楊秀清,梁祺,韓作穎

(1.山西大學 生物技術研究所 化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,山西 太原 030006;2.煤與煤層氣共采國家重點實驗室,山西 晉城 048000)

0 引言

煤層氣是一種以甲烷為主要成分的自生自儲的非常規(guī)天然氣[1],根據(jù)形成機制的不同,分為生物成因氣和熱成因氣兩種。隨著資源的日益短缺,煤層氣越來越受人們的關注,其中生物成因氣尤為突出,它的開采和利用使得廢棄煤礦等變廢為寶,實現(xiàn)了煤層氣的再生和資源的再利用。國內(nèi)外對于微生物增產(chǎn)煤層氣的研究涉及范圍非常廣,如實地勘探、現(xiàn)場注入,實驗室條件下模擬產(chǎn)氣[2],利用微生物分子生態(tài)學的方法進行微生物菌群特征分析等,研究不同成氣條件下生物成因氣的形成機理及成氣過程中的功能微生物菌群。

影響生物成因氣生成的因素有很多,主要包括溫度、pH、煤的溶解程度和粒徑大小、營養(yǎng)物質、鹽度、孔隙空間以及沉積速率、沉積環(huán)境等。為了增產(chǎn)煤層氣,有學者添加一些營養(yǎng)物質、微量元素、維生素等到煤的發(fā)酵液中,刺激微生物菌群代謝煤產(chǎn)生甲烷。如Wang 等通過添加酵母膏等營養(yǎng)物質來刺激微生物菌群增加甲烷產(chǎn)量[3], Harris等發(fā)現(xiàn)甲酸的添加可以提高甲烷產(chǎn)率[4]。此外,還有研究表明加入新的或外源微生物可增加微生物活性,進而促進煤層氣的生成。Jones等用濕地富集的微生物菌群進行模擬產(chǎn)氣,發(fā)現(xiàn)實驗條件下每克煤產(chǎn)生80 μmol甲烷,同時還證實這些微生物菌群有使廢棄煤層氣井再生產(chǎn)的可能[5]。還有結果表明,改善培養(yǎng)環(huán)境可以使微生物更好地和煤進行相互作用。Green等研究了從粉河盆地產(chǎn)出水中富集的產(chǎn)甲烷菌群,發(fā)現(xiàn)溫度、培養(yǎng)液的pH值以及煤的顆粒度均會對產(chǎn)CH4速率有顯著影響[6]。

乙醇作為一種無毒廉價的有機材料而被研究者關注。Bi等通過尋找最佳的培養(yǎng)基配方來增強微生物的活性,他們向培養(yǎng)基中加入一些有機溶劑和表面活性劑SDS,結果表明,添加乙醇、甲醇和異丙醇可以增加煤的生物轉化[7]。Zhang 等發(fā)現(xiàn)添加乙醇可以提高甲烷含量,且這種作用依賴于乙醇的濃度,當乙醇為100 mmol·L-1時,產(chǎn)甲烷率可以提高24倍,當乙醇為300 mmol·L-1時卻沒有這種效果[8]。Liu等的實驗表明,加入5～10 mg乙醇到10 g煤中,也提高了微生物生產(chǎn)甲烷能力[9]。

本課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)了乙醇可以促進微生物產(chǎn)氣,當乙醇含量為1%時,產(chǎn)氣量最高,可達44.86 mL·g-1,是不添加乙醇實驗組產(chǎn)氣量的2倍多。盡管國內(nèi)外的研究,包括本課題組的研究都證實了添加乙醇可以促進生物產(chǎn)氣,但是乙醇為什么會促進煤制甲烷的生成,乙醇的添加與產(chǎn)氣微生物之間有什么聯(lián)系還不得而知。本文在不同的發(fā)酵時間取樣,通過PCR-DGGE和高通量測序的方法,研究微生物菌群的變化,揭示乙醇在整個發(fā)酵過程中導致了哪些微生物的變化及對產(chǎn)氣類型的影響,同時也結合實時熒光定量PCR技術來分析微生物菌群數(shù)量的變化,以期對發(fā)酵過程中微生物菌群結構、數(shù)量和產(chǎn)氣類型做全方位的分析。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

