魏春華，夏 偉，馬 英，李 娜，吳熠丹，勾明郗，林志峰，戴愛(ài)玲，楊小燕，劉建奎

(龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖364000)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由 PRRS 病毒(PRRSV)引起的一種高度傳染性疾病，主要以母豬繁殖障礙及仔豬嚴(yán)重的呼吸道疾病為主要特征，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。2006年國(guó)內(nèi)暴發(fā)的高致病性PRRS (Highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)給中國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。2013年左右我國(guó)出現(xiàn)了引起妊娠母豬嚴(yán)重流產(chǎn)和仔豬呼吸系統(tǒng)疾病的新流行株NADC30-like PRRSV[4-8]。近年來(lái)小范圍流行的譜系3 (Lineage 3)的病毒株，進(jìn)一步加大了對(duì)PRRS 的防控難度。Shi 等對(duì)全球8624 份PRRSV ORF5 基因序列進(jìn)行分析，將PRRSV-2 分為9 個(gè)譜系(lineage)：1～9，每個(gè)譜系的病毒株又可劃分為不同的亞型[9]。研究顯示，目前我國(guó)PRRSV 分為4 個(gè)譜系：lineage 1、lineage 3、lineage 5.1 和lineage 8[10-11]。 HP-PRRSVs 和 CH-1a-like PRRSV 屬 于lineage 8.7， NADC30-like PRRSV 屬 于 lineage 1，VR2332、RespPRRS MLV 等經(jīng)典株屬于lineage 5.1，QYYZ 和 GM2 病毒株屬于lineage 3。

福建省是養(yǎng)豬大省，生豬貿(mào)易比較發(fā)達(dá)，PRRS已嚴(yán)重阻礙了當(dāng)?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，為了進(jìn)一步了解福建省PRRSV 遺傳變異特性，本研究選取不同譜系的福建省14 個(gè)病毒株(lineage 3、lineage 8.7、lineage 5.1 和lineage 1)進(jìn)行病毒分離及全基因組分析，為防控PRRS 提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 PRRSV 來(lái)源與主要試劑14 個(gè)病毒株(lineage 3 中的 1 株、lineage 8.7 中的 5 株、lineage 5.1 中的1 株和lineage 1 中的7 株)分離自福建省不同地市不同年份的疑似PRRS 發(fā)病豬場(chǎng)(表1)。MARC-145 細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)由龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。RNA 提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；Superscript III reverse transcriptase 和Platinumpfx DNA polymerase 購(gòu)自 Invitrogen 公司；山羊抗鼠FITC-lgG 熒光抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；PRRSV N蛋白單克隆抗體(MAb)為本實(shí)驗(yàn)室制備與保存。

1.2 病毒全基因組的克隆、測(cè)序及序列分析按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后以其為模板，參考魏春華等[6]和Leng 等[12]的方法對(duì)PRRSV 全基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增。純化后的目的片段克隆至pEASY-T1 Cloning Kit 中，挑取陽(yáng)性重組菌送往北京睿博測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。采用MEGA 6.0軟件中的鄰近法(Neighbor-joining tree with 1000 bootstrap)對(duì)PRRSV 全基因組進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

表1 福建省14 個(gè)PRRSV-2 序列信息Table 1 Overview of the complete genomes of 14 PRRSV-2 isolates from Fujian procvince

1.3 重組分析利用Recombination Detection Program v.4.24 (RDP 4.24)和 Simplot 3.5.1 軟 件 對(duì)PRRSV 可能的重組事件進(jìn)行檢測(cè)和分析[7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 PRRSV 基因組特性分析經(jīng)拼接后對(duì)14 個(gè)PRRSV 分離株的基因組進(jìn)行分析，結(jié)果顯示福建省14 株P(guān)RRSV 基因組去除poly(A)后的長(zhǎng)度為15 016 bp～15 407 bp (表 1)?；蛲葱苑治鲲@示 14 株P(guān)RRSV 與VR2332 的核苷酸序列同源性為85.0 %～99.4 %，與CH-1a 的核苷酸同序列源性為84.2 %～95.0 %，與JXA1 的核苷酸序列同源性為83.4 %～99.2 %，與NADC30 的核苷酸序列同源性為82.9 %～97.1 %。福建省NADC30-like PRRSV 基因組核苷酸序列與現(xiàn)有的疫苗株同源性差異較大，致使PRRSV 疫苗對(duì)NADC30-like 株的交叉保護(hù)力不強(qiáng)，從而導(dǎo)致該類(lèi)病毒株在福建省，甚至全國(guó)大規(guī)模暴發(fā)[13-14]。同時(shí) NADC30-like PRRSV 與 NADC30 的核苷酸同源性呈逐年降低的趨勢(shì)， 而與國(guó)內(nèi)HP-PRRSV 代表株 JXA1、HuN4、NT1、NT2 等和經(jīng)典株CH-1a 的核苷酸同源性呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，這可能與NADC30-like PRRSV 與HP-PRRSV 頻繁發(fā)生重組有關(guān)。FJZH、FJCH 與JXA1-R 疫苗株的核苷酸同源性最高為99.5 %～99.6 %，而與JXA1 核苷酸同源性為99.1 %～99.2 %，表明FJZH、FJCH 可能來(lái)源于疫苗株。

