張東雪， 張秀梅, 2??， 李文濤， 李江濤

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266072)

金烏賊(Sepiaesculenta)，俗稱烏魚、墨魚，隸屬軟體動(dòng)物門(Mollusca)頭足綱(Cephalopoda)烏賊目(Sepioidea)烏賊科(Sepiidae)烏賊屬(Sepia)，廣泛分布于中國黃渤海、東海、南海，日本北海道以南，朝鮮西南海域及菲律賓群島海域，是重要的經(jīng)濟(jì)種[1]。繁殖期的雌性金烏賊常發(fā)生多次交配行為，雄性金烏賊為提高自身繁殖成功率，在交配前會(huì)機(jī)械性移除雌性口頰膜處先交配雄性的精莢，從而使自己的精莢完整地粘附于雌性口膜處。目前關(guān)于金烏賊精莢的研究多集中于精子超微結(jié)構(gòu)和低溫?fù)p傷的電鏡觀察、精莢器的結(jié)構(gòu)以及精莢的形成等。金烏賊精子為鞭毛型精子，分為頭部、中部和尾部三部分，外部附有光滑呈裙邊狀的被膜。精子由輸精管進(jìn)入黏液腺后，輸精管壺腹收縮，使得每次進(jìn)入的批量精子恰好形成一個(gè)精莢。精莢為長橢圓型，外部包有被膜，被膜內(nèi)部包裹著三部分：彈射裝置、接合部和精團(tuán)。當(dāng)頭中部包裹的質(zhì)膜破損，含有大量精子的精團(tuán)則被釋放[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的精莢在進(jìn)入納精囊后立即破裂，以游離精子的形式存在，副性腺自溶物蛋白中的小泡蛋白能夠促進(jìn)精莢破裂[4]。但迄今關(guān)于影響金烏賊精子儲(chǔ)存、釋放的主導(dǎo)因素尚未見報(bào)道。

青島近海金烏賊繁殖期在每年5—7月，成體在沿岸產(chǎn)卵場結(jié)群并繁衍后代。觀察發(fā)現(xiàn)，5—7月隨著繁殖期的推移，海水溫度逐漸升高，雌性金烏賊產(chǎn)卵量減少，受精率逐漸降低[5]。因此推測，溫度亦可能是影響金烏賊精子活力和精莢中精子釋放的重要因素，其具體影響機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

針對(duì)上述問題，本文分別研究了促進(jìn)金烏賊精子釋放的影響因素以及溫度對(duì)精子活力的影響，以期解釋金烏賊精子儲(chǔ)存與釋放機(jī)制，明確不同存放條件下精子的壽命與活力，為豐富金烏賊繁殖生物學(xué)研究內(nèi)容，優(yōu)化人工繁育技術(shù)提供參考資料和理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 金烏賊精子釋放的影響因素

選取狀態(tài)良好(色澤鮮亮、活力強(qiáng)、胴背部無傷)的親本10尾(5♀，5♂)，解剖雌雄親本，將精莢從精莢囊中剝離出來，暫置于冰上干凈的培養(yǎng)皿中。取精莢囊、副性腺、精巢、卵巢、纏卵腺組織塊各0.7～1 g，在液氮中研磨后，與海水1∶1混合。10 000 r/s冷凍離心15 min，取上清液即各組織的蛋白提取液。利用考馬斯亮藍(lán)法測定并統(tǒng)一蛋白濃度，將各組織蛋白提取液濃度統(tǒng)一調(diào)至3.87 g/L。各取2 mL人工海水、精莢囊蛋白液，副性腺蛋白液，精巢蛋白液、卵巢蛋白液、纏卵腺蛋白液于培養(yǎng)皿中，并在每個(gè)培養(yǎng)皿中分別放入10個(gè)剛摘取的新鮮精莢，其中人工海水為對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)溫度維持在19 ℃，每隔30 min觀察并記錄完整精莢數(shù)量。

19和4℃條件下，另取30個(gè)新鮮精莢分別置于海水、副性腺蛋白液、精莢囊蛋白液、精巢蛋白液及纏卵腺蛋白液培養(yǎng)皿中，每7天更換一次上述液體，每天19：00記錄各組培養(yǎng)皿中精莢的完整情況，并隨機(jī)刺破1個(gè)完整精莢以檢測精子活力。