煤樣取自內(nèi)蒙古錫林浩特市神華勝利煤田的褐煤。將煤塊粉碎過篩后,制成顆粒度為180～250 μm(60～80目)的煤粉,80℃真空干燥24 h,放入干燥器中備用。實驗所用接種物為山西寺河礦區(qū)121煤層氣井中的產(chǎn)出水樣富集馴化后的培養(yǎng)液。

1.2 主要試劑和儀器

DNA膠回收試劑盒、Proteinase K,生工生物工程股份有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS),北京索萊寶科技有限公司;EasyTaq ploymerase,北京全式金生物技術有限公司; 10 000×4s Red plus、過硫酸銨(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺、尿素、甲酰胺、雙丙烯酰胺,生工生物工程股份有限公司;機械振蕩器Mini-Bead Beater,BioSpec Products,USA;PCR儀,美國伯樂公司PTC-200型;酶標儀,美國伯騰儀器有限公司;YQX-Π 型厭氧手套箱,上海躍進醫(yī)療器械廠;電泳儀,北京六一儀器廠;美國伯樂DCodeTM通用突變檢測系統(tǒng),美國BIO-RAD 公司;Gel Doc 2000 UV 凝膠成像系統(tǒng),美國BIO-RAD 公司。

1.3 實驗用培養(yǎng)基

基礎培養(yǎng)基配方(g·L-1):酵母抽提物2.0 g,K2HPO42.9 g,KH2PO41.5 g,NH4Cl 1.8 g,MgCl20.4 g,半胱氨酸 3 g,刃天青0.002 g。

微量元素溶液配方為(g·L-1):氮三乙酸 1.5 g,CaCl20.1 g,MgSO4·7H2O 3.0 g,H3BO30.05 g,FeSO40.1 g,NaCl 1.0 g,COCl20.1 g,MnSO40.5 g,ZnSO40.1g,NaMO40.05 g,A1K(SO4)20.01 g,NiCl20.1g,CuSO40.01 g。

1.4 厭氧發(fā)酵實驗

以500 mL的厭氧瓶作為反應容器,加入250 mL培養(yǎng)基,50 mL菌液,及20 g煤粉,將實驗分為3組,每組設置3個重復。第1組添加1.5 mL乙醇(0.5%,V/V),第2組添加3.0 mL乙醇(1%,V/V),對照組不加乙醇,其余條件都相同。以上操作全部在厭氧操作箱中進行。

1.5 基因組DNA的提取

在第28、35、42、49、60、86和92 d(依次命名為28、35、42、49、60、86、92)分別進行取樣。乙醇含量0%、0.5%、1%,分別命名為A,B和C三組。將采集的各樣品于12 000 r/min條件下離心1 min,收集菌體供提取煤地質微生物基因組。提基因組的方法參照楊秀清等[10]。收集的菌體經(jīng)TPM、STE洗滌后,用Mini-Bead Beater (MBB)玻璃珠進行細胞破碎(2 500 r/min,30 s),2～3。合并上清液于新的EP管中,加入SDS、蛋白酶K對菌體進行裂解(55℃,2～3 h)。再用有機溶劑酚-氯仿,異丙醇進行抽提,最后用75%的乙醇進行洗滌,加ddH2O溶解。用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提基因組的大小。用酶標儀檢測所提基因組的濃度與純度。

1.6 16SrRNA基因片段的擴增

提取的基因組DNA作為模板,以細菌V3區(qū)(338F/518R)和古菌V3區(qū)(0357F/Arch519R)的通用引物進行目的片段擴增。PCR擴增體系:10×Easy Taq buffer 5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL,10 μmol/L的上下游引物各2 μL,Easy Taq ploymerase 1 μL,DNA模板2 μL,加蒸餾水至50 μL。PCR反應程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 45 s,30 個循環(huán);72℃ 10 min。細菌及古菌PCR擴增體系及反應程序相同。PCR產(chǎn)物在1.5% 的瓊脂糖凝膠中檢測目標片段長度,以驗證PCR的正確性,隨后用膠回收試劑盒對目的產(chǎn)物進行純化,供高通量測序使用。DGGE上樣所需PCR產(chǎn)物以富含GC含量的引物(細菌338F-GC/518R,古菌0357F-GC/Arch519R)進行PCR。

