不同性別PyMT自發(fā)性乳腺癌小鼠成瘤特點和不同時間肺轉(zhuǎn)移觀察

郎佳麗金璐邵霞曹貝貝嚴(yán)楷蕾傅惠英壽旗揚(yáng)

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 3.湖州市中心醫(yī)院

在女性癌癥發(fā)病率中，乳腺癌的發(fā)病率是首屈一指的[1]。雖然治愈率較高，但仍是重要的致死因素。因此如何進(jìn)一步研究乳腺癌靶向藥物、藥物作用的機(jī)理及相應(yīng)的臨床治療手段日益受到廣泛重視[2]。在研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)特征、藥物及治療方法中，乳腺癌動物模型功不可沒。在生物學(xué)、病理學(xué)和組織學(xué)上越貼近人乳腺癌指標(biāo)的動物模型，提供的實驗結(jié)果越是客觀準(zhǔn)確[3-4]，其應(yīng)用范圍就越廣泛[5]。

目前已建立了多種乳腺癌模型，如誘發(fā)性、移植性、自發(fā)性以及乳腺癌轉(zhuǎn)基因?qū)嶒瀯游锬Ｐ蚚6]。但誘發(fā)性和移植性乳腺癌模型在實驗過程中具有明顯的缺點：誘導(dǎo)乳腺腫瘤模型其乳腺癌性質(zhì)和發(fā)病程度受脂肪消耗的影響，同時存在建模耗時長、癌癥發(fā)生率不高及轉(zhuǎn)移性低等多種弊端[7-9]。相比之下，以小鼠乳腺腫瘤病毒啟動子（mouse mammary tumor virus,MMTV）控制下表達(dá)多瘤中間T抗原（polyoma middle T-antigen,PyMT）的轉(zhuǎn)基因自發(fā)性乳腺癌小鼠具有與人體腫瘤病理相似、試驗周期短、癌癥自發(fā)率良好、成瘤時間短和試驗現(xiàn)象明顯[10-12]等客觀優(yōu)點而被選為研究乳腺癌的經(jīng)典模型。故本實驗采用MMTV-PyMT乳腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象來觀察在完整生命周期內(nèi)不同性別、不同周齡下的癌癥發(fā)展過程與病理變化指標(biāo)，以研究該模型的客觀規(guī)律，為乳腺癌藥物篩選及治療方法更新提供研究思路。

1 材料

1.1 實驗動物 MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson實驗室，品系名為FVB/N-Tg(MMTV-Py VT)634Mul/J。保種培育后，選取SPF級雌性PyMT小鼠10只，雄性PyMT小鼠5只，雌性FVB小鼠5只，共20只（15雌，5雄），均為8周齡，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心屏障實驗室[（浙）2013-0184]；環(huán)境溫度：（22±1）℃；相對濕度 50%～60%；光照 12小時明暗交替；噪音：＜50dB；小鼠飼養(yǎng)于IVC中，自由飲食；在實驗過程中遵循3R原則給予實驗動物人道主義關(guān)懷。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 主要儀器 Bayer2120全自動血液細(xì)胞分析儀（德國西門子公司），PCR儀（美國Bio-Rad伯樂），Tanon-2500全自動數(shù)碼凝膠圖像分析儀（上海天能科技有限公司），ASP200S全自動脫水機(jī)、半自動切片機(jī)（德國Leica公司），AP280-2包埋機(jī)（德國MICROM公司），NanoZoomer 2．0 RS數(shù)字切片掃描儀（日本濱松光子公司）。

1.2.2 主要試劑 Taq 酶、dNTP Mixture、MgCl2、5×buffer、DNA marker、6×loading buffer等均購自 Takara公司，Biowest瓊脂糖粉購自北京艾普立邦科技有限公司，Gelreg凝膠核酸染料購自美國BIOTIUM公司。

