王彩霞

影響禽流感抗體水平測定的因素分析

王彩霞

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院 山東 濰坊 261061）

禽流感抗體水平測定在臨床實際工作中應用廣泛，結(jié)果判定快速，操作方法簡單實用，利用病毒的血凝抑制試驗來進行檢測。因為很多因素的影響，使得試驗結(jié)果不準確，無法指導生產(chǎn)，因此在實際操作中有可能出現(xiàn)的誤差進行分析，以達到測定的結(jié)果準確。

1 病毒的血凝抑制試驗

1.1 禽流感病毒具有血凝性 能凝集雞、鴨、鵝、馬屬動物及羊的紅細胞，對熱比較敏感，對低溫抵抗力較強，此病毒的血凝性不穩(wěn)定，可被特異的抗血清所抑制，臨床實踐用血凝抑制試驗來進行抗體水平測定。

1.2 試驗方法 根據(jù)《高致病性禽流感診斷技術(shù)》GB/TI8936-2003的操作方法進行檢測，在操作時必須注意每一步、每一個細節(jié)。

2 多種因素對抗體水平測定的影響

2.1 4單位病毒配制的準確性的影響 根據(jù)病毒的血凝價配制4單位病毒時，病毒的血凝價必須準確，做到現(xiàn)用現(xiàn)配，在抗體測定前必須做回歸試驗?；貧w試驗見附表。

附表 回歸試驗 (μl)

孔號12345 生理鹽水2525252525 4單位病毒2525252525 1%雞紅細胞2525252525 結(jié)果完全凝集完全凝集完全不凝集完全不凝集完全不凝集

第一步：用微量移液器在微量血凝板上于第1孔至第5孔中分別加入生理鹽水25μl，第二步：換吸頭吸取4單位病毒25μl加入第1孔中吹打混勻后，吸取25μl于第2孔吹打混勻后，依次倍比稀釋至第4孔，吸取25μl棄去，第三步：換吸頭于第1孔至第5孔中分別加入生理鹽水25μl，第四步:換吸頭于第1孔至第5孔中分別加入1%紅細胞懸液25μl，第5孔為生理鹽水對照。結(jié)果判定為第5孔為完全不凝集，第1、2孔完全凝集，第3、4孔完全不凝集，此結(jié)果判定4單位病毒配制正確。

2.2 抗原的影響 抗原溶解分裝后置于-20℃冷凍保存，盡量減少反復凍融次數(shù)，分批使用，加4單位病毒時必須邊加邊混勻。

2.3 稀釋液的影響 根據(jù)《高致病性禽流感診斷技術(shù)》GB/TI8936-2003進行PBS配制，pH為7.0時,紅細胞沉降效果最佳。

2.4 被檢血清的影響 被檢血清必須是淡黃色液體，無污染、無雜質(zhì)、無腐敗變性、無溶血、無膠凍樣的物質(zhì)。

2.5 1%紅細胞懸液的影響 （1）離心時間與轉(zhuǎn)速的影響：根據(jù)《高致病性禽流感診斷技術(shù)》GB/TI8936-2003進行紅細胞離心，現(xiàn)用現(xiàn)配，離心時間過長，轉(zhuǎn)速過快導致紅細胞破裂，引起溶血。（2）紅細胞配制時的影響：紅細胞離心后粘稠度高，最好采用微量移液器的反向移液法配制，可確保紅細胞的量否則會出現(xiàn)跳孔,影響試驗結(jié)果。（3）紅細胞濃度的影響：濃度過高，沉降點過大，血凝抑制價上升，過低，沉降點過小，血凝抑制價下降，同一批次的血清樣品不能更換紅細胞，邊加邊混勻。加入紅細胞時,應從最后一孔加起,滴頭避免接觸孔內(nèi)液體,以免影響結(jié)果,造成人為干擾。

2.6 其它因素的影響 （1）微量血凝板：用96孔V型板比U型板的實驗結(jié)果判定更準確。要適時更新，這樣避免與滴頭反復磨擦,發(fā)生判定偏差。（2）吸頭：一次性使用，應及時更換避免污染。（3）微量移液器：必須規(guī)范使用，速度不要過快，加樣時必須懸滴。稀釋樣品時不能產(chǎn)生氣泡，吸頭不要緊貼孔底，注意慢吸快打，吸頭內(nèi)不留液體。（4）振蕩器：通過振蕩器振蕩可以加快抗原抗體反應,工作平穩(wěn)勻速，時間不要太長或強度不要太大，否則會導致紅細胞破裂。（5）實驗室環(huán)境溫度對結(jié)果的影響：必須控制在20~ 25℃，靜置40min讀結(jié)果。溫度過高，時間過長，結(jié)果出現(xiàn)快，使整板無凝集現(xiàn)象，使得結(jié)果誤判。（6）加樣：加入PBS、4單位病毒和紅細胞時，有時不注意把微量移液器吸頭插人較深，留在管嘴外的液體也滴入孔內(nèi)吸取量發(fā)生變化, 所以吸頭插入液面不可過深。待管嘴撤出液面后斜貼在試劑瓶的瓶壁上,淌走多余的液體防止形成液滴滴人血凝板孔中,一定要保證加量準確。同時避免吸頭與血凝板孔接觸，造成污染。

2.7 結(jié)果判定 依據(jù)國標每一批血清樣品用PBS和標準陽性血清作陰性和陽性對照,防止判定偏差。感作時間和結(jié)果判定要嚴格按照國標規(guī)定的要求,在PBS對照孔紅細胞呈明顯鈕扣狀沉淀到孔底時判定結(jié)果,并且陽性對照和陰性對照成立。

3 總結(jié)

在試驗過程中，每一步都按照操作規(guī)范認真操作，不要造成主觀因素的誤差影響，保證抗體效價的正確，根據(jù)滴度判定雞群免疫狀況、使用的疫苗種類、免疫方法、免后時間等,同時要注意判定是否野毒入侵，這樣使雞群保證在安全抗體水平,避免強毒感染對減少養(yǎng)殖業(yè)的損失有重要的指導意義。

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（2019–08–18）

S851.34

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1007-1733(2019)11-0050-02