劉俊菲,林鳳,王玉梅,李慧敏,李凱，2，3,毛瑞豐*

(1.廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，南寧 530000;2.糖業(yè)及綜合利用教育部工程研究中心，南寧 530000;3.廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530000)

微生物對(duì)制糖生產(chǎn)的影響作用歷來(lái)受到生產(chǎn)者的關(guān)注[1]，影響作用包括[2]：微生物的蔗糖轉(zhuǎn)化酶將蔗糖轉(zhuǎn)化，并進(jìn)一步發(fā)酵產(chǎn)生小分子量的乙醇、醋酸、乳酸等，減少蔗糖產(chǎn)出；微生物的代謝改變生產(chǎn)物料的理化性質(zhì)及流變性，增加工藝處理的難度和資源投入。最典型的例子就是蔗飯問(wèn)題，即腸膜狀明串珠菌的危害[3]。近年來(lái)，成品糖酸性絮凝物超標(biāo)已經(jīng)成為我國(guó)甘蔗制糖業(yè)的一大困擾，嚴(yán)重限制了眾多企業(yè)成品糖質(zhì)量水平的提高。微生物污染與成品糖酸性絮凝物超標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)已被研究證實(shí)[4]。另一個(gè)具有普遍性的嚴(yán)重問(wèn)題是，成品糖中微生物指標(biāo)超標(biāo)，許多糖廠成品糖微生物學(xué)指標(biāo)超標(biāo)，潮包變紅現(xiàn)象多發(fā)[5]。

為了有效控制微生物對(duì)制糖生產(chǎn)的影響，大量的研究工作在以下領(lǐng)域展開(kāi)：制糖生產(chǎn)病害微生物的分離鑒定；病害微生物的微生物學(xué)特性；污染微生物對(duì)生產(chǎn)的不良影響；殺菌劑、抑菌劑、消毒劑的研發(fā)應(yīng)用等等。針對(duì)微生物危害，甘蔗制糖企業(yè)在生產(chǎn)工藝的優(yōu)化改良、生產(chǎn)過(guò)程的強(qiáng)化管理等方面都采取了積極的措施，取得了一定的控制成效[6]。

成糖工序是微生物危害發(fā)生的重要關(guān)鍵點(diǎn)，成糖工段潔凈區(qū)微生物分布狀況直接影響成品糖的質(zhì)量。制糖企業(yè)參照其他行業(yè)GMP規(guī)范要求[7]，將成糖工段進(jìn)行了潔凈區(qū)分隔，安裝了成糖工段空氣處理系統(tǒng)，體現(xiàn)了企業(yè)對(duì)食品質(zhì)量與安全的高度重視[8]。但是，成糖工段潔凈區(qū)的設(shè)置并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的效果，糖廠普遍發(fā)現(xiàn)：成糖工段分隔后，成品糖的微生物總數(shù)反而升高，細(xì)菌、酵母、霉菌均有增加，潮包變紅現(xiàn)象更為嚴(yán)重。

因此，認(rèn)為關(guān)于成糖工段潔凈區(qū)微生物危害的研究十分不足。突出表現(xiàn)為缺乏系統(tǒng)性、科學(xué)性、可操作性的微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與危害管理的理論體系用于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。成糖工段潔凈區(qū)微生物分布的研究工作還相當(dāng)不足，無(wú)法掌握該特定區(qū)域微生物分布規(guī)律，無(wú)法展開(kāi)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。潔凈區(qū)的劃分和設(shè)置因?yàn)槿狈Νh(huán)境微生物學(xué)、微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的指導(dǎo)而不具備針對(duì)性應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)有的相關(guān)規(guī)范僅僅是具有衛(wèi)生學(xué)意義的原則性規(guī)定，缺乏可評(píng)價(jià)并指導(dǎo)生產(chǎn)管控的明確指標(biāo)和操作指令。

本文介紹了2010年以來(lái)，本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)糖廠成糖工段潔凈區(qū)微生物危害分析及控制研究的部分工作，即幾家甘蔗糖廠成糖工段潔凈區(qū)檢出的部分微生物。

1 研究方法

1.1 取樣方法

環(huán)境空氣采樣、設(shè)備表面采樣、生產(chǎn)線采樣及糖垢采樣點(diǎn)采樣參考GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》的方法；利用AM-4812風(fēng)速儀和飄帶法以及AT 7592指南針測(cè)定風(fēng)速、風(fēng)向；利用溫度計(jì)和濕度測(cè)定儀對(duì)溫度進(jìn)行測(cè)定。

