劉張紅程錦國(guó)林文博武亞丹

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院 浙江,溫州 325000 2.浙江省中山醫(yī)院3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬泰州中醫(yī)院

腎間質(zhì)纖維化影響慢性腎臟疾病的進(jìn)程，導(dǎo)致不可逆的腎功能損傷，慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）患者的預(yù)后取決于腎間質(zhì)纖維化的程度[1-2]。過(guò)量的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的沉積以及成纖維細(xì)胞的增生是腎間質(zhì)纖維化的主要發(fā)病機(jī)制，眾多細(xì)胞因子及信號(hào)通路參與了腎間質(zhì)纖維化的病理過(guò)程，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）[3]、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）[4]、核轉(zhuǎn)錄因子及Smad通路[3]、Wnt信號(hào)通路[5]在其中起著重要作用。

CKD發(fā)病率逐年增加，目前西醫(yī)對(duì)CKD的治療主要是針對(duì)基礎(chǔ)疾病及并發(fā)癥的治療，以延緩疾病進(jìn)展。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（angiotensinⅡ receptor antagonist/angiotensinⅡ receptor blocker，ARB）是目前公認(rèn)的具有腎臟保護(hù)作用的藥物，被廣泛應(yīng)用于CKD的治療，但ACEI或ARB的臨床應(yīng)用存在局限性，對(duì)于不伴高血壓的CKD患者和伴腎動(dòng)脈狹窄的患者，ACEI或ARB類(lèi)藥物需慎用。研究證實(shí)，近年來(lái)中醫(yī)藥治療CKD取得了較好療效[6-8]。腎病Ⅰ號(hào)方是浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院程錦國(guó)教授總結(jié)長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)研制出的抗腎間質(zhì)纖維化基本方，具有較好的臨床療效[9-11]。前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，腎?、裉?hào)方能下調(diào)白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）基因的表達(dá)，減少系膜細(xì)胞的增殖和纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）的分泌，抑制腎間質(zhì)纖維化[10]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，腎?、裉?hào)方可以通過(guò)下調(diào)腎小管上皮細(xì)胞中Wnt4和β-catenin蛋白的表達(dá)，保護(hù)腎小管，減少ECM沉積，起到抗腎間質(zhì)纖維化的作用[11]。本研究以腎間質(zhì)纖維化大鼠模型為對(duì)象，觀察腎?、裉?hào)方對(duì)大鼠腎功能、腎間質(zhì)纖維化和TGF-β1、CTGF表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002]。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009]，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南，分組分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（20±2）℃，相對(duì)濕度為（50±5）%。

1.2 藥物與試劑 腎?、裉?hào)方（柴胡、黃芩、半夏、白芍、土茯苓、半枝蓮、菝葜、漏蘆等）煎劑，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠炮制中心提供，將藥物加水浸泡1h，水煎2次，每次50min，取汁混合后濃縮成生藥含量3g·mL-1的水煎劑；鹽酸貝那普利片購(gòu)于北京諾華制藥有限公司（規(guī)格：10mg/片；批號(hào)：X2342）；抗 TGF-β1抗體和抗CTGF抗體購(gòu)于Abcam公司（批號(hào)：ab5694、ab5097）；Masson染色試劑盒為北京索萊寶生物科技公司產(chǎn)品（批號(hào)：G1345）：DAB顯色試劑盒、超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋公司（批號(hào)：ZLI-9019、PV-6001）。BX51 光學(xué)顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品；微量移液器購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 造模與分組 72只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、貝那普利組和腎?、裉?hào)方組，每組18只。模型組、貝那普利組、腎?、裉?hào)方組大鼠采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)造成單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO），從而建立腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型。大鼠右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)，剪除左側(cè)腹部被毛，以10%水合氯醛3.5mg/kg腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒，從背部距左側(cè)肋脊角1.5cm處行長(zhǎng)約1.2cm的斜向切口，逐層剪開(kāi)皮膚、肌肉，開(kāi)腹后暴露左側(cè)腎臟，游離左輸尿管，在輸尿管上1/3處以3-0絲線雙重結(jié)扎左側(cè)輸尿管，然后逐層縫合。假手術(shù)組開(kāi)腹后只分離左側(cè)輸尿管，但不結(jié)扎，其余操作同其他3組。所有大鼠均造模成功，無(wú)失敗或死亡。