1.7 DGGE

PCR-DGGE分析使用美國BIO-RAD 公司的D-code 系統(tǒng)。將細菌PCR 產(chǎn)物上樣到質量分數(shù)10%聚丙烯酰胺凝膠上,古菌PCR 產(chǎn)物上樣到8%聚丙烯酰胺凝膠上,60℃ 85 V下電泳12 h,變性梯度范圍為40%～60%。電泳完畢后,將膠放入3×的4s Red plus 染液中染色20 min 左右,用凝膠成像儀記錄圖像,并用QuantityOne 軟件進行分析。

1.8 實時熒光定量PCR

PCR反應體系為20 μL,上下游引物各0.8 μL,SYBR Green PCR Master Mix 10 μL,ddH2O 7.3 μL,Roxdye 0.1 μL,基因組DNA模板1 μL。細菌所用引物為(338F/518R),古菌所用引物為(344F/Arch519R)。

PCR反應程序:95℃ 5 min;95℃ 10 s,55℃ 30 s,30 個循環(huán)。每個循環(huán)結束后,收集熒光信號。本實驗采用Bio-Rad CFX Manager進行實驗結果的記錄與分析,每個樣品重復3次,最后結果取平均值。

統(tǒng)計學方法:選用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析,兩組間的比較用獨立樣本t檢驗,α=0.05為檢驗標準。

1.9 高通量測序數(shù)據(jù)處理

測序完成后,使用 FLASH v1.2.7軟件,對每個樣品的 reads 進行拼接;然后使用 Trimmomatic v0.33軟件,對拼接得到的 Raw Tags進行過濾,得到高質量的 Tags 數(shù)據(jù);最后使用 UCHIME v4.2軟件,鑒定并去除嵌合體序列,得到最終有效優(yōu)質序列。用QIIME(version 1.8.0)軟件中的 UCLUST對優(yōu)質序列在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU,并進行物種注釋及豐度分析。基于OTU數(shù)量的結果,評估樣品生物α多樣性(包括 Chao1 值、ACE 值、Shannon 以及Simpson指數(shù))和β多樣性。

2 結果與分析

2.1 PCR-DGGE分析

細菌的16S rRNA V3區(qū)PCR-DGGE圖譜見圖1,古菌的16S rRNA V3區(qū)PCR-DGGE圖譜見圖2,所用Marker參照楊秀清等制備[10-11]。樣品經(jīng)過變性梯度凝膠電泳后,分離出數(shù)量不等的條帶,細菌圖譜中各個樣品中有3～15條條帶,古菌圖譜中各個樣品有2～4條條帶,可見各個樣品中細菌物種較為豐富,古菌物種則較少。各個樣品有共同的條帶,但是條帶的亮度不同,表明微生物菌群的豐度不同。樣品中大多數(shù)條帶都與細菌Marker一致,這些條帶所對應的菌種在整個發(fā)酵過程中起主導作用。與物種Marker對比可知,細菌圖譜中所對應的條帶分別屬于變形桿菌屬(Proteus)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、屠場桿狀菌屬(Macellibacteroides)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、梭菌屬(Clostridium)、Parabacteroides,古菌圖譜中的條帶分別屬于甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)。用Quantity one軟件對DGGE圖譜進行優(yōu)化處理,即基本的背景排除功能,然后經(jīng)過泳道(Lane)識別、條帶(Band)識別和配對,對圖譜中的條帶進行定量分析。細菌及古菌的菌群相對含量柱狀圖見圖3和圖4。根據(jù)圖3可以看出不同樣品中細菌的種類較多,各菌群的相對豐度變化較小,不會由于乙醇含量的增加而發(fā)生明顯的改變。而圖4顯示僅有兩種甲烷古菌物種,即Methanosarcina和Methanobacterium。它們隨著樣品的變化,呈現(xiàn)一個較大的波動。隨著樣品從A組到B、C組,Methanobacterium出現(xiàn)一個先減少后增多的現(xiàn)象,而Methanosarcina則是先增多后減少。在A49中Methanosarcina所占比例為60%,而Methanobacterium僅占40%。在B42中,Methanobacterium占優(yōu)勢(72%),而Methanosarcina則占28%,在C42中,出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象?？梢?乙醇的添加對產(chǎn)甲烷古菌有明顯的影響。