1.2 微生物數(shù)量檢測(cè)方法

空氣檢測(cè)樣本的取樣及計(jì)數(shù)采用平板暴露法，參見(jiàn)GB/T 16294-2010。

設(shè)備及環(huán)境表面檢測(cè)樣本取樣及計(jì)數(shù)采用棉拭子法，參見(jiàn)DB34/T 1390-2011。

糖垢、生產(chǎn)線檢測(cè)樣本取樣及計(jì)數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法，參見(jiàn)GB 4789.2-2016。

1.3 微生物鑒定

采用純培養(yǎng)技術(shù)，從計(jì)數(shù)平板上分離并鑒定菌種。對(duì)獲得的純培養(yǎng)進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，16S rRNA、ITS測(cè)序，最大似然法(maximum likelihood method，ML)和貝葉斯法(Bayesian method，BI)分別在Paup*4.0b10和MrBayes×64構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。部分菌株做了Vitek2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定、MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)指紋圖譜分析。

2 研究結(jié)果

幾個(gè)批次的樣品現(xiàn)場(chǎng)取樣后，從幾家糖廠共分離獲得細(xì)菌372株，酵母16株，霉菌368株，參見(jiàn)文獻(xiàn)[9-11]，鑒定出細(xì)菌26種(屬)，酵母12種(屬)，霉菌22種(屬)。其中包括致病性及條件致病性微生物18種(屬)，致害性微生物5種(屬)。

從幾家糖廠分離鑒定的細(xì)菌見(jiàn)表1，從幾家糖廠分離鑒定的酵母見(jiàn)表2，從幾家糖廠分離鑒定的霉菌見(jiàn)表3。

表1 從幾家糖廠分離鑒定的細(xì)菌

表2 從幾家糖廠分離鑒定的酵母

表3 從幾家糖廠分離鑒定的霉菌

續(xù) 表

2.1 檢出率較高的微生物

細(xì)菌中的芽孢桿菌屬、微球菌屬，霉菌中的曲霉屬、青霉屬是檢出率較高的種類(lèi)。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、桔青霉(Penicilliumcitrinum)、糾結(jié)青霉(Penicilliumimplicatum)、構(gòu)巢裸胞殼菌(Emericellanidulanss)以及謝瓦散囊菌(Eurotiumchevalieri)是分布最為廣泛的微生物，從空氣樣本、生產(chǎn)線樣本、糖垢樣本、表面樣本中均有檢出。

2.2 檢出的致病性及致害性微生物

致病性和條件致病性微生物是指已知對(duì)人體有致病性或條件致病性的微生物。從幾家糖廠分離鑒定的致病性微生物見(jiàn)表4。致害性微生物是指對(duì)制糖過(guò)程及成品品質(zhì)產(chǎn)生危害的微生物，如產(chǎn)生色素。從幾家糖廠分離鑒定的致害性微生物見(jiàn)表5。

表4 從幾家糖廠分離鑒定的致病性微生物

表5 從幾家糖廠分離鑒定的致害性微生物

2.2.1 黃曲霉

黃曲霉(Aspergillusflavus)，半知菌類(lèi)，一種常見(jiàn)腐生真菌，其結(jié)構(gòu)疏松，表面灰綠色，背面無(wú)色或略呈褐色，菌體有許多復(fù)雜的分枝菌絲構(gòu)成。其菌毒素中毒性最大，包括致毒性、致癌性、致突變，對(duì)人類(lèi)健康危害最為突出。

黃曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物是黃曲霉毒素(AFs)，它具有高毒性且分子質(zhì)量較低，常見(jiàn)于糧食作物(花生、水稻、玉米等)及乳制品等食品中。黃曲霉毒素主要包括黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)和黃曲霉毒素G2(AFG2)。其中生活型最強(qiáng)的是黃曲霉毒素B1且最常見(jiàn)，分布廣，被公認(rèn)為毒物之首和I級(jí)強(qiáng)致癌物[12]。

2.2.2 桔青霉

桔青霉(Penicilliumcitrinum)是一種真菌毒素，菌絲是由有隔多核的多細(xì)胞構(gòu)成。常見(jiàn)于腐爛的水果、蔬菜、發(fā)霉飼料、糧食、肉類(lèi)和含紅曲添加劑的食品中，桔青霉的毒性主要包括：腎臟毒性、肝臟毒性、生殖毒性、細(xì)胞畸變，對(duì)動(dòng)物腸胃和骨骼也有一定的損害作用，因此對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物的健康有嚴(yán)重的危害[13]。