1.4 給藥 術(shù)后第2天開(kāi)始灌胃給藥，每日早晚各1次，共3周。假手術(shù)組和模型組以0.9%氯化鈉溶液10mL/kg灌胃，貝那普利組以0.08mg·mL-1貝那普利溶液0.8mg/kg灌胃，劑量參考文獻(xiàn)[11]；腎病Ⅰ號(hào)方組以3g·mL-1腎?、裉?hào)方水煎劑30g/kg灌胃，劑量參考文獻(xiàn)[12]，為60kg體重正常成人每日生藥劑量的10倍。

1.5 標(biāo)本采集 術(shù)后第7、14、21天，各組分別隨機(jī)選取6只大鼠，以10%水合氯醛3.5mg/kg腹腔注射麻醉后從腹主動(dòng)脈采血，3 000r/min離心10min分離血清，使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。并摘取左腎，剝除包膜，留取腎組織，以4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片。

1.6 指標(biāo)觀察

1.6.1 腎間質(zhì)纖維化程度觀察 各組腎組織石蠟切片行常規(guī)Masson染色，光鏡下觀察腎小管間質(zhì)的病理變化情況。200倍光鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)非重疊視野，避開(kāi)腎小球和大血管，測(cè)量每個(gè)視野中陽(yáng)性染色的面積，取其平均值，根據(jù)其所占整個(gè)視野面積的百分比評(píng)定腎間質(zhì)纖維化指數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)如下：纖維化陽(yáng)性面積＜2%計(jì)0分；纖維化陽(yáng)性面積2%～10%計(jì)1分；纖維化陽(yáng)性面積11%～20%計(jì)2分；纖維化陽(yáng)性面積21%～30%計(jì)3分；纖維化陽(yáng)性面積＞30%計(jì)4分。使用Image Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行圖像面積分析。

1.6.2 腎間質(zhì)纖維化相關(guān)因子蛋白表達(dá)檢測(cè) 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，加入3%H2O2室溫靜置10min后高壓熱修復(fù)，山羊血清封閉液室溫封閉20min，然后滴加抗 TGF-β1一抗（稀釋倍數(shù) 1：200）和抗 CTGF 一抗（稀釋倍數(shù)1：300），4℃過(guò)夜。根據(jù)超敏二步法免疫組化檢測(cè)說(shuō)明滴加二抗，室溫靜置15min。DAB顯色、水洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。每張切片隨機(jī)選取6個(gè)非重疊視野，注意避開(kāi)邊緣，使用Image Pro Plus圖像分析軟件計(jì)算累積光密度（integrated optical density，IOD），取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法；方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能比較 各組間比較，大鼠Scr和BUN水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）。與假手術(shù)組比較，其余3組大鼠Scr和BUN水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。與模型組比較，貝那普利組和腎病Ⅰ號(hào)方組大鼠血清 Scr和BUN水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），而貝那普利組和腎?、裉?hào)方組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見(jiàn)表 1。

2.2 各組大鼠腎間質(zhì)纖維化指數(shù)比較 Masson染色提示，假手術(shù)組僅微量膠原組織染成藍(lán)色；模型組腎組織藍(lán)染膠原組織較多，且隨著時(shí)間推移，藍(lán)染面積增大，腎間質(zhì)纖維化指數(shù)增加，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），提示腎間質(zhì)纖維化呈進(jìn)行性加重。而貝那普利組和腎?、裉?hào)方組腎組織藍(lán)染膠原組織所占面積介于模型組和假手術(shù)組之間。與模型組比較，貝那普利組和腎?、裉?hào)方組腎間質(zhì)纖維化指數(shù)顯著降低（P＜0．05），而貝那普利組和腎?、裉?hào)方組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見(jiàn)表 2、圖 1。