2.2 PRRSV 5'-UTR 和3'-UTR 的序列分析福建省 14 個(gè)病毒株 5'-UTR 長(zhǎng)度為 189 bp～190 bp，與參考株的核苷酸同源性為88.4 %～100 %，而與EU-type 代表株LV 的核苷酸同源性為39.9%～63.5%。5'-UTR 的start motif 和UUAACC 轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列在所有的病毒株中高度保守。14 個(gè)病毒株的3'-UTR 高度保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(UUAACC)未發(fā)生變異，長(zhǎng)度為148 bp～151 bp，與參考株的核苷酸同源性為84.7 %～100 %，而與EU-type 代表株LV 的核苷酸序列同源性為69.9 %～76.3 %。與VR-2332 相比，F(xiàn)JZ03 等 7 個(gè)病毒株 3'-UTR 長(zhǎng)度為 148 bp，在aa118～aa120 存在一個(gè)獨(dú)有的缺失區(qū)域，與國(guó)內(nèi)其它 NADC30-like PRRSV 和 HP-PRRSV 不同，表明PRRSV 3'-UTR 存在較大程度的變異，這是否會(huì)影響病毒的復(fù)制有待進(jìn)一步研究。

2.3 分離株Nsp2、ORF5 和ORF7 基因推導(dǎo)氨基酸序列分析Nsp2 是PRRSV 基因組中變異最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，是PRRSV 重要的分子遺傳標(biāo)志，也是不同類(lèi)型病毒株分型的分子標(biāo)志。利用MegAlign軟件對(duì)14 個(gè)PRRSV 與參考株Nsp2 基因推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì)。結(jié)果顯示，與參考株VR2332 相比，F(xiàn)JZ03、FJY04、FJM4、FJL15 和 FJWQ16 病毒株的Nsp2 基因具有NADC30-like PRRSV 的分子標(biāo)志 ，存 在 131aa (aa322 ～aa432、 aa483 和 aa504 ～aa522)不連續(xù)缺失，表明5 個(gè)毒株為NADC30-like PRRSV。

以VR2332、NADC30 和JXA1 為參考序列，對(duì)14 個(gè)PRRSV 的GP5 基因的抗原位點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，GP5 N 端抗原位點(diǎn)(aa37～aa51、aa149～aa156、aa166～aa181 和 aa192～aa200)高度保守，而位于C 端抗原位點(diǎn)(aa1～aa15 和aa27～aa35)變異程度較大。Tce60～74 和 Tce149～163 兩個(gè) T 細(xì)胞表位區(qū)高度保守，而Tce149～163 變異程度較大。在已證實(shí)的糖基化位點(diǎn)中，N44 和N51 高度保守，未發(fā)生氨基酸的替換，NADC30-like PRRSV 在N35 位丟失一個(gè)糖基化位點(diǎn)。與參考株比對(duì)分析，顯示NADC30-like PRRSV 存在幾處獨(dú)有的氨基酸突變：L47I、N/V94I、V/I124A 和 E168D。

將福建省14 個(gè)PRRSV N 蛋白氨基酸序列與參考株進(jìn)行比對(duì)分析，顯示NADC30-like PRRSV 存在幾處獨(dú)有的氨基酸突變：K7R、K10N、N34S/R、K48R和Q80R。N 蛋白的共價(jià)作用通過(guò)在保守的第23 位氨基酸處形成二硫鍵，非共價(jià)作用則與aa30～aa37 密切相關(guān)，NADC30-like PRRSV 存在N34S/R 的突變，可能會(huì)影響N 蛋白的空間構(gòu)象[15]。由于PRRSV N蛋白具有高度的免疫原性，因此N 蛋白是檢測(cè)PRRSV 最合適的靶蛋白，PRRSV NADC30-like 株N蛋白與參考株相比，存在多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變，其是否會(huì)對(duì)血清學(xué)檢測(cè)方法產(chǎn)生影響需要進(jìn)一步研究。

