曾德創(chuàng) 陳宏明 潘興壽 唐漢慶 梁燁 鄒才華 李天資

【摘要】?目的?探討石斛多糖對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）氧化應(yīng)激和晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE）代謝的藥效及其劑量。方法?提取石斛多糖，將SHR大鼠隨機分為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組四個組，對照組給予開水，低劑量組、中劑量組和高劑量組分別給予石斛多糖100 mg/d、300 mg/d、500 mg/d，干預(yù) 2個月，比較干預(yù)后各組超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、AGE、可溶性AGE受體（sRAGE）和全長AGE受體（RAGE）mRNA水平。結(jié)果?對照組SOD、CAT和MDA平均水平分別為（111.26±23.36）U/L、（59.58±13.48）U/L和（19.77±1.61） μmol/L，低劑量組為（151.18±23.76）U/L、（63.36±12.40）U/L和（10.95±2.07） μmol/L，中劑量組為（177.03±29.00）U/L、（76.35±11.20）U/L和（8.83±1.91） μmol/L，高劑量組為（182.77±21.62）U/L、（85.83±11.58）U/L和（6.94±1.84） μmol/L。與對照組比較，低劑量組SOD水平較高，MDA水平較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），中劑量組和高劑量組SOD、CAT水平較高，MDA水平較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。對照組AGE、sRAGE和RAGE mRNA平均水平分別為（6.43±0.78）mg/L、（1.09±0.18）mg/L和（0.94±0.11），低劑量組為（6.40±0.80）mg/L、（1.41±0.19）mg/L和（0.90±0.08），中劑量組為（5.99±0.67）mg/L、（1.70±0.20）mg/L和（0.84±0.15），高劑量組為（4.67±0.69）mg/L、（1.95±0.22）mg/L、（0.54±0.10）。與對照組比較，低劑量組、中劑量組sRAGE水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），高劑量組AGE、RAGE mRNA水平較低，sRAGE水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。石斛多糖對MDA、SOD、AGE、sRAGE和RAGE mRNA平均水平有劑量效應(yīng)關(guān)系，糾正SHR氧化應(yīng)激功能紊亂的有效劑量為300 mg/d;糾正SHR晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體功能紊亂的有效劑量為500 mg/d。結(jié)論?石斛多糖可有效緩解SHR的氧化應(yīng)激功能紊亂，降低AGE水平，提高sRAGE水平，降低RAGE基因的活化，對緩解SHR的血管重塑有積極的作用。其藥效有劑量效應(yīng)關(guān)系，中等劑量可有效改善氧化應(yīng)激癥狀，高劑量能改善AGE其受體癥狀。

【關(guān)鍵詞】?石斛多糖;氧化應(yīng)激;自發(fā)性高血壓;晚期糖基化終產(chǎn)物;晚期糖基化終產(chǎn)物受體

中圖分類號：R282.71?文獻標(biāo)志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.09.002

晚期糖基化終產(chǎn)物（Advanced glycation end products，AGE）能夠和身體的組織細(xì)胞相組合，導(dǎo)致慢性退化性疾病的發(fā)生，是全球醫(yī)學(xué)界最為熱門的研究領(lǐng)域之一，AGE受體（Receptor for Advanced Glycation End-product，RAGE）是細(xì)胞表面分子的免疫球蛋白超家族成員之一，與AGE及蛋白質(zhì)分子相互作用參與氧化應(yīng)激，高水平的AGE可促進RAGE的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與促進動脈粥樣硬化（AS）的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[1]?？扇苄訰AGE（Soluble receptor for advanced glycation end products，sRAGE）與RAGE結(jié)構(gòu)相似，可競爭性與AGE結(jié)合，對保護血管細(xì)胞，改善AS進程有積極的作用，成為臨床藥學(xué)關(guān)注的熱點[2]。石斛（Dendrobium）含有豐富的酚類、類萜類和含氮類等重要藥用成分，具有滋陰清熱，抑制炎癥反應(yīng)，增強免疫力等功效，在AS治療中發(fā)揮了積極的作用，但其作用的靶點及其機制還不完全清楚[3]。為探討石斛對AS的療效及其機制，本文觀察石斛多糖干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）后其超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、AGE、sRAGE和腹主動脈平滑肌RAGE mRNA表達(dá)水平的變化情況。

