陳照坤，魯 梅，黃小瑩，馬鑫鑫，朱鳳珠，黃慶華，古曙光，楊少華，許傳田*，崔 寧*

(1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100；3.山東濰坊工程職業(yè)學(xué)院，山東青州262500；4.山東泰安肥城市畜牧獸醫(yī)局；山東肥城271600；5.日照市東港區(qū)西湖鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，山東日照276815)

1994年在我國(guó)廣東地區(qū)首次分離到H9N2 型禽流感病毒(AIV)，隨后在我國(guó)大部分地區(qū)家禽群體中廣泛流行[1]。禽流感(AI)是由A 型流感病毒引起的一種禽類病毒性傳染病。AIV 為單鏈負(fù)RNA 病毒，基因組由8 條單股負(fù)鏈RNA 構(gòu)成。根據(jù)病毒表面糖蛋白(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原性差異，AIV可劃分為18 個(gè) HA 亞型和 11 個(gè) NA 亞型[2-3]；依據(jù)AIV 對(duì)SPF 雞致病性的強(qiáng)弱，將其分為高致病性AIV(HPAIV)和低致病性 AIV(LPAIV)兩種類型[4]。H9N2 AIV 屬于LPAIV，但其廣泛存在變異重組現(xiàn)象，且可以為H5N1、H7N9 及H10N8 等能夠直接感染人并致死的AIV 提供部分甚至整套內(nèi)部基因，潛在危害備受關(guān)注[5-7]。H9N2 AIV 可以作為“載體”將不同亞型的流感病毒從禽類傳播給人類，對(duì)人類健康、養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)具有極大的威脅[8]，被國(guó)際衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)為是潛在的、可能引起下一輪暴發(fā)的AIV?；谝陨显颍狙芯繉?duì)分離到的25 株H9N2 AIV 的基因組序列和遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)性分析，從分子水平上了解山東地區(qū)H9N2 AIV變異情況和導(dǎo)致其表現(xiàn)不同生物學(xué)特性的原因，為H9N2 AIV 跨物種傳播感染哺乳動(dòng)物提供分子預(yù)警材料。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料疑似H9N2 AIV 的489 份病料樣品采自山東及周邊養(yǎng)殖場(chǎng)；9 日齡～11 日齡SPF雞胚購(gòu)自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院SPF 雞場(chǎng)；DL2000 Marker、一步法RT-PCR 試劑盒、RNAiso 試劑、反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、rTaq酶、pMD18-T 載體試劑盒、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自TaKaRa 公司；膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；青霉素(80 IU)、鏈霉素(100 IU)、1.2 %瓊脂糖凝膠、無(wú)菌PBS、LB培養(yǎng)液、LB 固體培養(yǎng)基、SOC 溶液均由本實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 病毒分離與鑒定將疑似H9N2 AIV 的病料勻漿處理后離心取上清，接種9 日齡～11 日齡SPF 雞胚，37 ℃孵化72 h，無(wú)菌收集對(duì)雞紅細(xì)胞有血凝性的尿囊液，提取病毒RNA，參考GenBank 中已登錄的H9N2 AIV 序列，設(shè)計(jì)鑒定引物(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。通過(guò)鑒別診斷引物鑒定H9N2 AIV，鑒定正確的H9N2 AIV 通過(guò)有限稀釋法純化3 代，純化的病毒通過(guò)SPF 雞胚擴(kuò)增后，收集尿囊液分裝作為種毒，-80 ℃保存。

表1 H9N2 AIV 鑒別檢測(cè)及測(cè)序引物Table 1 Different identification and sequencing primers for H9N2 AIV