M:Marker.It represented Clostridium, Enterococcus, Parabacteroides, Macellibacteroides, Proteus, Desulfovibrio,Raultella Citrobacter, Cloacibacillus, Stenotrophomonas, Acetoanaerobium, respectively from top to bottom;1-10 represented samples for A28, A35, A42, A49, B28, B35, B42, C28, C35 and C42 respectivelyFig.1 PCR-DGGE fingerprints of 16S rRNA V3 region of bacteria in some samplesM:Marker 從上到下依次為Clostridium、Enterococcus、Parabacteroides、Macellibacteroides、Proteus、Desulfovibrio、Raultella Citrobacter、Cloacibacillus、Stenotrophomonas、Acetoanaerobium;1-10依次為樣品 A28、A35、A42、A49、B28、B35、B42、C28、C35、C42圖1 部分樣品細菌的16S rRNA V3區(qū)PCR-DGGE指紋圖譜

M: Marker 1-10 represented samples for A28, A35, A42, A49, B28, B35, B42, C28, C35 and C42 respectivelyFig.2 PCR-DGGE fingerprints of 16S rRNA V3 region of archaea in some samplesM:Marker 1-10依次為樣品A28、A35、A42、A49、B28、B35、B42、C28、C35、C42圖2 部分樣品古菌的16S rRNA V3區(qū)PCR-DGGE指紋圖譜

2.2 實時熒光定量PCR

各樣品中細菌及古菌的數(shù)量見表2。從2表可以看出,發(fā)酵天數(shù)為28 d和35 d時,A、B、C各組不論是細菌還是古菌的菌群數(shù)量之間不存在明顯差異(P>0.05),說明在短期發(fā)酵時間內(nèi),乙醇的作用發(fā)揮的不明顯。當發(fā)酵天數(shù)為42 d、49 d和60 d時,B、C組與A組菌群數(shù)量之間存在明顯差異(P<0.05),說明隨著發(fā)酵時間的延長,乙醇開始發(fā)揮作用,菌群數(shù)量開始明顯增加?？偟膩碇v,隨著發(fā)酵時間的延長,菌群數(shù)量不斷增加,乙醇的添加導致了微生物菌群數(shù)量的明顯增加,但是它作用的發(fā)揮還受發(fā)酵時間的影響。細菌的菌群數(shù)量要多于古菌的菌群數(shù)量,由于產(chǎn)甲烷古菌只能利用像H2/CO2、甲酸、乙酸等簡單的物質來產(chǎn)甲烷,所以推測乙醇是被細菌微生物直接利用,導致細菌菌群較為活躍,細菌菌群數(shù)量多且增長快。

Fig.3 Relative abundance histogram of bacterial flora in DGGE spectrum圖3 DGGE圖譜細菌菌群相對豐度柱狀圖

Fig.4 Relative abundance histogram of archaea flora in DGGE spectrum圖4 DGGE圖譜古菌菌群相對豐度柱狀圖

2.3 高通量測序分析

高通量測序結果顯示,細菌40個樣品測序共獲得2 522 076條優(yōu)質序列,古菌40個樣品測序共獲得2 311 412條優(yōu)質序列。將序列之間相似性高于97%定義為一個OTU,每個OTU對應于一種代表序列。細菌菌群OTU統(tǒng)計為283,古菌菌群OTU統(tǒng)計為22。

圖5a和圖5b為細菌和古菌屬水平物種累積曲線圖,反映了樣本數(shù)量與注釋到的物種數(shù)量間的關系。單個紅色箱形反映了抽取的樣本的總種數(shù)；總的紅色箱形組成了累積曲線,反映了持續(xù)抽樣下新物種出現(xiàn)的速率。單個綠色箱形反映了抽取的樣本中的種數(shù);總的綠色箱形組成共有量曲線,反映了持續(xù)抽樣下樣本共有種出現(xiàn)的速率。在一定范圍內(nèi),隨著樣本量的加大,若曲線急劇上升,則代表群落中有出現(xiàn)大量新種,說明樣本量不足。若曲線趨于平緩,則表示抽樣充分。從圖5a和圖5b可以看出,不管是總種數(shù)還是共有種數(shù),隨著樣品數(shù)的增加,都呈現(xiàn)平緩的趨勢?？梢娢覀儤颖玖砍浞?可以進行數(shù)據(jù)分析。