1?材料與方法

1.1?鐵皮石斛多糖

采用新鮮鐵皮石斛（廣西根遼生物技術(shù)有限公司提供），經(jīng)本校何思陸主任藥師鑒定確認(rèn)。多糖提取按文獻[4]：取新鮮鐵皮石斛莖1000 g，100℃殺青30 min，60℃烘箱烘干24 h，100目粉碎機粉碎，80℃熱水浸提2 h，離心、抽濾、濃縮至原有體積的1/6，醇沉24 h，離心，真空干燥。熱水回流加纖維素酶（Cellulase）純化，水浴加熱濃縮至含生藥量為1 g/100 mL的藥液，殺菌，貯存于4℃冰箱內(nèi)備用。

1.2?動物喂養(yǎng)與藥飼

（1）SHR和飼料：SHR大鼠由中山大學(xué)北校園實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK（粵）2017-0081。選購（2 m±2 d）月齡雄性SHR大鼠48只，普通級。鼠飼料丸由上海新奇特種飼料廠提供。（2）喂養(yǎng)方法：鼠飼料丸架式籠養(yǎng)，室溫（20±2）℃，相對濕度（75±5）%，光照明暗各12 h交替，喂養(yǎng)至（8 m±2 d）月齡，平均體重為（352±5） g時給予藥物干預(yù)。（3）分組藥飼：將48只SHR大鼠隨機分為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組共四組，每組12只同一籠飼養(yǎng)。（4）藥物劑量：根據(jù)2010年版《中國藥典》成人（70 kg）推薦劑量10 g/d，SHR體重0.35 kg，按照人用量推算動物給藥量，SHR等效劑量約為人的6.3倍，本研究用石斛劑量為：低劑量組100 mg/d，中劑量組300 mg/d，高劑量組500 mg/d。（5）給藥方法：低劑量組口腔給石斛多糖藥飲100 mg/d（取10.0 mL藥液加水40 mL）;中劑量組口腔給石斛多糖藥飲300 mg/d（取30.0 mL藥液加水10 mL）;高劑量組口腔給石斛多糖藥飲500 mg/d（取50.0 mL藥液），每天1次。對照組口腔予開水50.0 mL/d。四組均等量喂鼠飼料丸，飲用水自由飲用，連續(xù)2個月。

1.3?標(biāo)本采集

于干預(yù)后麻醉SHR進行標(biāo)本采集。（1）麻醉方法：碘伏消毒，以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。（2）血液標(biāo)本采集：剃去腹部的毛，解剖，切腹壁打開腹腔，從腹腔靜脈取血0.5 mL，低溫分離取血清。（3）標(biāo)本采集：剪取腹主動脈平滑肌15 mm×3 mm組織，剪成5 mm×3 mm共3小塊，分別置于3個凍存管，于30 min內(nèi)液氮固定4 h，移至-70℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.4?標(biāo)本檢測

SOD活性用黃嘌呤氧化酶法測定，CAT用鉬酸銨法測定，MDA用硫代巴比妥酸法測定，sRAGE用ELISA法測定，試劑盒由杭州沃森生物技術(shù)有限公司提供，用美國BIO RAD 550型酶標(biāo)儀檢測，嚴(yán)格按檢測方法和程序進行。

1.5?RAGE mRNA表達(dá)檢測

用RT-PCR法，取100 μL腹肌勻漿，用Trizol試劑提取總RNA，氯仿和異丙醇抽提。紫外分光光度儀和瓊脂糖電泳鑒定RNA的濃度和純度，取10 μL，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-70℃凍存?zhèn)溆?。? μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增反應(yīng)，并以β-actin為內(nèi)參對照。根據(jù)Gene Bank人RAGE基因（Gene Bank登錄號AB036432）設(shè)計RAGE基因引物，由杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成。RAGE基因及其管家基因序列及擴增長度見表1。PCR反應(yīng)條件：55℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)60 min，94℃變性2 min→94℃30 s→55℃30 s→72℃1 min，共30循環(huán)，72℃延伸7 min。膠回收試劑盒回收目的基因片段。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像儀采集圖像，PCR儀獲得產(chǎn)物Ct值，采用2-ΔΔCt相對定量計算公式計算分析。