1.2 溫度對(duì)精子活力的影響

青島近海金烏賊繁殖初期的海水溫度約為19 ℃，此時(shí)繁殖狀態(tài)良好，隨著繁殖期的推移，水溫逐漸升高，后期繁殖力明顯下降。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組19 ℃，5個(gè)溫度處理組20、21、22、23和24 ℃，比較分析不同溫度下金烏賊精子活力的差異，每個(gè)溫度設(shè)置3次重復(fù)。主要測定指標(biāo)為精子激烈運(yùn)動(dòng)、慢速運(yùn)動(dòng)及原地顫動(dòng)的持續(xù)時(shí)間，以鏡檢視野中70%左右精子由前一運(yùn)動(dòng)階段轉(zhuǎn)入后一運(yùn)動(dòng)階段時(shí)，認(rèn)為該批精子已進(jìn)入下一運(yùn)動(dòng)階段。統(tǒng)計(jì)精子壽命，即從精液與激活液混合開始，到鏡檢視野中約90%的精子停止活動(dòng)為止的時(shí)間，即停止原地顫動(dòng)。統(tǒng)計(jì)分析不同溫度條件下精子活力的差異，并對(duì)1個(gè)精莢中精子的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 精子釋放速度與精子活性

各實(shí)驗(yàn)組完整精莢的保持?jǐn)?shù)量如表1所示。精莢離體1 h后，所有實(shí)驗(yàn)組均保持完整形態(tài)。在卵巢蛋白組，完整精莢的數(shù)量隨時(shí)間的延長急劇下降。添加卵巢蛋白液后第5小時(shí)精莢頭部的質(zhì)膜破損，精子開始釋放，第8小時(shí)，完整精莢剩余(8.00±0.00)個(gè)，第8.5小時(shí)，完整精莢僅剩余(4.00±0.58)個(gè)，第9小時(shí)，減至(3.33±0.33)個(gè)，第9.5小時(shí)，無完整精莢，精子全部釋放。由此說明卵巢蛋白提取液對(duì)金烏賊精莢中精子釋放具有明顯的促進(jìn)作用。

在1.5和4 h時(shí)，精巢蛋白組的完整精莢分別為(9.00±0.00)和(8.00±0.58)個(gè)。第6小時(shí)，副性腺蛋白組的精莢剩余(9.33±0.33)個(gè)。由此可知，與卵巢蛋白提取液相比，副性腺蛋白、精莢囊蛋白、精巢蛋白和纏卵腺蛋白提取液對(duì)精子釋放的促進(jìn)作用均較弱。

持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水溫維持在19～20 ℃，海水中保存的精莢可連續(xù)4 d維持完整形態(tài)，而副性腺與精莢囊蛋白液中的精莢僅完整保存2 d，纏卵腺蛋白液中的精莢僅完整保存1 d，期間如使用針刺破精莢，則精子團(tuán)立即釋放。但觀察發(fā)現(xiàn)，精莢在上述各蛋白液及海水中儲(chǔ)存到第2天時(shí)，針刺釋放出的精子已全部死亡(見表2)。

水溫4 ℃條件下，海水中的精莢可保持完整形態(tài)25 d，針刺后鏡檢發(fā)現(xiàn)，4 ℃存放3 d后，精莢形態(tài)雖完好，但僅有部分精子具活力，且精子處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的時(shí)間為30 min～1 h，存放22 d后，精莢形態(tài)雖完整，但精莢內(nèi)的精子全部失去活力。副性腺與精莢囊蛋白液中的精莢可維持完整形態(tài)3 d，精子僅在第1天具活性。而精莢在精巢與纏卵腺蛋白液中可保持完整形態(tài)2 d，精莢內(nèi)的精子在第2天全部死亡(見表2)。綜上所述，較低溫度下，海水中保存的精莢，其完整形態(tài)和部分精子活力可維持較長時(shí)間。

2.2 精子最適溫度范圍

一個(gè)精莢中精子數(shù)量約1.99×107個(gè)。隨著水溫升高，不同溫度下精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)精子處于20、21和22 ℃的海水中時(shí)，其激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間分別為(93.33±13.33)、(116.67±6.67)和(93.33±6.67)min，差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于19℃組的(43.33±12.02)min(P<0.05)。21 ℃組精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著高于23 ℃組的(75.00±5.00)min和24 ℃組的(70.00±5.77)min(P<0.05)。不同溫度組中精子慢速運(yùn)動(dòng)時(shí)間差異不顯著(P>0.05)。隨水溫升高，精子原地顫動(dòng)時(shí)間同樣呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。22℃組((80.00±10.00)min)精子原地顫動(dòng)時(shí)間達(dá)到最大值，且顯著高于19 ℃組(46.67±8.82)min、20 ℃組的(50.00±11.55)min和21 ℃組的(53.33±3.33)min(P<0.05)，并高于23℃組的(75.00±5.00) min和24 ℃組的(60.00±5.77) min，但差異不顯著(P>0.05)。精子壽命在21℃時(shí)達(dá)到最大值(206.67±6.67) min，隨溫度升高又逐漸降低(見圖1)。

