觸形成，進(jìn)而參與神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的形成、神經(jīng)細(xì)胞突觸可塑性以及大腦形態(tài)形成，從而影響精神分裂癥發(fā)生發(fā)展，但其關(guān)聯(lián)性及具體機(jī)制仍需深入探索。

本研究仍然存在明顯不足之處：首先實(shí)驗(yàn)僅使用敲低實(shí)驗(yàn)組Gna13基因，進(jìn)行基因表達(dá)分析的方法，沒有進(jìn)行Gna13基因過表達(dá)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，難以明確基因的基本功能；其次，本研究?jī)H為體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞研究，在細(xì)胞水平對(duì)該基因可能的功能進(jìn)行初步探索，沒有相關(guān)的形態(tài)學(xué)、功能學(xué)實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，無法對(duì)GNA13基因功能在精神分裂癥發(fā)生發(fā)展中的作用提供直接證據(jù)。未來研究可以結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床數(shù)據(jù)，對(duì)GNA13基因和精神分裂癥的關(guān)聯(lián)做進(jìn)一步研究。