1.3 方法

1.3.1 保種及擴(kuò)群 從Jackson實驗室購買的乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因雄性小鼠即轉(zhuǎn)基因PyMT小鼠(+)與正常雌性小鼠FVB(-)合籠配種，通常1：2比例雜交。子代剪尾提取DNA，提取小鼠DNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列分別為：5'-CAA ATG TTG CTT GTC TGG TG-3'：5'-gTC AGTCGA GTG CAC AGT TT-3'：5'-GGA AGC AAG TACTTC ACA AGG g-3'：5'-GGA AAG TCA CTA GGAGCA GGG-3'。反應(yīng)條件為：94℃變性 2min；94℃ 20s,64℃ 1min,72℃ 1min,35個循環(huán)；72℃ 2min充分延伸，擴(kuò)增產(chǎn)物為556bp?；蛐丸b定后，選取雄性PyMT小鼠與雌性FVB小鼠全同胞兄妹交配，進(jìn)行擴(kuò)群，繼續(xù)通過以上鑒定方法篩選實驗小鼠。

1.3.2 一般觀察 每天觀察雄性與雌性PyMT小鼠的腫瘤是否長出，記錄腫瘤發(fā)病時間；每周記錄體重變化，并用小鼠游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，觀察腫瘤生長趨勢、特征的變化。瘤體積計算：V=（長徑×短徑2）/2。

1.3.3 雄性與雌性小鼠生存率及生存時間比較 每天觀察雄性與雌性PyMT小鼠的精神狀態(tài)與腫瘤生長情況，且觀察是否有死亡情況并記錄其自然死亡時間。

1.3.4 血常規(guī)檢測 觀察雌性MMTV-PyMT小鼠腫瘤生長8周后，利用CO2實行安樂死。心臟取適量血液于2ml抗凝管中，血常規(guī)檢測42項指標(biāo)，對其中以下7項指標(biāo)進(jìn)行比較：白細(xì)胞（white blood cell,WBC）、淋巴細(xì)胞（lymphcyte,LYMPH）、嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophils,EOS）、嗜堿性粒細(xì)胞（basophil granule,BASO）、中性粒細(xì)胞（granulocyte,NUET）、單核細(xì)胞（monocyte,MONO）和未染色大細(xì)胞（large unstained cell,LUC）數(shù)量。

1.3.5 病理檢測 PyMT雌性小鼠與FVB雌性小鼠分別觀察4周、8周后，取完整肺觀察拍照，保存于10%甲醛溶液中，過夜固定，48h后取材，進(jìn)行常規(guī)的脫水包埋后，用石蠟切片機(jī)將蠟塊切成4μm的薄片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，用NanoZoomer數(shù)字切片掃描儀對切片進(jìn)行成像掃描，并用NDP．view軟件分析其病理變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±standard errors of mean,SEM)表示，用 SPSS 22．0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩樣本間采用t檢驗，以P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0．001表示差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定圖 經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增后，加入 2μL 6×loading buffer，混勻，上樣 10μL 于1．5%瓊脂糖凝膠上樣孔中，電泳30min后，結(jié)果如圖1中所示，MMTV-PyMT陽性小鼠基因檢測條帶為556bp，由此推斷樣本2、4和9均為MMTV-PyMT陽性小鼠，樣本 1、3、4、5、6、7、8 和 10 無條帶，為MMTVPyMT陰性小鼠即FVB小鼠。

2.2 雌性與雄性鼠腫瘤生長趨勢比較 如圖2B、2D中所示，乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠無論雌雄均會自發(fā)性出現(xiàn)腫瘤。雌性小鼠組在第8周出現(xiàn)可捫及的腫瘤，雄性組則在第18周出現(xiàn)可捫及的腫瘤，雌性小鼠出現(xiàn)腫瘤時間遠(yuǎn)早于雄性小鼠，且雌性小鼠模型組腫瘤發(fā)展速度較雄性鼠快。隨著時間的推移，腫瘤的體積逐漸增大，數(shù)目增多。如圖2A、2C所示，兩組體重均呈現(xiàn)穩(wěn)定增長的趨勢。

圖1 MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定圖Fig．1 Genotypic identification of MMTV-PyMT mice

圖2 乳腺癌MMTV-PyMT小鼠腫瘤生長情況與體重變化Fig．2 Changes of tumor growth and body weight of MMTV-PyMT mice