2.2.3 煙曲霉

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)是自然環(huán)境中廣泛存在的條件致病真菌，氣傳孢子，它的感染途徑是被宿主吸入呼吸道末端，過(guò)程中提高自身的侵入能力以及抵御機(jī)體免疫系統(tǒng)的殺傷力而產(chǎn)生一些蛋白酶。環(huán)境中普遍存在的腐生絲狀真菌煙曲霉在免疫功能低下或缺陷的人群中可引起多種急慢性疾病, 包括致死率很高的侵襲性曲霉病、過(guò)敏性哮喘、肺炎及變應(yīng)性支氣管肺曲霉病[14]。

2.2.4 聚多曲霉

聚多曲霉(Aspergillussydowii)亦稱(chēng)為喜多氏曲霉，是一種條件致病菌，屬于絲孢菌目、叢梗孢科、曲霉屬的一個(gè)種, 可生長(zhǎng)在土壤、糞便、酒曲等多種材料的基物上。

2.2.5 小孢根霉

小孢根霉(Rhizopusmicrospores)為條件致病菌，具有呈梨狀的孢子囊，灰色的氣生菌絲，分生孢子呈圓形，雖然不直接污染物料，不直接造成產(chǎn)品的安全性危害，但可引起食品霉變，從而導(dǎo)致成品污染。

本研究通過(guò)對(duì)日本移民研究領(lǐng)域已發(fā)表的核心期刊論文進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，基于文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)原理，利用社會(huì)網(wǎng)絡(luò)分析法對(duì)關(guān)鍵詞共現(xiàn)矩陣做了網(wǎng)絡(luò)化分析，根據(jù)關(guān)鍵詞共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和節(jié)點(diǎn)的測(cè)地距離，基本上探測(cè)出目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)集中在三個(gè)方面：日本在東北地區(qū)的移民侵略研究；日本移民在其他國(guó)家地區(qū)的政策研究以及日本移民僑居廣州的社會(huì)學(xué)研究，其中重點(diǎn)研究是日本在東北地區(qū)的移民侵略研究。

2.2.6 黑曲霉

黑曲霉(Aspergillusniger)屬于曲霉屬真菌中的一種。廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品、空氣和土壤中，能導(dǎo)致水分較高的糧食和果蔬的腐敗變質(zhì)和其他工業(yè)器材霉變，有的種可產(chǎn)生致癌性的霉毒素[15]。

2.2.7 構(gòu)巢裸胞殼菌

構(gòu)巢裸胞殼菌(Emericellanidulanss)分生孢子結(jié)構(gòu)大量或較少，呈不同程度的綠色。有部分閉囊殼散在其間，被殼細(xì)胞所包圍，使表面顯現(xiàn)黃色團(tuán)塊或絮狀顆粒結(jié)構(gòu)[16]。分布在土壤、空氣、糧食、飼料、霉腐物、腦曲霉病患者等。對(duì)人體和動(dòng)物都有致病性，能產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物。

2.2.8 謝瓦散囊菌

謝瓦散囊菌(Eurotiumchevalieri)菌落生長(zhǎng)緩慢，具有輻射狀溝紋，黃褐色。廣泛分布于世界各地，存在于土壤、藥材(冬青子、梔子、陳皮)、糧食、霉腐物，主要引起物質(zhì)的腐敗變質(zhì)，存在于煙倉(cāng)腐敗物中。

2.2.9 鄔氏黃絲曲霉

鄔氏黃絲曲霉(Talaromyceswortmannii)菌絲適宜生長(zhǎng)的溫濕度是25～30 ℃、高于97%，光照對(duì)其菌絲的生長(zhǎng)影響較小，菌落呈黃色，其孢子呈白色或者淡黃色。分生孢子成橢球形，孢梗莖壁光滑，頂端不膨大，帚狀雙輪生。對(duì)人體和動(dòng)物都有致病性，能產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物。

糾結(jié)青霉(Penicilliumimplicatum)為條件致病菌，有臍狀突起、質(zhì)地絨狀或有絮狀；大量產(chǎn)生孢子，呈藍(lán)綠色；菌絲體呈白色；可溶性色素類(lèi)似反面的顏色。青霉菌又可以分泌青霉素，青霉菌導(dǎo)致青霉病，主要包括：馬尼菲青霉病(在人體抵抗力低下時(shí)，通過(guò)呼吸道進(jìn)入體內(nèi)引起肺部感染，然后經(jīng)過(guò)血循環(huán)擴(kuò)散至皮膚、肝脾等器官)、肺青霉病(菌種在一定條件下可引起青霉菌病和肺青霉病)、梨狀青霉病(危害貯藏期的果實(shí))。