1.6?統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0版本軟件進行統(tǒng)計處理，計量數(shù)據(jù)用（±s）表示。多組資料比較用單因素方差分析，組間比較用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2?結(jié)果

2.1?石斛多糖對SHR大鼠SOD、CAT和MDA水平的影響

與對照組比較，低劑量組SOD水平較高，MDA水平較低，差異有統(tǒng)計意義（P<0.01），中劑量組和高劑量組SOD、CAT水平較高，MDA水平較低，差異有統(tǒng)計意義（P<0.01）;與低劑量組比較，中劑量組和高劑量組SOD、CAT水平較高，MDA水平較低，差異有統(tǒng)計意義（P<0.01）;與中劑量比較，高劑量組MDA水平較低，差異有統(tǒng)計意義（P<0.01）。提示石斛多糖能有效糾正氧化功能紊亂，表現(xiàn)為提高SOD、CAT水平，降低MDA水平，治療SHR氧化應(yīng)激的有效劑量為石斛多糖300 mg/d，連用2個月，將劑量提高到500 mg/d，其糾正氧化功能紊亂效果無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.2?石斛多糖對SHR大鼠AGE、sRAGE和RAGE mRNA的影響

與對照組比較，低劑量組、中劑量組sRAGE水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），高劑量組AGE、RAGE mRNA水平較低，sRAGE水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與低劑量組比較，中劑量組sRAGE水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），高劑量組AGE、RAGE mRNA水平較低，sRAGE水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與中劑量組比較，高劑量組AGE、RAGE mRNA水平較低，sRAGE水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。提示石斛多糖能有效糾正晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體功能紊亂，表現(xiàn)為提高sRAGE水平，降低AGE和RAGE mRNA水平。石斛多糖有效糾正SHR大鼠AGE及其受體功能紊亂的有效劑量為500 mg/d。見表3。

3?討論

有關(guān)AGE及RAGE的結(jié)構(gòu)及其對各種疾病病理機制作用的共識正在不斷更新，AGE是一種有高度活性的對機體有害的羰基化合物，營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)過美拉德（Maillard）反應(yīng)產(chǎn)生的終末產(chǎn)物，AGE在非酶促條件下，營養(yǎng)物質(zhì)中的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類或核酸等大分子游離的氨基與還原糖的醛基經(jīng)過縮合、重排、裂解、氧化修飾等美拉德反應(yīng)后產(chǎn)生的，首先大分子末端的還原性氨基與還原糖分子中的醛基發(fā)生加成反應(yīng)，形成希夫堿（Schiff bases）;其次希夫堿再發(fā)生阿馬道里（Amadori）重排，形成早期糖基化產(chǎn)物醛胺類;再次經(jīng)醛胺類脫水，重排反應(yīng)生成乙二酸（草酸）、3-脫氧葡萄糖醛酮（3-DG）和甲基乙二醛（丙酮醛）等AGE[5]。體內(nèi)AGE的主要來源之一是通過進食將AGE攝入體內(nèi)，另外當(dāng)體內(nèi)葡萄糖濃度異常增高時，體內(nèi)AGE的合成加速，分解減緩[6]。當(dāng)AGE異常增高時，細(xì)胞表面的RAGE與AGE配體相互作用產(chǎn)生效應(yīng)，導(dǎo)致許多慢性退化性疾病的發(fā)生[7]。