2.4 序列號

研究得到的高通量測序結果提交至NCBI SRA (Sequencet Read Archive)數(shù)據(jù)庫,收錄號為SRS3948544。

2.5 產(chǎn)甲烷混合菌群群落結構及動態(tài)變化

樣本名稱細菌數(shù)量/mL古菌數(shù)量/mL A 283.02±0.782.22±0.39 B 284.71±0.583.78±0.26 C 283.50±0.353.55±0.42 P值0.210.32 A 353.66±0.402.55±0.31 B 353.06±0.643.83±0.25 C 353.72±0.223.71±0.32 P值0.100.22 A 423.85±0.57a3.66±0.39a B 425.67±0.45b3.81±0.56b C 424.78±0.27b3.71±0.45b P值0.030.03 A 493.28±0.65a3.73±0.12a B 494.63±0.36b3.94±0.47b C 494.79±0.32b4.79±0.50b P值0.030.02 A 603.63±0.60a3.77±0.48a B 605.41±0.55b4.88±0.36b C 605.87±0.39b5.08±0.21b P值0.010.01 注:同列上角標相同字母表示差異不顯著(P>0.05),不含相同字母表示差異顯著(P<0.05)。

The red box represented the total number of species containing in the sampled samples,and the green box represented the number of species in common in the sampled samplesFig.5 (a) Species accumulation curve of bacteria genus;(b) Species accumulation curve of archaea genus紅色箱形代表了抽取的樣本中所含有的總物種數(shù),綠色箱形代表了抽取的樣本中所共有的物種數(shù)圖5 (a)細菌屬水平物種累積曲線圖;(b)古菌屬水平物種累積曲線圖

為了便于數(shù)據(jù)分析,隨機挑選了一些樣品的測序結果進行展示。如圖6a所示,在產(chǎn)氣發(fā)酵過程中,微生物細菌群落在門的水平上主要由厚壁菌門 (Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)組成。如圖6b,從細菌屬水平上群落豐度分析,主要的菌屬有變形桿菌屬、脫硫弧菌屬、屠場桿狀菌屬、Paraclostridium、檸檬酸桿菌屬,還有少量的腸球菌屬(Enterococcus)以及Tyzzerella。整體來看,隨著發(fā)酵時間的延長,A、B、C三個實驗組的物種趨勢的變化是相似的。對于古菌菌群,主要是廣古菌門(Euryarchaeota);從屬的水平分析(圖7b),主要由Candidatus-Methanoplasma、甲烷桿菌屬、甲烷八疊球菌屬組成,還有少量的產(chǎn)甲烷袋菌屬(Methanofollis)。值得注意的是,在古菌門和屬的物種分布圖中出現(xiàn)了細菌的身影,這是由于細菌的16S序列與古菌的16S序列有一定的相似性,所以在進行高通量測序時,雖然使用古菌特異性引物擴增的16s序列,但是還是不可避免的非特異性擴增出細菌的16s序列[12]。在Yang等人的研究中也出現(xiàn)類似的情況[13]

在樣品A28中,Candidatus-Methanoplasma占絕對優(yōu)勢(達81.75%)。隨著發(fā)酵時間的延長,Candidatus-Methanoplasma越來越少,在發(fā)酵60 d后,Candidatus-Methanoplasma減少為13.66%(A60)。A、B、C三組樣品中,隨著發(fā)酵時間的延長,Candidatus-Methanoplasma都有所減少。

在A組樣品中,A28中Methanosarcina含量為4.33%,A49中Methanosarcina含量為7.16%,A60中Methanosarcina含量為46.55%,隨著發(fā)酵時間的延長,Methanosarcina逐漸變?yōu)閮?yōu)勢菌屬。而在B、C組樣品中,Methanobacterium逐漸成為優(yōu)勢菌屬,B92中Methanobacterium含量為46.80%,C92中Methanobacterium含量為64.92%。表明,乙醇的添加對細菌微生物菌群結構影響不大,但明顯改變了產(chǎn)甲烷古菌的微生物菌群結構,與PCR-DGGE結果一致。

Fig.6 Bar chart of the relative abundance of the top 10 bacteria of each group in (a) phylum and (b) genus level圖6 細菌門水平(a)和屬水平(b)的物種分布圖