2.2.11 梅花狀青霉

梅花狀青霉(Penicilliumherquei)各頂端的小梗產(chǎn)生鏈狀的分生孢子并從菌絲體伸向空中，最佳生長(zhǎng)、萌發(fā)溫濕度是25～30 ℃，高于97%，光照和黑暗交替條件能促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)，從土壤或空氣中很易分離，對(duì)人體和動(dòng)物都有致病性，能產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物。

2.2.12 鮑曼不動(dòng)桿菌

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)屬于不動(dòng)桿菌屬的一個(gè)菌種，無(wú)芽孢無(wú)鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)，非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌，屬于條件致病菌，是醫(yī)院感染的重要病原菌且耐藥性日益嚴(yán)重，主要引起呼吸道感染，也可引發(fā)敗血癥、泌尿系統(tǒng)感染、繼發(fā)性腦膜炎呼吸機(jī)相關(guān)肺炎等。在醫(yī)院的環(huán)境中分布很廣且可長(zhǎng)期存活，對(duì)危重患者、CCU、 ICU中的病患能造成嚴(yán)重的影響，被稱(chēng)之為 ICU獲得性感染。

2.2.13 金黃色葡萄球菌亞種

金黃色葡萄球菌(Staphylococcuscohnii)具有革蘭氏陽(yáng)性、陰性凝固酶、不運(yùn)動(dòng)、不產(chǎn)孢子的特點(diǎn)，可以產(chǎn)生多種毒素，這也是金黃色葡萄球菌導(dǎo)致食物中毒的原因。導(dǎo)致組織壞死的原因是金黃色葡萄球菌定居于毛囊后，具有強(qiáng)致病性，可引起輕微的皮膚軟組織感染、局部炎癥，產(chǎn)生威脅生命的中毒性休克樣綜合征毒素-1、敗血癥、骨髓炎、心內(nèi)膜炎、肺炎和腦膜炎等多種疾病。金黃色葡萄球菌在自然界中無(wú)處不在，在空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到。因此，食品受到污染的機(jī)會(huì)很多。

2.2.14 蠟樣芽孢桿菌

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是芽孢桿菌屬中的一種，菌體細(xì)胞桿狀，末端方，成短或長(zhǎng)鏈，存在于土壤、水、空氣以及動(dòng)物腸道中?？梢鹗澄镏卸?，中毒者癥狀為腹痛、惡心、嘔吐和腹瀉。在高含糖量的食物中生長(zhǎng),如糧食加工品和肉制品等引起食物中毒的毒力因子主要為NHE、HBL、細(xì)胞毒素K、腸毒素FM及Cereulide。大分子蛋白的溶血毒素和非溶血性毒素,是引起腹瀉型食物中毒的主要原因。

2.2.15 克氏庫(kù)克菌

克氏庫(kù)克菌(Kocuriakristinae)屬于庫(kù)克菌屬，是一種條件致病菌，革蘭氏陽(yáng)性球菌，兼性厭氧。該菌主要分布在自然環(huán)境中以及哺乳動(dòng)物、人的皮膚、黏膜和口咽部。近年來(lái)由該菌引發(fā)的感染病增加較快，在血流感染和皮膚軟組織感染等。

2.2.16 抗輻射不動(dòng)桿菌

抗輻射不動(dòng)桿菌(Acinetobacterradioresistens)屬條件致病菌，革蘭氏陰性球桿菌，可單個(gè)存在， 革蘭氏染色不易褪色，粘液性型菌株有莢膜，無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛。分布于外界環(huán)境中，易在潮濕環(huán)境中生存，由于該菌粘附力極強(qiáng)，這也是其成為貯菌源的原因。病發(fā)癥包括肺部、傷口、皮膚、泌尿生殖系統(tǒng)感染、菌血癥及腦膜炎等。

2.2.17 普羅威登斯菌屬

普羅威登斯菌(Providenciaspp.)主要特性為桿狀，革蘭氏陰性，周生鞭毛，具有運(yùn)動(dòng)性，兼性厭氧?？蓮母篂a大便、尿道感染、傷口、燒傷和菌血癥標(biāo)本中分離，是引起人類(lèi)尿道感染、腹瀉、敗血癥的病原菌。

2.2.18 藤黃微球菌

藤黃微球菌(Micrococcusluteus)是一般不致病，但可為條件致病菌。為革蘭氏染色陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性，不分解葡萄糖，好氧或兼性厭氧的球狀細(xì)菌。分布于空氣、土壤、水以及動(dòng)植物體表，引起傷口等局部組織感染，也能引起嚴(yán)重感染，如心內(nèi)膜炎、腦膜炎、感染引起敗血癥等疾病。具有產(chǎn)色素的能力，一旦在成品糖中大量繁殖，會(huì)對(duì)成品糖的色澤產(chǎn)生影響，損壞品質(zhì)。