2.4 PRRSV 分離株遺傳進(jìn)化分析和重組分析將14 個(gè)PRRSV-2 的全基因組序列及ORF5 基因序列分別與33 株國(guó)內(nèi)外參考株進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹(shù)(圖1)。結(jié)果顯示，14 株P(guān)RRSV 分為5 個(gè)亞群(I-V)，I 亞群包括FJZH、FJCH、FJOU、FJYR、FJW05 和FJXS15，該亞群與HP-PRRSV 代表株 JXA1、HuN4、NT1、HUB1 等處于同一分支。研究表明，2006年之后我國(guó)豬場(chǎng)流行的病毒株主要為HP-PRRSV，因此大部分養(yǎng)殖戶(hù)選擇HP-PRRSV 疫苗進(jìn)行免疫，致使疫苗株長(zhǎng)期在豬場(chǎng)存在，在選擇性免疫壓力下可能會(huì)導(dǎo)致疫苗株突變?yōu)槎玖^強(qiáng)的病毒株[16]。本研究中FJZH 和FJCH 分離于兩個(gè)長(zhǎng)期接種JXA1-R 疫苗的豬場(chǎng)，該兩個(gè)病毒株與疫苗株JXA1-R 親 緣 關(guān) 系 較 近 ， 而 與 JXA1、 HuN4 等HP-PRRSV 親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)，表明這兩個(gè)病毒株可能來(lái)源于疫苗株JXA1-R。II 亞群包括FJE1 和香港分離株HK1、HK13，該亞群處于HP-PRRSV 與HB-1(sh)/2002 之間。FJFS 病毒株屬于III 亞群，與廣東分離株QYYZ 和GM2 處于同一分支，該亞群病毒株為福建省首次發(fā)現(xiàn)，可能由廣東省傳入福建省。FJSD 屬于 IV 亞群，與 VR2332、BJ-4 和 RespPRRS MLV 處于同一分支。PRRSVs NADC30-like 屬于V亞 群 ， 包 括 FJZ03、 FJY04、 FJM4、 FJL15 和FJWQ16，與NADC30、MN184 病毒株的親緣關(guān)系較近，尤其與NADC30 親緣關(guān)系最近，推斷其由NADC30 株衍化而來(lái)。FJW05 和FJXS15 在全基因組構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)中為HP-PRRSV，而在基于ORF5基因序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)中為NADC30-like PRRSV (圖1)，提示 FJW05 和 FJXS15 可能為重組病毒。

圖1 14 株分離株(▲)全基因組(A)和 ORF5 基因(B)與參考毒株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.1 Phylogenetic trees based on complete sequence (A)and ORF5 gene (B)of PRRSV-2 isolates from Fujian and reference strains

利用Simplot 3.51 軟件和RDP 4.24 軟件對(duì)福建省 PRRSV 進(jìn)行重組分析，結(jié)果顯示 FJW05 和FJXS15 存在重組現(xiàn)象，重組位點(diǎn)位于Nsp2 (nt1092)和ORF4 (nt13771)中，該兩個(gè)斷點(diǎn)將兩個(gè)病毒株基因組分為3 個(gè)區(qū)域，斷裂點(diǎn)(nt1092)前和斷裂點(diǎn)(nt13771)后的區(qū)域與JXA1-R 親緣關(guān)系最近，而nt1093～nt13770 區(qū)域與 NADC30 親緣關(guān)系最近(圖2A)，表明 FJW05 和 FJXS15 是 NADC30 與 JXA1-R重組產(chǎn)生的新型病毒株。FJWQ16 株也存在重組現(xiàn)象，重組位點(diǎn)分別位于Nsp7(nt6949)和Nsp9(nt8894)中，斷裂點(diǎn)(nt6949)前和斷裂點(diǎn)(nt8894)后的區(qū)域主要來(lái)自于NADC30，而nt6950～nt8893 區(qū)域主要來(lái)自于 JXA1 (圖2B)，表明 FJWQ16 是 NADC30 與JXA1 重組產(chǎn)生的新型毒株。

圖2 PRRSV FJW05、FJXS15(A)和 FJWQ16 (B)株的重組分析示意圖Fig.2 Genome recombination analysis of FJW05, FJXS15 (A)and FJWQ16 (B)

研究表明部分豬場(chǎng)經(jīng)常存在兩種或兩種以上的PRRSV，從而造成PRRSV 重組的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[17-19]。通過(guò)重組分析軟件和遺傳進(jìn)化樹(shù)分析表明FJW05 和FJXS15 兩個(gè)病毒株可能來(lái)自JXA1-R 株和NADC30-like PRRSV 之間的重組，這兩株病毒在PAMs 和MARC-145 細(xì)胞中具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力，可能會(huì)導(dǎo)致其在豬群中快速傳播和長(zhǎng)期存在。鑒于疫苗株和野毒株存在一定的重組概率，因此豬場(chǎng)在防控PRRS 時(shí)，不能只依靠疫苗進(jìn)行防控，應(yīng)加強(qiáng)豬場(chǎng)的生物安全措施，定期對(duì)豬場(chǎng)的PRRSV 抗原進(jìn)行檢測(cè)，必要時(shí)要從全基因組角度進(jìn)行病原分析，不能只根據(jù)單個(gè)基因進(jìn)行分析。