2.3 雌性與雄性鼠生存率及生存時間比較 如圖3所示，在觀察雄性與雌性小鼠生存率和生存時間的實驗中，雌鼠最早死亡發(fā)生在16周，于第20周全部死亡，而雄鼠組最早死亡發(fā)生在38周，于第46周全部死亡。

2.4 雌性MMTV-PyMT與FVB小鼠血常規(guī)指標(biāo)比較 在雌性MMTV-PyMT與FVB小鼠血常規(guī)指標(biāo)比較中，如圖4A中所示，雌性PyMT的 WBC數(shù)量明顯高于FVB小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．001）。白細(xì)胞分類中，如圖4B、4C、4F、4G中所示，PyMT小鼠的 NUET、LYMPH、BASO及 LUC數(shù)量均明顯高于FVB 小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．001）。如圖 4E、4D中所示，PyMT小鼠的EOS也顯著高于FVB小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），而 PyMT 小鼠的 MONO 數(shù)量高于FVB小鼠，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。

圖3 雌性與雄性鼠生存時間比較Fig．3 Comparison of survival time between female and male mice

圖4 雌性MMTV-PyMT與FVB小鼠血常規(guī)指標(biāo)比較Fig．4 Comparison of blood routine indexes between MMTV-PyMT and FVB of female mice

2.5 腫瘤肺轉(zhuǎn)移情況 如圖5所示，F(xiàn)VB小鼠肺部表面平整邊緣光滑，顏色淡紅色無異常充血；PyMT小鼠16周時肺部表面出現(xiàn)若干卵石狀分布且充血暗紅的瘤體，說明該小鼠肺部出現(xiàn)嚴(yán)重的腫瘤轉(zhuǎn)移。

如圖6所示，肺HE染色結(jié)果顯示PyMT小鼠12周齡時肺泡結(jié)構(gòu)部分被破壞，肺組織中大量炎癥細(xì)胞浸潤，氣管璧增厚，某些小鼠開始出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。PyMT小鼠16周齡時肺組織出現(xiàn)嚴(yán)重的肺轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)彌漫性分布，大小不等、質(zhì)實、染色深的癌巢，呈非典型增生，導(dǎo)管受壓變窄，細(xì)胞間推擠或重疊，細(xì)胞大小形態(tài)不同，偶爾可見核分裂現(xiàn)象；腫瘤細(xì)胞排列紊亂，失去正常的結(jié)構(gòu)和層次，胞核增大，核分裂增多。

3 討論

在小鼠乳腺癌病毒（mouse mammary tumor virus,MMTV）的轉(zhuǎn)錄控制下，特異性表達(dá)活化的neu酪氨酸激酶長鏈重復(fù)（long terminal repeat,LTR），形成于整個乳腺上皮細(xì)胞有關(guān)的腺癌[15]。影響neu酪氨酸激酶活性的另一因素是多瘤病毒（polyoma virus,PyV）中的T抗原。新生小鼠感染PyV會導(dǎo)致大量上皮細(xì)胞和間質(zhì)腫瘤的形成，其中乳腺癌占據(jù)相當(dāng)大比例。將上述兩個基因融合整合到小鼠的基因組中，即為乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠的建立[16]。乳腺上皮中PyMT中T癌基因轉(zhuǎn)化特性的分析提供了對惡性進(jìn)展過程的重要啟示。在四種獨立的MMTV/中T轉(zhuǎn)基因小鼠中，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)最終導(dǎo)致了乳腺上皮的形態(tài)轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步證實了乳腺中T抗原的潛在致癌潛力。

圖5 乳腺癌MMTV-PyMT小鼠肺部觀察（100×）Fig．5 Observation of lung tissue in MMTV-PyMT mice(100×)

圖6 乳腺癌MMTV-PyMT小鼠肺組織HE染色圖（100×）Fig．6 HE staining of lung tissue in MMTV-PyMT mice（100×）