2.2.19 紅串紅球菌

紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)具有產(chǎn)色素的能力，一旦在成品糖中大量繁殖，會(huì)對(duì)成品糖的色澤產(chǎn)生影響，損壞品質(zhì)。

2.2.20 出芽短梗霉

出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)是一類(lèi)多形態(tài)類(lèi)酵母真菌, 具有酵母樣和真菌菌絲體2種形態(tài)。出芽短梗霉可產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物, 如胞外多聚糖、酶、抗菌素及單細(xì)胞蛋白等, 是一種很有開(kāi)發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景的多功能新型生物制品。

2.2.21 解脂耶氏酵母菌

解脂耶氏酵母菌(Yarrowialipolytica)屬子囊酵母，是一種二型性真菌。與白色念珠菌一樣，隨著外界信號(hào)刺激的改變，解脂耶氏酵母菌的細(xì)胞形態(tài)也會(huì)在酵母、假菌絲以及菌絲形態(tài)之間相互轉(zhuǎn)化。解脂耶氏菌可以以葡萄糖、乙醇、乙酸、脂肪酸、烴類(lèi)等物質(zhì)為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，具有適應(yīng)較惡劣的環(huán)境條件。

2.2.22 粘性紅酵母

粘性紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)為單細(xì)胞真菌，菌落呈球形、圓形,中間凸起,表面及邊緣光滑，一般為粉紅色,以芽殖為主。菌落生長(zhǎng)快速，反面陰暗，有時(shí)粗糙，柔軟，呈粘液狀。粘性紅酵母具有產(chǎn)色素的能力，若大量繁殖，會(huì)對(duì)成品的顏色產(chǎn)生影響，損壞其品質(zhì)。

2.3 檢出微生物的分布特點(diǎn)

2.3.1 生產(chǎn)線樣本及糖垢樣本中檢出的微生物

生產(chǎn)線樣本是指分蜜機(jī)落糖口以下、振篩、輸送帶上的糖，糖垢樣本是分蜜機(jī)落糖口、振篩、輸送帶上的糖積垢。生產(chǎn)線樣本及糖垢樣本中檢出的微生物見(jiàn)表6。

表6 生產(chǎn)線樣本及糖垢樣本中檢出的微生物

續(xù) 表

2.3.2 致病性及致害性微生物的檢出位點(diǎn)

致病性及致害性微生物的檢出位點(diǎn)見(jiàn)表7和表8。

表7 致病性微生物檢出位點(diǎn)

表8 致害性微生物檢出位點(diǎn)

3 分析與討論

從不同糖廠的成糖工段潔凈區(qū)(含部分糖廠煮糖車(chē)間)檢出大量微生物，包括致病性微生物、致害性微生物，其中一些檢出菌為初次報(bào)道。

檢測(cè)的所有糖廠振篩末端生產(chǎn)線樣品均未檢出致病性微生物及致害性微生物。但是，潔凈區(qū)分布的致病性微生物及致害性微生物對(duì)成品糖安全及品質(zhì)的可能影響亟待研究。

生產(chǎn)線樣本用現(xiàn)行方法檢出的微生物數(shù)量、種類(lèi)變化呈現(xiàn)規(guī)律：隨振篩級(jí)數(shù)遞減，落糖口處最高，末級(jí)振篩末端最少。該變化與生產(chǎn)線樣本的水分含量變化相關(guān)。但是，生產(chǎn)線樣本中是否攜帶芽孢和霉菌孢子需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

檢出微生物以芽孢桿菌、曲霉、青霉最為普遍。

不同企業(yè)潔凈區(qū)空氣、建筑表面、設(shè)備表面的微生物分布有較大的差異。氣流組織狀況、積水、糖漿積留、糖粉積留是影響微生物分布的重要因素。

生產(chǎn)線糖垢樣本微生物檢出數(shù)量大，與生產(chǎn)線樣本相對(duì)照，兩組樣本檢出菌株存在極高的同緣性。生產(chǎn)上要注意糖垢的及時(shí)清理。

本文介紹了幾家糖廠成糖潔凈區(qū)檢出的微生物種類(lèi)。關(guān)于甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)微生物分布狀況分析、成品糖微生物污染源、污染途徑分析、成糖潔凈區(qū)微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究工作將另文報(bào)道。