溫度對(duì)精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響如圖2所示，通過擬合精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間y和溫度x的關(guān)系曲線，得出y=-6.225 14x2+267.507 05x-2 773.362,r2=0.370 89。當(dāng)x=21.49℃時(shí)，ymax21.49=100.47 min。90%置信區(qū)間內(nèi)，精子最長激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間的溫度范圍為20.22～22.76 ℃。因此判斷，水溫20.22～22.76 ℃時(shí)精子活力最高。

表1 各實(shí)驗(yàn)組完整精莢的保持?jǐn)?shù)量Table 1 The total number of spermatophore in each experimental groups

注：同列不同字母表示差異達(dá)到0.05的顯著水平(單因素方差分析ANOVA和Duncan多重比較)；表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；n=3。F：組間均方/組內(nèi)均方。P：檢驗(yàn)水平。

Note: Different letters in the same column represent significant differences between different modes of locomotion (one-way ANOVA and Duncan’s multiple comparison tests,P<0.05); means ±standard error;n=3.F：Mean squares between groups/Mean squares within groups.P: Test level.

表2 不同溫度下各實(shí)驗(yàn)組完整精莢及精子活性的保持時(shí)間Table 2 Life span of spermatophore and sperm in experimental groups at two different temperature

注：表中數(shù)值(A/B)為精莢保持完整形態(tài)時(shí)間/精子活性持續(xù)時(shí)間。

Note: A/B stands for the time of maintaining integrated spermatophores/the time of sperm motility.

圖1 溫度對(duì)金烏賊精子活力的影響Fig.1 Effects of temperature on sperm motility of S.esculenta

圖2 不同溫度對(duì)精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響Fig.2 Effects of temperature on acute movement time

3 討論

溫度是影響生物生長和繁殖的重要因素。溫度過高或過低會(huì)影響生物體內(nèi)生化反應(yīng)相關(guān)酶的活性，進(jìn)而影響機(jī)體健康狀態(tài)。溫度脅迫是物種進(jìn)化的動(dòng)力之一，長期的溫度變化可引起物種的分化甚至新物種的形成[6]。生物在對(duì)高溫的適應(yīng)過程中，逐漸改變機(jī)體代謝水平和生理狀態(tài)，這更是一種積極的適應(yīng)和調(diào)節(jié)過程[7]。本研究發(fā)現(xiàn)， 4和19 ℃時(shí)，海水中精莢維持完整形態(tài)的時(shí)間(25和4 d)遠(yuǎn)大于其他實(shí)驗(yàn)組(2～3 d，1～2 d)。但用針刺破精莢，鏡檢發(fā)現(xiàn)，4 ℃海水保存3 d后，仍有部分精子具活性，精莢持續(xù)保存22 d后，精子才完全失去活性，而其他實(shí)驗(yàn)組的精子活性僅維持1 d。由此推斷，低溫海水環(huán)境能明顯抑制精莢頭部破損速度，對(duì)精莢外膜的損傷較小，同時(shí)低溫也抑制了精子的能量代謝，延長了精子壽命。有研究表明，當(dāng)精子由常溫快速降至0 ℃時(shí)，由于冷休克，精子將發(fā)生不可逆的損傷，進(jìn)而活力降低，而該溫度對(duì)精子的損傷要低于冷凍[8-9]。將金烏賊精子置于超低溫(-80 ℃)保存后，經(jīng)透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)精子頂體腫脹甚至脫落，細(xì)胞核與核膜分離，線粒體雙層膜被破壞，精子鞭毛呈不規(guī)則纏繞、斷裂甚至脫落[3]。而4℃海水中保存的精莢，其中的精子是否受冷休克影響而發(fā)生不可逆損傷，或海水滲透壓能否改變精子的活力等尚有待進(jìn)一步探究。