1.3 病毒各基因節(jié)段的PCR 擴(kuò)增及克隆測(cè)序按照 RNAiso 按照試劑盒說(shuō)明提取1.2 得到的 H9N2 AIV RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)各個(gè)基因節(jié)段參考序列設(shè)計(jì)合成12 對(duì)H9N2 AIV 全基因組擴(kuò)增引物(表1)進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)1.2 %瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，膠回收，分別連接至pMD18-T 載體，轉(zhuǎn)化，經(jīng)菌液PCR鑒定陽(yáng)性菌液送由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.4 序列分析利用DNAStar 軟件將分段測(cè)序的基因節(jié)段拼接為完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)，利用MegAlign 軟件對(duì)各節(jié)段重要位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行比對(duì)分析，按照核苷酸同源性95 %以上作為一個(gè)分支，利用MAGE 4.0 軟件制作8 個(gè)基因節(jié)段的核苷酸遺傳進(jìn)化樹(shù)，分析分離株H9N2 AIV 的分子進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒的分離與鑒定通過(guò)RT-PCR 從489 份疑似AI 病料樣品中鑒定得到76 株H9N2 AIV，分離純化獲得25 株H9N2 AIV (表2)，其中5 株來(lái)源于鴨，20 株來(lái)源于雞，病料均來(lái)自山東周邊的規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的商品鴨、商品雞，發(fā)病日齡在25 日齡～35日齡，商品鴨未免疫H9 疫苗，商品雞7 日齡免疫H9 滅活苗。

表2 25 株H9N2 AIV 分離背景信息Table 2 Isolation background information of 25 strains of H9N2 AIV

2.2 8 個(gè)基因節(jié)段遺傳進(jìn)化和關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析

2.2.1 HA 基因及關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸分析 25 株分離株HA 基因之間的同源性為92.8 %～99.9 %，與Y280-like 的同源性最高，達(dá)89.0 %～91.7 %。與已報(bào)道的2010年～2014年山東分離株同源性較高，說(shuō)明近幾年的山東地區(qū)H9N2 AIV 在核苷酸水平上變異不明顯[9]。HA 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，25 株H9N2 AIV 均屬于歐亞譜系，與Y280 分布在一個(gè)大分支，屬于Y280-like(圖1)。HA 基因裂解位點(diǎn)除了D/SD/Y1/17 是333PSRSNR↓GLF341外，其它 24 株均是333PSRSSR↓GLF341，表明 25 株H9N2 AIV 分離株HA 基因裂解位點(diǎn)仍符合LPAIV 的序列特征。25 株分離株的受體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)部分關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異，共有6 株發(fā)生K149T、K149A 變異，20 株發(fā)生A198V、A198T、A198K 變異，25 株分離株均發(fā)生Q234L 變異，這種突變有易感染哺乳動(dòng)物的趨勢(shì)[10]。糖基化位點(diǎn)數(shù)目與位置形成新的變異趨勢(shì)，25 株分離 株 在 29 ～31、 82 ～84、 141 ～143、 218 ～220、298～300、305～307、313～315、492～494、551～553 位出現(xiàn)潛在糖基化位點(diǎn)，21 株在218～300 位糖基化位點(diǎn)缺失，25 株分離株在313～315 位均出現(xiàn)潛在糖基化位點(diǎn)，這與分離自華南地區(qū)的H9N2 AIV 報(bào)道一致[11]，與2012年上海發(fā)病雞群中分離的3 株H9N2 AIV 變異類似[12]。以上結(jié)果說(shuō)明我國(guó)的H9N2 AIV 病毒株變異趨勢(shì)基本類似，這是否與疫苗的普遍應(yīng)用引起的免疫選擇壓力有關(guān)，需要進(jìn)一步證實(shí)，這些糖基化位點(diǎn)的變異對(duì)病毒致病性的影響也有待深入研究。