表1 各組大鼠腎功能比較Tab.1 Comparison of renal function in each group

2.3 各組大鼠腎組織TGF-β1和CTGF表達(dá)比較

2.3.1 各組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)比較 假手術(shù)組大鼠腎組織可見(jiàn)微量TGF-β1表達(dá)，其余3組TGF-β1表達(dá)增強(qiáng)，其中貝那普利組和腎病Ⅰ號(hào)方組表達(dá)弱于模型組。與相同時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組比較，其余3組大鼠腎組織 TGF-β1表達(dá)均明顯增高（P＜0．05）；與相同時(shí)點(diǎn)模型組比較，貝那普利組和腎?、裉?hào)方組TGF-β1表達(dá)減低（P＜0．05）。貝那普利組和腎?、裉?hào)方組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見(jiàn)表 3、圖 2。

表2 各組大鼠腎間質(zhì)纖維化指數(shù)比較（分）Tab.2 Comparison of renal interstitial fibrosis index in each group(scores)

圖1 各組大鼠腎間質(zhì)纖維化情況比較（Masson染色，200×）Fig．1 Comparison of renal interstitial fibrosis in each group(Masson stain,200×)

2.3.2 各組大鼠腎組織CTGF表達(dá)比較 假手術(shù)組大鼠腎組織可見(jiàn)微量CTGF表達(dá)，其余3組CTGF表達(dá)增強(qiáng)，其中貝那普利組和腎?、裉?hào)方組表達(dá)弱于模型組。與相同時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組比較，其余3組大鼠腎組織 CTGF 表達(dá)均明顯增高（P＜0．05）；與相同時(shí)點(diǎn)模型組比較，貝那普利組和腎?、裉?hào)方組CTGF表達(dá)減低（P＜0．05）；貝那普利組和腎?、裉?hào)方組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見(jiàn)表 4、圖 3。

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病進(jìn)展到終末期的關(guān)鍵性進(jìn)程，亦是CKD共同的病理生理特點(diǎn)，主要表現(xiàn)為系膜細(xì)胞過(guò)度增生，ECM沉積增多及成纖維細(xì)胞的異常增生，腎臟組織結(jié)構(gòu)破壞和功能喪失。多種細(xì)胞因子及信號(hào)通路參與了腎間質(zhì)纖維化過(guò)程，其中TGF-β1和CTGF在纖維化反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TGF-β1一直被認(rèn)為是促腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵因子之一，通過(guò)激活其下游的Smad信號(hào)通路，誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生，腎間質(zhì)纖維化發(fā)生和進(jìn)展的全部過(guò)程都有 TGF-β1的參與[13]。研究證實(shí)，TGF-β1是腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過(guò)程中的主要誘導(dǎo)因子[3]，抑制 TGF-β1的表達(dá)能夠延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展[14]。CTGF是基質(zhì)細(xì)胞蛋白家族成員，是腎小球和腎小管間質(zhì)纖維化過(guò)程中的重要細(xì)胞因子，通過(guò)促進(jìn)成纖維細(xì)胞的分裂增殖、膠原的沉積等方式促進(jìn)纖維化的發(fā)生發(fā)展[15]，與TGF-β1協(xié)同促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化[16]。研究發(fā)現(xiàn)，CTGF是TGF-β1的下游信號(hào)分子，具有促纖維化作用[17]。TGF-β1可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、系膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞中的CTGF表達(dá)，CTGF又可介導(dǎo)TGF-β1對(duì)腎間質(zhì)細(xì)胞的作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖以及ECM的合成和沉積[18]。

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)比較Tab.3 Comparison of TGF-β1expression in renal tissue in each group

圖2 各組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)水平比較（200×）Fig．2 Comparison of TGF-β1expression in renal tissue in each group(200×)

表4 各組大鼠腎組織CTGF表達(dá)比較Tab.4 Comparison of CTGF expression in renal tissue in each group

圖3 各組大鼠腎組織CTGF表達(dá)水平比較（200×）Fig．3 Comparison of CTGF expression in renal tissue in each group(200×)