本研究結(jié)果顯示，卵巢蛋白提取液可明顯促進(jìn)精莢中精子釋放(9.5 h)，而副性腺蛋白液、精莢囊蛋白液、精巢蛋白液和纏卵腺蛋白液對(duì)精子釋放無顯著影響。持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，與海水相比，精莢在副性腺蛋白液、精莢囊蛋白液、精巢蛋白液和纏卵腺蛋白液中保持完整形態(tài)的時(shí)間較短，這些蛋白液亦對(duì)精子釋放產(chǎn)生影響，但影響較弱。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，并參與能量供給。Cowey[10]研究發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量和含量的蛋白質(zhì)對(duì)虹鱒(Salmogairdneri)肝臟組織內(nèi)某些酶的活力產(chǎn)生影響。由此推斷，本實(shí)驗(yàn)中特定的組織蛋白液可能為金烏賊精莢中某些酶提供能量，促進(jìn)了精子釋放，其中卵巢蛋白液的作用較為明顯。迄今，國內(nèi)外學(xué)者針對(duì)精莢中精子釋放的影響因素開展了大量研究。曲迪[2]在對(duì)中華絨螯蟹的精莢破裂機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，精液、卵巢蛋白和納精囊蛋白均對(duì)精莢破裂無影響，而雄性副性腺蛋白在精莢破裂過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。Wang[11]通過硫酸銨沉淀、Sephacryl S-200凝膠層析柱和DEAE-Sephacel離子層析柱等實(shí)驗(yàn)，從副性腺發(fā)育后期內(nèi)容物蛋白中分離純化出一種約50 kDa的蛋白，這種蛋白可促進(jìn)精莢破裂，并經(jīng)過HPLC-ESI-MS/MS shotgun分析鑒定為組織蛋白酶A。顏躍弟[12]利用胰蛋白酶使日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)精莢破裂進(jìn)而獲得存活率較高的游離精子。Takami[13]認(rèn)為土鱉蟲(Carabusinsulicola)納精囊開口部位和輸卵管處的腺體或細(xì)胞可分泌某些蛋白酶使精莢破裂。還有學(xué)者認(rèn)為，精莢在進(jìn)入納精囊后，納精囊中的某些低分子量的化學(xué)物質(zhì)可滲透進(jìn)入精莢中，導(dǎo)致精莢破裂[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，金烏賊一個(gè)精莢中精子數(shù)量約為1.99×107個(gè)。在水溫30℃時(shí)，凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)精莢第一次再生后精子總數(shù)最高達(dá)1.49×107個(gè)[15]。只有處于激烈運(yùn)動(dòng)狀態(tài)時(shí)精子才能有效進(jìn)入卵子，因此精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間是衡量精子活力的主要指標(biāo)。金烏賊精子活力隨溫度的升高呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，精子活力最適溫度范圍為20.22～22.76℃，在21℃時(shí)精子活力最強(qiáng)，精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命分別為(116.67±6.67)和(206.67±6.67) min，這與膠州灣內(nèi)金烏賊繁殖期海水溫度11～25 ℃相一致[5]。斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)精子的活力隨著溫度升高而逐步升高，當(dāng)?shù)竭_(dá)臨界溫度時(shí)又會(huì)下降，且精子活力的最適范圍為25～31 ℃[16]。長鰭籃子魚(Siganuscanaliculatus)和點(diǎn)籃子魚(Siganusguttatus)精子最適溫度范圍為20～25 ℃和25～30 ℃[17]。由此可見，魚類的適溫性不同，其精子活力的最高適溫范圍也隨之變化。暖溫性并具有精莢的金烏賊，其精子壽命和受精能力遠(yuǎn)大于上述暖水性魚種，這也是對(duì)其特殊繁殖習(xí)性的一種適應(yīng)。

某些體外受精的物種，其精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和精子壽命較短，如斜帶石斑魚在29 ℃時(shí)精子活力達(dá)到最高，此時(shí)精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和精子壽命分別為27和37 min[16]，23.5 ℃時(shí)瓣結(jié)魚(Foliferbrevifilis)精子在0.45%～ 0.55%的NaCl溶液中劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和精子壽命最長，分別為33.5和172.5 s[18]，而一定劑量紫外線輻射下西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)精子壽命和激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間最高可達(dá)467和40 s[19]，遠(yuǎn)低于金烏賊。有研究表明，海月水母(Aureliasp．)[20]和瑪麗魚(Poecilialatipinna)[21]等體內(nèi)受精的物種，其精子壽命和激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間較長，水溫22 ℃時(shí)，海月水母精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命分別為4 h 30 min和10 h。25 ℃時(shí)，瑪麗魚精子壽命長達(dá)3～5 h。21 ℃時(shí)金烏賊精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和精子壽命較長，分別為(116.67±6.67)和(206.67±6.67) min，精子較長的激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命有助于體內(nèi)受精，因此推測金烏賊的生殖方式應(yīng)為體內(nèi)受精，但粘附于口膜處的精莢，其精子釋放、入卵方式和精卵結(jié)合的場所等仍有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)語

金烏賊卵巢蛋白提取液可明顯促進(jìn)精莢中精子釋放，但具體是何種化學(xué)物質(zhì)發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步探究。同時(shí)本研究明確了精子活力最高的適宜溫度為20.22～22.76 ℃。研究結(jié)果豐富了金烏賊繁殖生物學(xué)的內(nèi)容，為有效開展頭足類人工繁育提供了科學(xué)依據(jù)。