2.2.2 NA 基因及關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸分析 研究表明NA 蛋白在病毒的成熟、釋放及感染新細(xì)胞方面均起著關(guān)鍵作用[13-14]，因此對(duì)H9N2 AIV 的NA 基因變異分析的研究有著重要的意義。25 株H9N2 AIV HA 基因之間的同源性可達(dá)91.0 %～99.9 %，與Y280-like 核苷酸同源性相對(duì)較高，為90.3%～92.8%。NA 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，25 株H9N2 AIV 的NA基因均屬于歐亞系，屬于Y280-like 譜系(圖1)。NA蛋白總共發(fā)現(xiàn)10 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，在69、86、146、200、234 位比較保守，在 264、368 和 402 位發(fā)生突變，60 位糖基化位點(diǎn)全部缺失。王守春等認(rèn)為山東地區(qū)H9N2 AIV 的NA 蛋白具有失去402 糖基化位點(diǎn)、獲得264 糖基化位點(diǎn)的趨勢(shì)[15]，本研究中的25 株分離株的NA 蛋白在402 位僅有3 個(gè)病毒株有糖基化位點(diǎn)，而在264 位共有11 個(gè)病毒株出現(xiàn)了糖基化位點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)了這一觀點(diǎn)。這些糖基化位點(diǎn)的變化是否對(duì)病毒生物學(xué)特性造成影響有待進(jìn)一步研究。 4 株分離株(DK/SD/Y1/17、DC/SD/Y2/17、DC/SD/1432/17、DC/S/1434/17)NA 蛋白的366、399 位紅細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)未發(fā)生任何變異，其它位點(diǎn)處均發(fā)生不同程度的變化，366 ～373、399～404 位點(diǎn)氨基酸變異較大，431～433 位點(diǎn)處的氨基酸區(qū)域高度保守，25 株H9N2 AIV NA 蛋白均在63～65 位點(diǎn)缺失TEI。結(jié)果表明25 株H9N2 AIV NA 蛋白分離株NA 基因紅細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)也發(fā)生不同程度的變異。

2.2.3 PB2、PB1、PA、NP、M、NS 基因的遺傳進(jìn)化分析 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，PB2 基因來(lái)自G9-like；PB1、PA、NP、NS 基因來(lái)自 F98-like；M 基因來(lái)自G1-like，6 個(gè)基因節(jié)段均屬于歐亞譜系(圖1)，表明這幾個(gè)基因節(jié)段是由不同進(jìn)化方式而來(lái)。這說(shuō)明近3年山東周邊流行的H9N2 AIV 是由不同進(jìn)化方式而來(lái)，這可能是近幾年H9N2 AIV 在獸醫(yī)臨床案例中對(duì)家禽致病性和危害程度表現(xiàn)多樣化的原因之一，引起這種差別的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

2.2.4 PB2、PB1、PA、NP、M、NS 關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸變異分析 研究表明，A 型流感病毒PB2 蛋白的E627、D701和S7143 個(gè)位點(diǎn)中任一位點(diǎn)發(fā)生突變均會(huì)導(dǎo)致病毒對(duì)小鼠的致病力增強(qiáng)[16-17]。本研究中25 株分離株中有 5 株(CK/SD/3424/16、CK/JS/3596/17、CK/SD/3442/17、 CK/SD/3541/17、 CK/SD/16587/18)PB2 氨基酸發(fā)生了E627V 的變異，1 株(CK/JS/3598/17)發(fā)生了S714C 的變異，表明山東地區(qū)的H9N2 AIV開(kāi)始發(fā)生變異；PA 蛋白中672L 對(duì)病毒氣溶膠傳播特性有一定影響[16-17]，25 株分離株P(guān)A 蛋白第672 位氨基酸均為L(zhǎng)，表明這些分離株均具有通過(guò)氣溶膠傳播的能力；M2 蛋白中發(fā)生S31N 變異會(huì)使流感病毒對(duì)金剛烷胺類藥物的抵抗力增強(qiáng)[16-17]，25 株分離株M2 蛋白序列中均發(fā)生S31N 的變異，表明這些分離株均有對(duì)金剛烷胺類藥物的抵抗力增強(qiáng)的可能性；NS1 蛋白第D92、E97和A149位氨基酸均未發(fā)生變異，干擾素可能仍然對(duì)這25 株分離株起作用。以上結(jié)果表明，近幾年的H9N2 AIV 分離株對(duì)哺乳動(dòng)物的致病力、橫向傳播以及耐藥性可能有增強(qiáng)的趨勢(shì)。

圖1 25 株分離株的8 個(gè)基因節(jié)段與參考序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Genetic evolution tree based on 8 gene fragments of 25 isolates and reference sequences

總之，近3年山東周邊地區(qū)流行的H9N2 AIV是由不同進(jìn)化方式而來(lái)；8 個(gè)基因節(jié)段關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)均發(fā)生了不同程度的變異，說(shuō)明H9N2 AIV 在不斷發(fā)生變異。因此，持續(xù)對(duì)山東周邊H9N2 AIV分離鑒定和遺傳進(jìn)化分析，對(duì)我國(guó)家禽養(yǎng)殖、疫病防控以及公共衛(wèi)生等方面均具有十分重要的意義。