CKD病程中腎素-血管緊張素系統(tǒng)活化，參與了腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。阻斷或抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性目前已經(jīng)成為延緩腎臟疾病進(jìn)展的重要手段。ACEI或ARB可以抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性，通過(guò)降壓及非降壓作用阻斷腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。貝那普利作為ARB的一種，是目前臨床常用的腎臟保護(hù)藥物，它可以通過(guò)抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，阻止血管緊張素Ⅱ生成，阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)活化，從而實(shí)現(xiàn)腎臟保護(hù)作用。但ACEI和ARB不能阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)的所有通路，對(duì)腎功能的保護(hù)作用有限，而且對(duì)于不伴高血壓、4期以后的CKD患者，以及伴有腎動(dòng)脈狹窄的患者，ACEI和ARB類(lèi)藥物屬于禁用或慎用范圍，其臨床應(yīng)用具有一定的局限性。此外ACEI和ARB類(lèi)藥物還存在諸多的不良反應(yīng)，最常見(jiàn)的為頑固性干咳、過(guò)敏、胃腸道反應(yīng)等，也影響了患者的治療依從性。

腎?、裉?hào)方是程錦國(guó)教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，多年的臨床實(shí)踐證實(shí)其在治療CKD方面有較好的療效。程錦國(guó)教授認(rèn)為CKD長(zhǎng)期遷延不愈，其病機(jī)主要是三焦樞機(jī)不利，濕熱、瘀血、毒邪壅滯三焦。腎病Ⅰ號(hào)方則是根據(jù)此病機(jī)特點(diǎn)研制而成的，采用小柴胡湯作為基礎(chǔ)方，配以土茯苓、半枝蓮、菝葜、漏蘆等清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)的藥物，疏利三焦，使三焦樞機(jī)調(diào)暢。方中小柴胡湯調(diào)暢三焦，土茯苓、半枝蓮清熱除濕解毒，菝葜解毒化瘀，漏蘆清熱解毒?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，小柴胡湯能夠調(diào)節(jié)慢性腎炎患者機(jī)體免疫功能，從而改善炎癥[19]。黃芩的主要成分黃芩苷能通過(guò)抑制Notch1信號(hào)通路抑制TGF-β1的表達(dá)，減輕腎間質(zhì)纖維化[20]。土茯苓的主要有效成分土茯苓總黃酮能通過(guò)下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，改善腎功能并減輕腎間質(zhì)纖維化[21]。漏蘆能抑制腎TGF-β1和CTGF的表達(dá)，從而保護(hù)腎功能[22]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腎病Ⅰ號(hào)方具有抗腎間質(zhì)纖維化作用[9-11]，能夠抑制大鼠系膜細(xì)胞增殖和FN的分泌，下調(diào)IL-6和CTGF的mRNA表達(dá)，減少腎小球系膜細(xì)胞Ⅳ型膠原的分泌，下調(diào)腎小管上皮細(xì)胞中Wnt4和β-catenin蛋白的表達(dá)，減少ECM沉積，保護(hù)腎小管。本研究建立了腎間質(zhì)纖維化大鼠模型，予腎?、裉?hào)方水煎劑或貝那普利干預(yù)治療，研究結(jié)果表明，腎病Ⅰ號(hào)方在一定程度上確實(shí)能夠改善大鼠腎間質(zhì)纖維化，腎?、裉?hào)方組和貝那普利組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的腎功能指標(biāo)、腎間質(zhì)纖維化指數(shù)低于模型組，TGF-β1和CTGF表達(dá)也明顯降低。與貝那普利組比較，腎?、裉?hào)方組各時(shí)點(diǎn)腎功能指標(biāo)和腎間質(zhì)纖維化指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TGF-β1和CTGF表達(dá)差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明腎?、裉?hào)方的作用與貝那普利相當(dāng)。由此筆者推測(cè)，腎病Ⅰ號(hào)方能通過(guò)抑制TGF-β1及其下游信號(hào)分子CTGF的表達(dá)，減輕腎小管上皮細(xì)胞EMT，在一定程度上發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化作用，從而延緩CKD的疾病進(jìn)程。

綜上所述，本研究證實(shí)腎?、裉?hào)方具有較好的抗腎間質(zhì)纖維化作用，作用與貝那普利相當(dāng)，其作用機(jī)制可能與下調(diào)TGF-β1和CTGF在腎組織中的表達(dá)有關(guān)，但更詳細(xì)的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究加以證實(shí)。