本實驗在乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠完整生命期中，系統(tǒng)地觀察記錄腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。雌性PyMT小鼠約在第8周開始出現(xiàn)可測量的腫瘤，隨著小鼠周齡的增加，小鼠體重逐漸增大，同時小鼠的瘤數(shù)目與瘤體積同樣呈現(xiàn)出上升的趨勢，且實驗結(jié)果顯示15周時瘤鼠開始出現(xiàn)死亡，到20周小鼠全部死亡。而雄性鼠約在第18周開始出現(xiàn)可測量的腫瘤，比雌性鼠發(fā)病時間晚，生存時間長，導(dǎo)致實驗周期長，因此較雄性PyMT小鼠而言，雌性PyMT小鼠是研究乳腺癌發(fā)展及轉(zhuǎn)移良好的動物模型。

白細(xì)胞分為顆粒細(xì)胞與無顆粒細(xì)胞，顆粒細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞及嗜堿性細(xì)胞，無顆粒細(xì)胞包括單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞。中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的主要驅(qū)動者。中性粒細(xì)胞除了釋放細(xì)胞因子和趨化因子，還能促進(jìn)腫瘤生長和侵襲[17]。已有文獻(xiàn)證明乳腺癌組織中有嗜酸性粒細(xì)胞浸潤[18]。單核細(xì)胞釋放到組織中成為巨噬細(xì)胞，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可使腫瘤細(xì)胞免受CD8+細(xì)胞殺傷[19]、維持免疫抑制微環(huán)境[20]、減少抗原遞呈和阻礙T細(xì)胞增殖[21]。淋巴細(xì)胞可識別腫瘤細(xì)胞表面抗原，其數(shù)量的增加或與腫瘤細(xì)胞入侵有關(guān)。本實驗血常規(guī)檢測中發(fā)現(xiàn)，雌性PyMT小鼠白細(xì)胞及亞群（除單核外）數(shù)量均明顯高于FVB小鼠，產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能是腫瘤感染或者是腫瘤細(xì)胞不可控地分泌一些激素或者因子，促進(jìn)白細(xì)胞的生成或抑制其凋亡等，但越來越多的實驗結(jié)果證實炎癥促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移，腫瘤微環(huán)境可趨化募集巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞以及白細(xì)胞等[22-23]。

雌性PyMT小鼠12周齡及16周齡肺部病理切片也顯示在腫瘤細(xì)胞侵襲肺部時會募集大量的炎癥細(xì)胞浸潤肺部組織，其中雌鼠12周時腫瘤細(xì)胞入侵肺部，而16周時已檢測到發(fā)生明顯的肺轉(zhuǎn)移，有文獻(xiàn)報道11周左右開始出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移瘤，已有多篇文章報道此種自發(fā)性乳腺癌出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[24-25]，與本實驗結(jié)果一致。

綜上所述，雖然乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病機(jī)制與人體的發(fā)病機(jī)制有所不同，但其自然的發(fā)病過程與人體相似，可從動物、細(xì)胞、分子等不同層面了解乳腺癌，是篩選抑制腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移等藥物良好的乳腺癌模型。在多方面可為臨床研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)理提供思路，同時在預(yù)防、治療乳腺癌疾病上有一定參考意義。本研究與其他文獻(xiàn)不同之處在于從乳腺癌模型實驗動物性別選擇的角度出發(fā)，乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因雌性小鼠相較于雄性小鼠發(fā)病早、轉(zhuǎn)移快、生存周期短，有利于節(jié)省實驗時間及物資，大力度篩選高效抗腫瘤藥物，同時也減少了乳腺癌自發(fā)性模型腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、死亡等關(guān)鍵時間點的偏差。此外，乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因雌性小鼠和普通FVB小鼠比較，血液中白細(xì)胞總數(shù)及白細(xì)胞各個不同分類細(xì)胞數(shù)量均有上升，說明腫瘤與炎癥反應(yīng)密不可分；比較乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因雌性小鼠12周齡及16周齡肺部病理結(jié)果，也可以觀察到在腫瘤細(xì)胞侵襲肺部組織時產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，為該模型腫瘤發(fā)生及肺轉(zhuǎn)移觀察提供參考。