人類RAGE編碼基因位于6號染色體上，包含11個外顯子和10個較短的內(nèi)含子[8]。RAGE是一類模式識別受體，正常情況下RAGE表達(dá)量很低，當(dāng)機體出現(xiàn)AGE聚集，RAGE表達(dá)量上調(diào)，激活如磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）、分裂原激活的蛋白激酶（Mitogen activated protein kinases，MAPK）、應(yīng)激活化蛋白激酶（Stress-activated protein kinase，SAPK）、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（Signal transducers and activators of transcription，STAT）等多種信號傳導(dǎo)通路的級聯(lián)放大反應(yīng)，激活下游核轉(zhuǎn)錄因子（NK-κB）等，調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，炎癥因子釋放，導(dǎo)致血管通透性增高，單核細(xì)胞黏附，基質(zhì)成分增多等病理變化，在動脈粥樣硬化損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[9]。研究認(rèn)為，AGE與RAGE配體結(jié)合后，RAGE將信號傳遞至胞內(nèi)，從而引發(fā)由氧自由基、蛋白酪氨酸激酶、蛋白激酶C、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶、p38絲裂原蛋白激酶和NF-KB等構(gòu)成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[10]。雖然AGE與RAGE配體結(jié)合后RAGE首先與哪種蛋白結(jié)合，目前還不完全清楚，但對RAGE多聚核糖體mRNA研究發(fā)現(xiàn)，RAGE有3種主要的剪接變異體，分別為全長膜結(jié)合型、截去C端可溶型（sRAGE）和截去N端膜結(jié)合型。全長膜結(jié)合型有完整的胞外段、膜鑲嵌區(qū)和胞內(nèi)段;sRAGE為RAGE的胞外段部分，缺少跨膜鑲嵌區(qū)和胞內(nèi)段;膜結(jié)合型僅有膜鑲嵌區(qū)和胞內(nèi)段，無胞外段部分[11]。因此只有全長膜結(jié)合型和sRAGE能與配體結(jié)合，膜結(jié)合型由于缺失胞外段不能與配體結(jié)合。而sRAGE缺少跨膜鑲嵌區(qū)和胞內(nèi)段，其與AGE配體結(jié)合后，信號不能傳遞至胞內(nèi)，不會發(fā)生信號傳導(dǎo)通路的級聯(lián)放大反應(yīng)，同時sRAGE可與全長膜結(jié)合型競爭結(jié)合其配體，對機體的多種病理狀態(tài)起到保護作用[12]。降低AGE，阻斷RAGE表達(dá)量上調(diào)，刺激機體產(chǎn)生更多的sRAGE等，被認(rèn)為是緩解氧化應(yīng)激，預(yù)防動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的方向標(biāo)[13]。

氧化應(yīng)激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）產(chǎn)生過多，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷，在動脈粥樣硬化損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)生作用。SOD是機體內(nèi)清除氧自由基的抗氧化酶，其功能是清除氧自由基保護細(xì)胞。CAT是一種酶類清除劑，可促使過氧化氫分解為氧和水，從而使細(xì)胞免于遭受過氧化氫的毒害。MDA是氧自由基攻擊生物膜中不飽和脂肪酸而形成的氧化終產(chǎn)物，大量的MDA可導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸等大分子的交聯(lián)聚合，對細(xì)胞有毒性作用[14]。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為風(fēng)寒暑濕燥火等從經(jīng)絡(luò)傳入臟腑，導(dǎo)致痰濁、血瘀、痰瘀交阻，是糖基化產(chǎn)物代謝紊亂慢性血管疾病的病機，是“痰濁”辨證的客觀表現(xiàn)，早在東漢時期，張仲景在《金匱要略》中就描述石斛具有益氣健脾、理氣活血、補脾益陽等功效，是溫陽健脾的重要代表方劑?，F(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為石斛多糖有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能、清除自由基等作用[15]。本研究結(jié)果顯示，用石斛多糖干預(yù)SHR大鼠，可明顯增高其SOD、CAT和sRAGE水平，降低其MDA、AGE及RAGE mRNA水平。提示石斛多糖可能通過降低AGE生成和積累，提高sRAGE表達(dá)，抑制RAGE活化，改善SHR大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激功能紊亂狀態(tài)，在SHR大鼠的血管損害病理過程中起到保護作用。中醫(yī)認(rèn)為動脈粥樣硬化性疾病本為陰陽失調(diào)，標(biāo)為內(nèi)生之風(fēng)、痰濁和瘀血。治療上應(yīng)當(dāng)用活血化瘀，行氣通絡(luò)，豁痰利氣等[16～21]。

本研究結(jié)果提示，石斛多糖可有效緩解SHR大鼠的氧化應(yīng)激和晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體功能紊亂狀況。石斛多糖對SHR的癥狀有劑量效應(yīng)關(guān)系，中等劑量可改善氧化應(yīng)激癥狀，高劑量則改善晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體癥狀，為治療血管重塑提供新型的空間。

參?考?文?獻

[1] 何思陸，李天資.FXYD5在高血壓病動脈粥樣硬化中調(diào)控機制的研究進展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2015，13（15）：1730-1732.

[2] Yamamoto KI，Murata H.Signal Diversity of Receptor for Advanced Glycation End Products[J].Acta Med Okayama，2017，71（6）：459-465.