Fig.7 Bar chart of the relative abundance of the top 10 archaea of each group in (a) phylum and (b) genus level圖7 古菌在門水平(a)和屬水平(b)的物種分布圖

2.6 產(chǎn)氣途徑分析

根據(jù)產(chǎn)甲烷菌的產(chǎn)甲烷機制不同,將生物成因氣的產(chǎn)氣途徑分為三大類:(1) 氫營養(yǎng)型,將CO2還原轉化為甲烷;(2) 乙酸營養(yǎng)型,轉化乙酸產(chǎn)生甲烷;(3) 甲基營養(yǎng)型,轉化甲基類化合物如CH3OH、C13H13N、C2H6S等生成甲烷。在煤層氣田中,氫營養(yǎng)型產(chǎn)氣途徑最為常見,乙酸營養(yǎng)型次之,甲基營養(yǎng)型最少。本研究中PCR-DGGE與高通量測序結果顯示,在發(fā)酵初期,Candidatus-Methanoplasma占優(yōu)勢,該菌屬于混合營養(yǎng)型產(chǎn)氣[14]。隨著發(fā)酵時間的延長,對照組中Methanosarcina增多,甲烷產(chǎn)量增加;添加乙醇的實驗組則是Methanobacterium逐漸增多。Methanosarcina可利用廣泛的底物產(chǎn)甲烷,但在煤層氣的研究中以降解乙酸為主[15]，所以對照組的產(chǎn)氣類型為乙酸營養(yǎng)型。而Methanobacterium則是典型的氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌屬[16],故添加乙醇的實驗組產(chǎn)氣類型為氫營養(yǎng)型。可見乙醇的加入導致了本實驗中甲烷產(chǎn)氣類型的而改變,由混合型和乙酸營養(yǎng)型的產(chǎn)氣類型改變?yōu)闅錉I養(yǎng)型的產(chǎn)氣類型。

3 討論和結論

微生物增產(chǎn)煤層氣被認為是具有應用前景的一種煤層氣再生方式,可以有效緩解能源短缺。國內(nèi)外的研究者通過從微生物刺激、微生物強化、增加煤溶解度和生物利用率等方面來增產(chǎn)煤層氣,特別是在添加營養(yǎng)物質刺激微生物復蘇和生長,已成為研究的熱點[17]。煤地質微生物處在一種較為惡劣和缺乏營養(yǎng)的環(huán)境下,處于不活潑的狀態(tài),需要某些環(huán)境的刺激,才能更好地進行代謝活動。乙醇作為一種綠色、環(huán)保、廉價的有機物,也被用于微生物增產(chǎn)煤層氣的研究。通過添加乙醇來刺激微生物活性,發(fā)現(xiàn)添加乙醇可以增加甲烷的產(chǎn)量[7-9]，證實了利用乙醇可以增產(chǎn)煤層氣,因其無毒在現(xiàn)場實驗中便于操作,不需要繁雜的防護措施；還因其廉價,可以在實地進行大規(guī)模的實驗研究,其增產(chǎn)煤層氣產(chǎn)生的經(jīng)濟效益遠大于乙醇的投入成本。所以利用乙醇增產(chǎn)煤層氣具有一定的可行性和經(jīng)濟效益。但是在產(chǎn)氣過程中,微生物菌群如何變化,與乙醇的添加有何關聯(lián)還有待進一步研究。