[3] 曾德創(chuàng)，鄒才華，李近都，等.石斛治療血栓閉塞性脈管炎患者炎癥細(xì)胞因子變化的觀察[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2016，6（21）：9-12，17.

[4] 黃曉君，聶少平，王玉婷，等.鐵皮石斛多糖提取工藝優(yōu)化及其成分分析[J].食品科學(xué)，2013， 34（22）：21-26.

[5] Klont F，Pouwels SD，Hermans J，et al.A fully validated liquid chromatography-mass spectrometry method for the quantification of the ?soluble receptor of advanced glycation end-products （sRAGE） in serum using immunopurification in a 96-well plate format[J].Talanta，2018，182：414-421.

[6] Kolliker Frers RA，Cosentino V，Tau J，et al.Immune-Mediated Inflammation Promotes Subclinical Atherosclerosis in Recent-Onset Psoriatic Arthritis Patients without Conventional Cardiovascular Risk Factors[J].Front Immunol，2018，9：139.

[7] Ritarwan K，Lelo A，Pane YS，et al.Increasing Atherosclerosis in Streptozotocin-Induced Diabetes into Four Groups of Mice[J].Open Access Maced J Med Sci，2018，6（2）：287-292.

[8] 劉言鳳，余文珍，施紅.石斛合劑對H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護作用[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（10）：4271-4274.

[9] Mirlohi MS，Yaghooti H，Shirali S，et al.Increased levels of advanced glycation end products positively correlate with iron overload and oxidative stress markers in patients with β-thalassemia major[J].Ann Hematol，2018，97（4）：679-684.

[10] 梁燁，鄒才華，李近都，等.石斛藥用次生代謝產(chǎn)物及其基因克隆研究進展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（12）：5511-5514.

[11] Birgin E，Gebhardt C，Hetjens S，et al.Extracorporal Shock Wave Therapy Enhances Receptor for Advanced Glycated End-Product-Dependent Flap Survival and Angiogenesis[J].Ann Plast Surg，2018，80（4）：424-431.

[12] Gasparotto J，Girardi CS，Somensi N，et al.Receptor for advanced glycation end products mediates sepsis-triggered amyloid-β accumulation，Tau phosphorylation，and cognitive impairment[J].J Biol Chem，2018，293（1）：226-244.

[13] 李俊峰，劉文洪，張貝貝，等.鐵皮石斛內(nèi)生菌的分離及代謝產(chǎn)物活性的初步研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（3）：970-974.

[14] 黃元東，潘興壽，梁燁，等.鐵皮石斛對急性有機磷農(nóng)藥中毒患者解毒及其抗免疫的療效觀察[J].中國地方病防治雜志，2014，29（S2）：204.

[15] 曾德創(chuàng)，鄒才華，李近都，等.血管重建術(shù)治療血栓閉塞性脈管炎患者的療效觀察[J].右江醫(yī)學(xué)，2017，45（2）：134-137.

[16] 潘興壽，梁燁，李天資，等.野芭蕉輔助治療高血壓伴穩(wěn)定勞力型心絞痛PCI術(shù)后患者炎癥反應(yīng)療效觀察[J].時珍國醫(yī)國藥，2014，25（9）：2171-2173.

[17] 李鴻翔，梁燁，李天資，等.原發(fā)性高血壓危險因素的易感基因及其非編碼RNA研究進展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2014，12（7）：879-881.

[18] 梁燁，李天資，陸高翔，等.野芭蕉治療自發(fā)性高血壓大鼠療效機理的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，24（10）：2324-2326.

[19] 李天資，梁燁，陸高翔，等.野芭蕉治療高血壓頸動脈斑塊陽性患者療效機制的臨床研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（9）：2259-2260.

[20] 陸高翔，韋華，李天資，等.解痙通絡(luò)活血治療高血壓病患者炎癥因子變化的臨床研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2009，36（8）：1306-1308.

[21] 潘小炎，李天資，周喜漢，等.石斛治療實驗性大鼠萎縮性胃炎的醫(yī)學(xué)研究[J].右江醫(yī)學(xué)，2009，37（1）：1-3.

（收稿日期：2019-05-23?修回日期：2019-07-12）

（編輯：潘明志）