本文通過PCR-DGGE、實時熒光定量PCR、高通量測序相結合的方法,研究了在乙醇存在下,生物成氣過程中微生物菌群結構和數(shù)量的變化。結果顯示,隨著發(fā)酵時間的延長,樣品中細菌及古菌菌群數(shù)量不斷增加。細菌菌群結構隨著乙醇的添加變化不明顯,而古菌菌群結構則受乙醇的強烈影響。高通量測序結果顯示,細菌物種組成在門水平上主要有三大類,分別是厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門,與PCR-DGGE指紋圖譜顯示的結果相同。從細菌屬的分類學水平來看,主要參與的菌屬有變形桿菌屬、脫硫弧菌屬、屠場桿狀菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter),還有少量的腸球菌屬以及Tyzzerella。PCR-DGGE中顯示條帶所代表的物種主要有Proteus、Desulfovibrio、Macellibacteroides、Citrobacter、Clostridium、Parabacteroides。二者顯示結果幾乎一致。比較這二者的物種相對豐度柱狀圖可知,物種組成及變化趨勢是相同的,即乙醇的添加對細菌菌群結構變化影響不大。實時熒光定量PCR結果顯示,細菌微生物菌群的數(shù)量隨著發(fā)酵時間的延長而不斷增加。這些細菌微生物菌群屬于發(fā)酵細菌和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌,它們共同作用參與大分子煤的降解過程。厚壁菌門中的微生物主要參與一些混合酸、醇和中性物質的生成,其中的梭菌科在一些淀粉、纖維質、幾丁質等的解聚中扮演重要角色[16],樣品混合菌群中屬于該門的菌屬有Paraclostridium、Tyzzerella、Enterococcus。變形菌門是種類較為豐富的一類細菌。一般生物成因煤層氣中的變形菌主要以互養(yǎng)型的β-,γ-和δ-變形菌為主[16],Desulfovibrio屬于變形菌門的δ-變形菌,是一種硫酸鹽還原菌,僅能利用硫酸鹽進行呼吸作用,其次,Deslfovibrio也可以和產(chǎn)甲烷古菌一樣能夠利用乙酸和H2,從而進而促進煤大分子的降解[18]。Proteus是一種兼性厭氧的革蘭氏陰性細菌,以氧化和發(fā)酵形式分解糖類,產(chǎn)酸產(chǎn)氣。擬桿菌門在沉積物中較常見,是一大類化能自養(yǎng)型微生物,樣品混合菌群中屬于該門的菌屬有Macellibacteroides、Citrobacter,它們主要參與大分子如蛋白質、糖、纖維素等的降解,發(fā)酵成為甲酸、氫氣和二氧化碳[19-20]。

高通量測序得出,古菌物種組成在門的水平上主要是廣古菌門,與PCR-DGGE結果完全一致。從屬的水平看,主要由Candidatus-Methanoplasma、甲烷桿菌屬、甲烷八疊球菌屬組成。PCR-DGGE指紋圖譜所示條帶有兩條,分別為Methanobacterium、Methanosarcina,沒有出現(xiàn)Candidatus-Methanoplasma，可能是由于Candidatus-Methanoplasma屬下有很多的種,高豐度的屬分散在不同的種里,豐度不會那么集中,而PCR-DGGE指紋圖譜只能顯示屬水平上的豐度,所以受到干擾顯示不出來,具體原因還需要進一步研究。Candidatus-Methanoplasma屬于Methanomassiliicoccales,這是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第七類產(chǎn)甲烷菌目[21],是由專性的氫依賴性甲基營養(yǎng)菌組成,屬于混合營養(yǎng)型[14]。本研究使用的接種物與楊秀清等[22]研究中使用的接種物相同,然而其研究中并未發(fā)現(xiàn)Candidatus-Methanoplasma。在煤層氣微生物菌群的研究也幾乎沒有發(fā)現(xiàn)過這種細菌,而是在反芻動物和人類糞便的胃中發(fā)現(xiàn)有它的身影[21,23]，這種古菌并不利于甲烷的生成。本研究中使用的接種來源是富集和馴化后的培養(yǎng)基,推測這種古菌是在富集和馴化過程中產(chǎn)生的。比較PCR-DGGE和高通量測序二者的物種柱狀圖,物種組成及變化趨勢是相似的,添加乙醇的實驗組與對照組之間存在明顯的差別。對照組中,隨著發(fā)酵時間的延長,甲烷八疊球菌屬逐漸增多,添加0.5%和1%乙醇的實驗組中則是甲烷桿菌屬明顯增加。Methanosarcina具有廣泛的可利用底物,能夠利用乙酸、CO2、甲醇、甲胺、甲基硫化物等多種有機或無機化合物為底物產(chǎn)生甲烷[24]。但在有關煤開采研究中,降解乙酸是主要途徑,因為乙酸鹽比氫氣更易獲得[15],因此Methanosarcina產(chǎn)甲烷途徑應該是乙酸型,而Methanobacterium則是典型的氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌屬[15]。所以推測隨著發(fā)酵時間的延長,對照組以混合營養(yǎng)型和乙酸型的產(chǎn)甲烷途徑為主,添加乙醇的實驗組以氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑為主。